Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.

Abstract

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo gram-positivo que é capaz de causar infecções invasivas graves em pacientes imunocomprometidos, idosos e gestantes. As manifestações mais comuns de listeriose em humanos incluem meningite, encefalite e aborto fetal. Uma sequência significativa, mas muito menos documentada de infecção invasiva de L. monocytogenes envolve o coração. A taxa de mortalidade por doença cardíaca pode ser de até 35% apesar do tratamento, porém muito pouco se sabe sobre a colonização de L. monocytogenes de tecido cardíaco e suas patologias resultantes. Além disso, tornou-se recentemente evidente que as subpopulações de L. monocytogenes têm uma capacidade aumentada de invadir e crescer dentro do tecido cardíaco. Este protocolo descreve em detalhes métodos in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o cardiotropismo de L. monocytogenes isolados. Métodos são apresentados para a infecção de míbios cardíacos de rato H9c2 na cultura tecidual, bem como para a determinação da colonização bacteriana dos corações dos camundongos infectados. Esses métodos são úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também podem facilitar a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão de células cardíacas e/ou promover alterações na patologia cardíaca. Esses métodos também preveem a comparação direta do cardiotropismo entre múltiplas cepas de L. monocytogenes.

Introduction

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular gram-positivo capaz de causar doenças graves em populações suscetíveis, incluindo idosos, gestantes, pessoas com HIV/AIDS e pessoas que recebem quimioterapia1. A infecção nessas populações é frequentemente resultado da ingestão de produtos alimentares contaminados, e a maioria das infecções estão associadas a surtos de alimentos em larga escala2,3. Em humanos e outros mamíferos, L. monocytogenes é capaz de translocar através da fronteira epitelial do intestino delgado, sendo posteriormente transportado para o fígado4,5. Modelos animais sugerem que as bactérias ingeridas se replicam dentro do villi intestinal e transitam para o fígado através da veia portal ou se espalham através dos linfonodos mesentéricos na corrente sanguínea, levando à disseminação hematógena no fígado e ao baço6,7. No fígado e no baço, a bactéria é capaz de mediar a absorção tanto em fagocitos profissionais quanto em células parenchímicas residentes, e rapidamente estabelece infecções dentro desses órgãos. À medida que a carga bacteriana aumenta, inúmeras bactérias são dispersas de volta ao sangue, onde são capazes de colonizar ainda mais tecidos suscetíveis, incluindo o sistema nervoso central e a placenta (onde estão presentes). A colonização desses locais impede manifestações mais comuns de listeriose em humanos, incluindo meningite, encefalite e aborto fetal2.

Subpopulações selecionadas de L. monocytogenes têm sido recentemente mostrados com uma capacidade aprimorada de invadir e replicar dentro do tecido cardíaco8. As manifestações de envolvimento cardíaco são variadas, e vão desde endocardite e pericárite, até miocardite fulminante completa com anormalidades de condução9-13. O número total de casos cardíacos de L. monocytogenes por ano é baixo, mas pode ser subestimado, pois essa faceta de infecção não é geralmente bem reconhecida. A colonização do coração por patógenos muitas vezes requer predisposições hospedeiras, como danos valvulares pré-existentes ou válvulas cardíacas artificiais. Há, no entanto, isolados de L. monocytogenes que foram identificados que são notáveis por sua capacidade de colonizar os corações dos animais infectados na ausência de qualquer dano cardíaco e/ou anormalidades8.

Aqui são descritos métodos in vitro e in vivo para avaliar a colonização bacteriana do tecido cardíaco dentro de animais infectados usando ensaios de invasão na cultura tecidual, bem como infecções animais vivos. Esses métodos têm se mostrado úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também devem ser úteis para a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão celular cardíaca e/ou resultar em alterações na patologia cardíaca. Esses métodos facilitam a comparação do cardiotropismo entre múltiplas cepas. Para os métodos aqui descritos, l. monocytogenes 10403S é usado como um representante bem estudado de uma cepa não cardiotrópica e o isolado clínico 07PF0776 é usado como um exemplo representativo de uma cepa cardiotrópica. Essas duas cepas foram escolhidas para fornecer uma comparação para a invasão bacteriana de células cardíacas in vitro e colonização de corações de camundongos infectados in vivo. O isolado 07PF0776 é um isolado clínico recuperado de um abscesso interventricular que causou uma arritmia fatal em um paciente HIV+8. L. os isolados de monocytogenes podem variar em seu potencial de virulência, e dada a propensão para listeria infectar pessoas com imunossupressão e gestantes, as pessoas dentro dessas populações devem ter cuidado ao avaliar diferentes isolados clínicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Condições de armazenamento e cultura para cepas de l. monocytogenes

  1. Prepare a mídia sólida autoclavando o ágar de infusão cérebro-coração (BHI) e despejando a mídia derretida em placas de petri. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente, depois durante a noite novamente a 37 °C.
  2. Usando um laço estéril, obtenha uma pequena amostra de L. monocytogenes de estoques congeladores previamente feitos (bactérias suspensas em 20% de glicerol em mídia líquida BHI, armazenadas a -80 °C) ou de uma placa de ágar contendo colônias previamente atingidas para isolamento.
  3. Usando técnica asséptica, listrar a amostra para o isolamento de uma única colônia. Certifique-se de esterilizar o laço entre as raias cruzadas para evitar o excesso de transporte e garantir o isolamento de colônias individuais da cepa que está sendo avaliada. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
  4. Usando um laço estéril, remova uma colônia do isolado e inoculado 2 ml de caldo BHI (sem ágar) em um tubo de poliestireno de 14 ml.
  5. Para ensaios e infecções, incubar a cultura do caldo estaticamente (sem tremer) durante a noite em uma incubadora de 37 °C. Para estocagem de isolados cultivados, incubar a cultura do caldo a 37 °C com agitação a 180-200 rpm durante a noite. As culturas podem ser estocadas adicionando glicerol a uma concentração final de 20% e armazenando tubos selados a -80 °C indefinidamente.

2. Condições de armazenamento e cultivo de células semelhantes a myoblast cardíaco H9c2

  1. Compre ou obtenha um estoque congelado de células H9c2, bem como o Médio de Águia Modificada (DMEM) da Dubelco contendo alta glicose e piruvato, soro bovino fetal (FBS), L-glutamina (Glutão) e uma mistura penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG).  FBS, Glut e PSG devem ser estocados a -20 °C, enquanto o DMEM pode ser armazenado a 4 °C. É útil alíquotar FBS em tubos cônicos de 50 ml antes de congelar.
  2. Em um capô de fluxo laminar, descongele duas alíquotas de FBS. Adicione uma alíquota a uma garrafa de 500 ml de DMEM, fazendo uma mistura de 10% de FBS/DMEM. Para isso, adicione 6 ml de Glut e estocar a solução resultante a 4 °C. Esta solução pode ser rotulada como "DMEM sem antibióticos". (DMEM –Ab)
  3. A uma segunda garrafa de 500 ml de DMEM, adicione as outras 50 ml de alíquota de FBS. Para esta solução, adicione 6 ml de PSG e estocar a 4 °C. Esta solução pode ser rotulada como "DMEM com antibióticos". (DMEM +Ab)
  4. Enquanto estiver no capô laminar, remova 10 ml de DMEM +Ab e coloque em um frasco de cultura de tecido de 25 ml.
  5. Deixando o frasco no capô laminar, remova uma alíquota congelada de células H9c2 do armazenamento em nitrogênio líquido e coloque rapidamente o tubo em um banho de água de 37 °C até que a cultura descongele.
  6. Pulverize o tubo com 70% de etanol para higienizar e volte para o capô. Trabalhando rapidamente para minimizar o tempo da célula em DMSO concentrado, adicione a alíquota completa das células aos 10 ml de DMEM +Ab.  Isso dilui o DMSO suficientemente para viabilidade e adesão celular durante a noite.
  7. Coloque o frasco em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C, 5% C02e 95% de umidade durante a noite.
  8. Na manhã seguinte, verifique a camada celular para garantir a adesão. As células provavelmente estarão entre 80-100% confluentes por esta altura.
  9. Na capa da cultura tecidual, remova a mídia contida dentro do frasco usando o vácuo, deixando apenas as células dentro do frasco.
  10. Adicione aproximadamente 2 ml de 0,25% Trypsin-EDTA às células e arrase suavemente por aproximadamente 3 segundos.
  11. Inverta o frasco de tal forma que a solução de trippsina não esteja mais em contato com a monocamadas, e remova a trippsina por vácuo.
  12. Adicione uma segunda alíquota de 2 ml de trippsina às células, e mova o frasco para um microscópio invertido. Observe as células enquanto balança suavemente o frasco para garantir que a monocamada se disperse.
  13. Uma vez que a monocamada esteja dispersa, retorne imediatamente ao capô da cultura tecidual e adicione 4 ml de DMEM +Ab à suspensão celular.
  14. Remova uma porção de 2 ml da suspensão celular e adicione-a a um frasco de cultura de tecido de 50 ml contendo 23 ml de DMEM +Ab. Arrase o frasco suavemente e coloque-o na incubadora de cultura tecidual nas condições listadas na etapa 2.5.
  15. Verifique as células diariamente até atingirem aproximadamente 80% de confluência (aproximadamente 2,0-4,0 x 105 células por ml). É muito importante que as células não se tornem muito confluentes, pois podem se diferenciar em mótubos musculares esqueléticos quando passam fome de FBS por períodos prolongados detempo 14 e essa diferenciação pode alterar a invasão bacteriana.  Monitore as células cuidadosamente e comece com um novo tubo de células se uma cultura se tornar confluente.
  16. Uma vez que as células atinjam 80% de confluência, elas podem ser passagemdas para outro frasco de 50 ml como apenas descrito, ou preparados para o ensaio de invasão.

3. Preparando células H9c2 para ensaio de invasão

  1. Na capa da cultura tecidual, remova a mídia de um frasco de 50 ml de células H9c2 que atingiram 80% de confluência usando aspiração a vácuo.
  2. Adicione 4 ml de solução Trypsin-EDTA de 0,25% à monocamada e remova imediatamente usando aspiração de vácuo.
  3. Adicione outra porção de 4 ml de 0,25% Trypsin-EDTA ao frasco e mova o frasco para um microscópio invertido para observar a dispersão da monocamada.
  4. Uma vez que as células tenham se dispersado, retorne ao capô e adicione 4 ml de DMEM –Ab às células. A pipetação da solução para cima e para baixo garante a remoção completa das células da parte inferior do frasco.
  5. Após a ressuspensão da monocamhadeira, remova toda a suspensão e coloque-a em um tubo cônico de 50 ml.
  6. Remova uma porção de 20 ul desta suspensão e conte o número de células por mililitro usando um hemótmetro.
  7. Uma vez determinada a concentração de células na solução, ajuste a concentração para 2,25 x 104 células/ml adicionando o volume apropriado de solução celular ao DMEM fresco –Ab. O volume total da solução ajustada deve ser de 25 ml.
  8. Enquanto estiver no capô, esterilize as tampas de vidro mergulhando-as em 90% de etanol e passando brevemente cada deslizamento através de uma chama. Adicione cada tampa a um poço individual de uma placa tratada de cultura de tecido de 24 poços logo após ser esterilizada.
  9. Depois de todos os poços ter uma mancha de cobertura individual, use um pipet de 25 ml para adicionar 1 ml da solução celular diluída a cada um dos poços da placa, e empurre cada tampa para baixo com uma agulha estéril.
  10. Verifique cada poço usando um microscópio invertido para garantir que quantidades semelhantes de células estejam em cada poço. Coloque a placa de 24 poços na incubadora de cultura tecidual durante a noite a 37 °C em 5% de CO2 e 95% de umidade.
  11. Na manhã seguinte, veja cada poço para garantir que as tampas tenham quantidades comparáveis de míbios aderentes e que as tampas não estejam flutuando no poço.

4. Preparando cepas de L. monocytogenes para ensaios de invasão

NOTA: Todo o trabalho laboratorial é realizado de acordo com as diretrizes do CDC Biosafety Nível 2.

  1. Depois de preparar a placa de 24 poços para ensaio, use um laço esterilizado para remover colônias únicas das cepas a serem examinadas para invasão bacteriana e inocular cada uma em tubos individuais de 14 ml contendo 2 ml de caldo BHI.
  2. Coloque os tubos inoculados em uma incubadora de 37 °C inclinada a 45° e incuba estaticamente (sem tremer) durante a noite.
  3. Na manhã seguinte, remova o tubo de cultura da incubadora e do vórtice brevemente para garantir a suspensão uniforme das bactérias.
  4. Meça a densidade óptica da cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm de comprimento de onda. Certifique-se de zerar o espectótmetro usando caldo BHI estéril antes de ler a densidade óptica.
  5. Para L. monocytogenes,a densidade óptica está diretamente relacionada à concentração de bactérias por ml, de tal forma que uma densidade de 1.000 = 1,0 x 109 UFC por ml.
  6. Calcule a quantidade de cultura necessária para infectar 2,25 x 104 células com 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Remova a quantidade de cultura necessária e coloque-a em um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
  8. Gire a cultura a 19.000 x g por 3 minutos, depois descarte o supernaspeso. Toque na extremidade aberta do tubo contra uma toalha de papel, a fim de remover o excesso de mídia grudado no lábio do tubo.
  9. Resuspenque as bactérias em 1 ml de PBS e vórtice e vórtice para garantir a mistura suficiente. Esta mistura deve conter aproximadamente 2,25 x 106 UFC por 20 ul (1.125 x 108 UFC/ml).

5. Executando o Ensaio de Invasão

  1. Um dia antes do ensaio de invasão, prepare 24-bem de placas de células H9c2 como descrito na Seção 3, e também inocular caldo BHI estéril com a estirpe desejada de Listeria como descrito na Seção 4.
  2. Usando o protocolo na Seção 4, prepare culturas resuspended pbs das cepas a serem avaliadas para invasão. Nota: O título infeccioso pode ser avaliado neste momento, emplacando diluições de cada amostra em mídia sólida e enumerando colônias após a incubação durante a noite.
  3. Carregue pelo menos 20 ul da solução pbs-bactéria em poços individuais da placa de 24 poços. Observe que pelo menos três poços individuais são necessários para cada cepa, a fim de obter resultados em triplicado, de modo que até 8 cepas podem ser avaliadas em conjunto.
  4. Depois de carregar os poços com bactérias, balance suavemente a placa para incentivar a propagação homogênea de cada amostra dentro do poço, e coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora para 45 minutos de incubação a 37 °C e 95% de umidade, com 5% de CO2.
  5. Durante esta incubação, prepare uma alíquota de DMEM – Ab (Seção 2) simplesmente removendo 25 ml de DMEM –Ab e colocando-o em um tubo falcão de 50 ml (ou equivalente).
  6. Adicione gentamicina ao DMEM de 25 ml –Ab aliquot a uma concentração de 15 ug/ml (7,5 ul de uma solução de estoque de 50 mg/ml). Coloque a solução DMEM –Ab +Gent em um banho d'água de 37 °C durante a incubação de 45 min.
  7. Aliquot 25 ml de PBS em um tubo falcão de 50 ml e coloque no banho d'água de 37 °C durante a incubação de 45 min.
  8. Após a conclusão da incubação de 45 minutos, retire a placa de 24 poços e coloque-a no capô. Remova a mídia que contém bactérias de cada poço por aspiração de vácuo, trocando pontas de tubulação de vidro entre diferentes cepas.
  9. Adicione aproximadamente 1 ml de PBS a cada poço, a fim de lavar bactérias frouxamente aderentes da superfície das células, em seguida, remova o PBS usando aspiração de vácuo.
  10. Após a remoção completa do PBS, adicione 1 ml de DMEM –Ab +Gent a cada poço. A gentamicina só matará as bactérias que permanecem fora das células, assim, aquelas que são intracelulares permanecerão viáveis.
  11. Coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora e deixe incubar por mais uma hora.
  12. Durante a incubação de uma hora, prepare tubos de polipropileno de 14 ml adicionando 1 ml de ddH20 estéril a cada tubo. Um tubo será necessário para cada deslizamento de cobertura, por isso, para uma placa de 24 poços, prepare 24 tubos no total.
  13. Após a incubação de uma hora, retire a placa de 24 poços da incubadora e coloque-a no capô, juntamente com os tubos preparados na etapa 5.12.
  14. Usando pinças estéreis, remova cada mancha de cobertura de seu poço respectivo e coloque-a imediatamente em um tubo individual. Certifique-se de mergulhar as pinças no etanol e flame-las entre cada tampa, a fim de evitar contaminação.
  15. Depois que todas as tampas tiverem sido removidas e colocadas em tubos individuais, descarte a placa de 24 poços.
  16. Volte para o banco e vórtice cada tubo por 5-10 segundos.
  17. Remova uma porção de cada tubo e coloque cada amostra em um poço individual de uma placa de 96 poços, em seguida, dilua cada amostra em série usando diluições de 1:10 até uma diluição de 1:100.
  18. Usando placas LB pré-armadas e secas, coloque cada uma das séries de diluição nas placas de ágar. Um tubo multicanal pode ser usado para emplacar 5-10 μl pontos da série de diluição de cada amostra.
  19. Remova também 20 amostras de μl de cada poço não diluído e coloque esta quantidade diretamente no ágar LB em uma placa separada da série de diluição. (Este volume maior pode ser usado para enumerar cepas mal invasivas).
  20. Depois de todas as amostras terem sido banhadas à mancha, descarte os tubos de 14 ml contendo as tampas. Parafilme a placa de 96 poços e coloque-a em uma caixa de congelador a -80 °C para replacar, se necessário.
  21. Deixe as manchas secarem completamente. Este processo é muito acelerado colocando as placas no capô e removendo as tampas.
  22. Depois que as manchas secarem, coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite.
  23. Na manhã seguinte, conte o número de colônias em cada ponto da série de diluição para a qual os números das colônias podem ser facilmente avaliados (entre aproximadamente 5 e 50 colônias) (Figura 1),e use a série para calcular o número de bactérias por deslizamento de cobertura para cada cepa avaliada.

6. Preparando cepas de L. monocytogenes para infecções de camundongos

  1. Na noite anterior à infecção, use um laço esterilizado para remover colônias únicas das cepas desejadas e inocular cada uma em tubos individuais de 14 ml contendo 2 ml de caldo BHI.
  2. Coloque os tubos inoculados em uma incubadora de 37 °C inclinada a 45° e incuba estaticamente (sem tremer) durante a noite.
  3. Na manhã seguinte, remova o tubo de cultura da incubadora e do vórtice brevemente para garantir uma suspensão uniforme da bactéria.
  4. Meça a densidade óptica da cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm de comprimento de onda. Certifique-se de zerar o espectótmetro usando caldo BHI estéril antes de ler a densidade óptica. (Para L. monocytogenes,a densidade óptica está diretamente relacionada à concentração de bactérias por ml, de modo que uma densidade de 1.000 = 1,0 x 109 UFC por ml)
  5. Calcule a quantidade de cultura necessária para infectar cada animal. As injeções normalmente contêm 200 μl de PBS com 10.000 UFC de uma cepa individual, o que se traduz em uma concentração desejada de 5,00 x 104 UFC/ml.
  6. Remova uma alíquota de 5 μl de cada diluição final e espalhe-a diretamente no ágar LB.  Incubar durante a noite a 37 °C para confirmar a concentração utilizada para a inoculação.
  7. Injete cada suspensão da UFC dentro de 1 hora de diluição (veja abaixo).

7. Vacinar L. monocytogenes em camundongos via Injeção de Veia de Cauda e Avaliação da Carga Bacteriana dentro do fígado, baço e coração

Nota: Todo o trabalho animal é realizado de acordo com as diretrizes de Biossegurança nível 2 do CDC.  Os camundongos são normalmente ordenados com uma semana de antecedência e enjaulados juntamente com 5 animais por gaiola. Os camundongos podem se adaptar ao novo ambiente de laboratório por quatro dias antes da injeção. Esses experimentos usaram camundongos suíço-webster de 6 a 8 semanas que foram alojados 5 em uma gaiola em um ambiente de barreira e alimentaram uma dieta não restrita.

  1. Prepare uma gaiola de ratos de cada vez removendo a tampa e as caixas de alimentos/água, e colocando a gaiola sob uma lâmpada de calor por cinco minutos. Este processo permite que as veias da cauda se dilatam, facilitando a realização das injeções.
  2. Remova um animal e coloque-o em um arreio (ou tubo falcão com a extremidade cortada) a fim de conter o animal durante a injeção.
  3. Limpe o local da injeção usando uma almofada de álcool e deixe o álcool evaporar. Isso não só limpa o local, mas também dilata ainda mais a veia da cauda.
  4. Usando uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha calibre 27,5, injete suavemente o mouse com 200 μl da cultura desejada na veia traseira.
  5. Use uma gaze para parar qualquer sangramento que possa ocorrer como resultado da injeção, e coloque o animal em uma gaiola fresca.
  6. Repita este processo para os demais animais e cepas. Certifique-se de rotular cada gaiola de animais com a cepa que eles receberam.
  7. Verifique os animais diariamente, removendo e sacrificando todos os animais que pareçam estar doentes.  Se nenhum animal apresentar sinais de doença, permita que as infecções prossigam por 72 horas antes de sacrificar todos os animais.
  8. Para sacrificar, use a anestesia de CO2 de uma fonte engarrafada até que todas as respirações tenham parado, em seguida, use deslocamento cervical para garantir que o animal está morto.
  9. Após o sacrifício, mova os animais para uma capa de cultura de tecidos para dissecção.
  10. Usando um bloco de dissecção, fixe cada perna do animal com agulhas de bitola grande e pulverize o animal com 70% de etanol até que esteja saturado.
  11. Corte a pele do abdômen e do tórax para trás usando uma incisão em forma de Y que se estende desde a abertura vaginal até o processo xifoide, progredindo então até a axila de cada braço.
  12. Puxe a pele e remova as agulhas de cada perna para manter a dissecção aberta.
  13. Corte suavemente através do peritônio, expondo os intestinos, estômago, fígado e baço.
  14. Cortando pela primeira vez a veia hepática e o ligamento coronal na parte superior do fígado, comece a remover o fígado. Ligamentos adicionais a serem removidos são encontrados sob o fígado, conectando-o à primeira seção do intestino delgado, bem como à musculatura das costas.
  15. Coloque o fígado em 5 ml de ddH20 estéril em um tubo falcão de 50 ml.
  16. Em seguida, remova o baço isolando-o e cortando suavemente a vasculatura e os ligamentos. O baço será removido mais facilmente do que o fígado. Coloque o baço em um tubo falcão separado contendo 5 ml estérei ddH20.
  17. Localize o diafragma e corte suavemente ao longo da caixa torácica para visualizar o tórax. Corte o processo xifoide e esterno ao nível do pescoço a fim de abrir o tórax, expondo o coração e os pulmões.
  18. Usando fórceps, pegue o coração suavemente pelo seu ápice, e levante-o de tal forma que a aorta e os vasos pulmonares estejam em tensão. Corte esses vasos para libertar o coração.
  19. Coloque o coração em um tubo falcão de 50 ml contendo 5 ml de ddH20 estéril.
  20. Descarte a carcaça do rato e repita este processo para cada animal, utilizando tubos de falcão limpo contendo 5 ml estéreis ddH20para cada órgão removido.
  21. Depois de removidos todos os órgãos, limpe a estação de trabalho e volte para o banco.
  22. Prepare um conjunto de 5 tubos a serem usados para limpar e esterilizar o homogeneizador para cada conjunto de órgãos de cinco camundongos (ou seja, um conjunto de tubos 5 para 5 fígados, 5 tubos para 5 baços e 5 tubos para 5 corações). Quatro de cada um dos tubos devem ser preenchidos com 30 ml de ddH20 estéril, e um deve ser preenchido com 30 ml 90% EtOH.
  23. Usando um TissueMaster (ou homogeneizador equivalente), mergulhe o homogeneizador (durante a execução) nos tubos preparados na etapa 7.21 da seguinte forma para limpar a sonda:
  24. Tubo 1 (ddH2O)
    5 segundos no tubo 2 (ddH2O)
    5 segundos no tubo 3 (EtOH)
    5 segundos no tubo 4 (ddH2O)
    5 segundos no tubo 5 (ddH2O)
  25. Homogeneize um fígado usando o homogeneizador por pelo menos 2 minutos, ou até que não permaneçam porções visíveis do órgão. Use pinças para remover detritos grandes da sonda.
  26. Repita o processo de limpeza descrito na etapa 7.22
  27. Repita o processo de homogeneização dos outros fígados, certificando-se de lavar a sonda entre cada fígado usando o processo descrito na etapa 7.22.
  28. Depois que todos os fígados estiverem completamente homogeneizados, descarte os tubos de lavagem (1-5) para o fígado.
  29. Repita o processo de homogeneização/limpeza tanto para o baço quanto para os corações, certificando-se de usar um novo conjunto de tubos de lavagem para cada série de órgãos. Se em algum momento os tubos de lavagem ficarem turvas, descarte-os e substitua por novos tubos para terminar a série.
  30. Depois de todos os órgãos terem sido homogeneizados, faça um último ciclo de limpeza no homogeneizador e seque-o bem para armazenamento.
  31. Coloque aproximadamente 200 μl de cada órgão em um poço individual de uma placa de 96 poços.
  32. Realizar diluições seriais nas amostras do órgão diluindo 1:10 em uma série até uma diluição de 1:10.000 (fígado e baço) ou até uma diluição de 1:1.000 (coração).
  33. Coloque a placa da série de diluição no ágar LB pré-aquecido. Remova também 20 ul de cada órgão não diluído e placa em placas separadas de ágar LB, a fim de enumerar a UFC de órgãos mal colonizados.
  34. Descarte os tubos falcão contendo os órgãos homogeneizados e enrole as placas de 96 poços contendo a série de diluição com parafilme e coloque-a em uma caixa de congelador a -80 °C.
  35. Deixe as manchas secarem. Este processo é acelerado colocando as placas no capô e removendo as tampas.
  36. Depois que as manchas secarem, coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite.
  37. Conte o número de colônias em cada ponto na manhã seguinte e use a série de diluição para calcular o número total de bactérias por órgão.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolados selecionados de L. monocytogenes exibem maior invasão de células cardíacas na cultura celular e em modelos de infecção de camundongos. A Figura 1 mostra um exemplo de como as colônias bacterianas podem aparecer após o revestimento de suspensões na mídia ágar. Este método permite uma avaliação precisa das CFUs dentro de uma amostra sem o uso de um grande número de placas de mídia ágar. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio baseado em cultura tecidual comparando a capacidade da cepa 10403S de invadir células cardíacas com a da cepa 07PF0776. Mais do que o dobro da CFU bacteriana 07PF0776 pode ser recuperada de células cardíacas H9c2 infectadas após o tratamento de gentamicina em comparação com células infectadas com 10403S. Diferenças de 2 a 4 vezes são observadas rotineiramente para cepas cardiotrópicas usando este ensaio. A Figura 3 mostra um exemplo da recuperação de bactérias dos fígados, baços e corações de camundongos infectados aos 3 dias após a infecção. A infecção de camundongos com a cepa cardiotrópica 07PF0776 ou cepa 10403S resulta em número comparável de bactérias recuperadas dos fígados e baços de camundongos infectados, no entanto camundongos infectados com 07PF0776 são mais propensos a produzir números detectáveis de bactérias do coração e a apresentar maiores cargas bacterianas neste órgão.

Figure 1
Figura 1: Exemplo da técnica de revestimento de manchas para determinar cfus bacterianos. As células H9c2 cultivadas em tampas de vidro e infectadas com L. monocytogenes foram diluídas e as suspensões foram diluídas em série usando diluições de 1:10 até uma diluição de 1:1.000 (painel esquerdo). Um pipet multicanal foi usado para pipet 10 ul de cada poço diretamente em uma placa de ágar LB, e a placa foi incubada durante a noite a 37 °C (painel direito). O número de bactérias por deslizamento de cobertura é avaliado pela contagem da CFU bacteriana associada à diluição apropriada.

Figure 2
Figura 2: L. monocytogenes tensão 07PF0776 exibe invasão aprimorada de células cardíacas na cultura tecidual. Os ensaios de invasão foram realizados em células H9c2 usando um MOI = 100. O gráfico mostra o número médio de CFUs bacterianas intracelulares recuperadas +/- SE de células infectadas com 10403S (preto) versus a cepa cardiotropica 07PF0776 (azul). ** indica um significado de p <0,01.

Figure 3
Figura 3: L. monocytogenes tensão 07PF0776 exibe invasão aprimorada do coração em modelos de infecção por camundongos. Os animais foram vacinados com 10.000 UFC pela veia traseira. As infecções foram autorizadas a progredir por 72 horas, momento em que os animais foram sacrificados e os fígados, baços e corações foram coletados e processados para determinar a UFC bacteriana por órgão. Os círculos sólidos representam a UFC obtida a partir de camundongos individuais, com o valor médio para todos os animais dentro de um grupo indicado por uma linha +/- SE. Os valores percentuais indicam o número de animais contendo UFC bacteriana detectável dentro do coração. * indica um significado de p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. monocytogenes é um patógeno humano generalizado e bem caracterizado, capaz de causar uma série de manifestações diferentes da doença15. A bactéria foi descrita anteriormente por sua capacidade de translocar através de barreiras, como a barreira hematoencefálica e as barreiras placentárias-fetais, a fim de alcançar e colonizar o sistema nervoso central e desenvolver feto, respectivamente. A capacidade in vivo do organismo de colonizar esses tecidos é muitas vezes complementada por uma capacidade in vitro de invadir as células representativas na cultura que compõem os órgãos visados. Por exemplo, a invasão de células epiteliais no plexo coroóide tem sido associada à capacidade do organismo de colonizar o CNS16; e explantos de trophoblasto villous têm sido usados para representar a barreira materno-fetal17. Neste protocolo, foram descritos métodos que são úteis para avaliar a invasão bacteriana de células cardíacas na cultura, bem como para comparação da colonização bacteriana do coração para isolados individuais em relação à colonização do fígado e do baço.

Este protocolo contém uma série de etapas críticas, mas entre as mais críticas estão aquelas que envolvem o uso da CFU bacteriana correta para a infecção de células de cultura tecidual cultivadas em deslizamentos de cobertura ou a infecção de animais. Se o número da UFC bacteriana não for corretamente controlado entre diferentes poços e animais, então comparações diretas entre amostras não podem ser feitas. É importante verificar novamente a série de diluição usada para gerar o inocula por meio do revestimento direto das diluições finais nas placas de mídia, a fim de garantir que o número da UFC bacteriana tenha sido estimado com precisão.

As células H9c2 utilizadas nestes ensaios são derivadas da metade inferior de um coração de rato embrionário de 13 dias que incluía principalmente tecido ventricular18. As células se propagam como myoblasts mononucleadas e ao atingir confluência em frascos ou pratos de cultura tecidual começam a formar estruturas tubulares multinucleadas. As células têm um tempo de geração de aproximadamente 30 horas18. A fome de soro das células H9c2 tem sido associada à diferenciação das células em células musculares esqueléticas, enquanto o tratamento dos míomos com ácido retinóicotrans de 10 nM tem sido associado à diferenciação do mioblast em miócitos cardíacos14. Este protocolo foi focado na invasão de células myoblast de L. monocytogenes, no entanto a linha celular H9c2 é uma linha celular versátil que poderia ser usada para investigar os efeitos da diferenciação celular controlada na invasão bacteriana.

A cepa L. monocytogenes 07PF0776 foi originalmente isolada de um paciente infectado pelo HIV que teve uma prisão assélica não resusitatável devido a uma infecção invasiva de L. monocytogenes do coração8. A análise subsequente dessa cepa em modelos de infecção por camundongos indicou que ela tinha uma capacidade aprimorada de atingir e invadir tecido cardíaco. Uma análise limitada de isolados aleatórios adicionais de L. monocytogenes sugere que sub-populações de isolados bacterianos são capazes de infectar os corações dos camundongos na ausência de qualquer dano prévio ao tecido cardíaco ou válvulas cardíacas8. Curiosamente, duas das melhores cepas de L. monocytogenes, 10403S e EGD, foram encontradas como colonizadoras pobres de células cardíacas e tecidos. O sequenciamento do genoma do isolado 07PF0776 não revelou a presença de nenhuma nova ilha de patogenicidade ou forneceu evidências de aglomerados genéticos únicos19; isso sugere que o 07PF0776 tem como alvo as células cardíacas para invasão através da modificação de seu arsenal existente de produtos genéticos de virulência. A análise histoquímica preliminar indica que 07PF0776 forma abscessos dentro de corações de camundongos infectados que parecem semelhantes ao abscesso observado dentro do paciente humano infectado original (dados não mostrados). Resta saber se outros isolados cardiotrópicos L. monocytogenes induzem formação de abscesso cardíaco semelhante.

Os ensaios aqui apresentados podem ser facilmente modificados para facilitar o exame de diferentes aspectos da infecção. As coberturas individuais podem ser fixadas e manchadas para microscopia à base de luz ou fluorescência, os tempos de incubação da cultura tecidual podem ser aumentados para a medição e comparação das taxas de crescimento intracelulares de bactérias, tecidos e órgãos podem ser incorporados e processados para exame microscópico para examinar a formação de abscessos e a distribuição bacteriana no nível celular. Ao avaliar os níveis de invasão bacteriana de células de cultura tecidual ou colonização de tecidos hospedeiros, há limitações em termos da quantidade mínima de bactérias que cada ensaio pode detectar. Ensaios de invasão in vitro têm um limite menor de detecção de aproximadamente 300 CFU por deslizamento de cobertura. Ajustar o volume de água usado para vórtices as manchas podem aumentar a detecção de baixo número de bactérias, com volumes de lise celular tão baixos quanto 500 μl provando ser úteis para detectar cepas mal invasivas. As manchas podem ser brevemente mergulhadas em água estéril para remover o excesso de gentamicina antes da lise das células hospedeiras em volumes menores. Níveis de volume de até 5 ml ou superior podem ser usados para enumerar adequadamente cepas altamente invasivas. Nos animais, os homogeneizadores de órgãos podem ser gerados em volumes de 5 ml ou 10 ml de ddH20, sendo menores volumes úteis para detectar níveis mais baixos de bactérias, e volumes mais elevados para melhor enumerar órgãos fortemente colonizados. A faixa mínima de detecção de órgãos infectados é de aproximadamente 100 UFC. Se os órgãos forem consistentemente colonizados em níveis elevados, considere usar um volume maior de água (10 ml) e realizar mais diluições dentro da placa de 96 poços.

Os métodos descritos podem ser aplicados a órgãos e tecidos fora do coração. Ensaios de invasão e infecções de camundongos como estes têm sido usados para avaliar a colonização em uma infinidade de locais, incluindo placenta, cérebro, vesícula biliar, fígado e intestino. Modificações dos protocolos descritos acima também podem ser feitas para acomodar cepas hiperinvasivas e/ou hipervirulentas, e a substituição de células cardíacas por outros tipos de células pode ser feita para avaliar fenótipos de invasão em locais fora do sistema cardiovascular. Uma vez que diferentes tipos de células alteraram as suscetibilidades à invasão de L. monocytogenes, o ajuste de parâmetros como MOI e tempos de incubação pode ser necessário para recuperar com precisão os dados dos ensaios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não relatam interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Serviço Público de Saúde AI41816 e AI099339 (N.E.F.) e pela F31AI094886-01 (P.D.M.) da NIAID. Os conteúdos são de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais das fontes de financiamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Tags

Infecção Problema 99 patogênese bacteriana patógeno intracelular tropismo tecidual invasão bacteriana infecção cardíaca listeriose
Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando <em>listeria monocytogenes</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter