Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Listeria monocytogenes orsakar fetala infektioner hos gravida kvinnor och hjärnhinneinflammation i mottagliga populationer. Subpopulationer av bakterier kan kolonisera hjärtvävnad, vilket orsakar hjärtmuskelinflammation hos patienter och försöksdjur. Här presenterar vi ett protokoll som beskriver hur man bedömer L. monocytogenes hjärtcellsinvasion in vitro och hjärtkolonisering hos infekterade djur.

Abstract

Listeria monocytogenes är en Gram-positiv fakultets intracellulär patogen som kan orsaka allvarliga invasiva infektioner hos immunkomprometterade patienter, äldre och gravida kvinnor. De vanligaste manifestationerna av listerios hos människor inkluderar hjärnhinneinflammation, encefalit och fetala abort. En betydande men mycket mindre dokumenterade och sviter av invasiva L. monocytogenes infektion innebär hjärtat. Dödstalet från hjärtsjukdomar kan vara upp till 35% trots behandling, men mycket lite är känt när det gäller L. monocytogenes kolonisering av hjärtvävnad och dess resulterande patologier. Dessutom har det nyligen blivit uppenbart att subpopulationer av L. monocytogenes har en förbättrad kapacitet att invadera och växa inom hjärtvävnad. Detta protokoll beskriver i detalj in vitro och in vivo metoder som kan användas för att bedöma kardiotropism av L. monocytogenes isolat. Metoder presenteras för infektion av H9c2 råtta hjärt myoblaster i vävnad kultur samt för bestämning av bakteriell kolonisering av hjärtan hos infekterade möss. Dessa metoder är användbara inte bara för att identifiera stammar med potential att kolonisera hjärtvävnad hos infekterade djur, men kan också underlätta identifiering av bakteriella genprodukter som tjänar till att förbättra hjärtcellsinvasion och / eller driva förändringar i hjärtpatologi. Dessa metoder ger också den direkta jämförelsen av kardiotropism mellan flera L. monocytogenes stammar.

Introduction

Listeria monocytogenes är en Gram-positiv intracellulär patogen som kan orsaka allvarlig sjukdom hos mottagliga populationer, inklusive äldre, gravida kvinnor, personer med HIV/ AIDS och personer som får kemoterapi1. Infektion i dessa populationer är ofta resultatet av intag av förorenade livsmedelsprodukter, och de flesta infektioner är förknippade med storskaliga livsmedelsburnautbrott 2,3. Hos människor och andra däggdjur kan L. monocytogenes förflytta sig över tunntarmens epitelgräns och därefter transporteras tilllevern 4,5. Djurmodeller tyder på att intagna bakterier replikerar i tarm villi och transitering till levern genom portal venen eller sprids via de mesenteriiska lymfkörtlarna i blodet, vilket leder till hematogen spridning till levern och mjälte6,7. I levern och mjälten kan bakterien förmedla upptag i både professionella fagocyter samt bosatta parenkymala celler och etablerar snabbt infektioner i dessa organ. När bakteriebelastningen ökar sprids många bakterier tillbaka i blodet, där de kan ytterligare kolonisera mottagliga vävnader inklusive centrala nervsystemet och placentan (där den finns). Kolonisering av dessa platser utesluter de vanligaste manifestationerna av listerios hos människor, inklusive hjärnhinneinflammation, encefalit och fetala abort2.

Utvalda subpopulationer av L. monocytogenes har nyligen visat sig ha en förbättrad kapacitet att invadera och replikera inom hjärtvävnad8. Manifestationer av hjärtat engagemang är varierade, och sträcker sig från endokardit och hjärtsäcksinflammation, till fulminant hjärtmuskelinflammation komplett med resistiv avvikelser9-13. Det totala antalet L. monocytogenes hjärtfall per år är lågt men kan vara under uppskattat eftersom denna aspekt av infektion inte är allmänt väl erkända. Kolonisering av hjärtat av patogener kräver ofta värd predispositioner som befintliga valvulära skador eller konstgjorda hjärtklaffar. Det finns dock isolat av L. monocytogenes som har identifierats som är anmärkningsvärda för deras förmåga att kolonisera hjärtan hos infekterade djur i avsaknad av hjärtskador och / eller avvikelser8.

Häri beskrivs in vitro- och in vivo-metoder för att bedöma bakteriell kolonisering av hjärtvävnad hos infekterade djur med hjälp av invasionsanalyser i vävnadskultur samt levande djurinfektioner. Dessa metoder har visat sig vara användbara inte bara för att identifiera stammar med potential att kolonisera hjärtvävnad hos infekterade djur, men bör också vara användbara för identifiering av bakteriella genprodukter som tjänar till att förbättra hjärtcellsinvasion och/ eller resultera i förändringar i hjärtpatologi. Dessa metoder underlättar jämförelsen av kardiotropism mellan flera stammar. För de metoder som beskrivs här används L. monocytogenes 10403S som en välstuderad representant för en icke-kardiotropisk stam och det kliniska isolatet 07PF0776 används som ett representativt exempel på en kardiotropisk stam. Dessa två stammar valdes för att ge en jämförelse för bakteriell invasion av hjärtceller in vitro och kolonisering av hjärtan hos infekterade möss in vivo. Isolatet 07PF0776 är ett kliniskt isolat som återfunnits från en interventricular böld som orsakade en dödlig arytmi hos en HIV + patient8. L. monocytogenes isolat kan variera i deras virulens potential, och med tanke på benägenheten för Listeria att infektera personer med immunsuppression och gravida kvinnor, personer inom dessa populationer bör iaktta försiktighet vid bedömning av olika kliniska isolat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lagrings- och kulturförhållanden för L. monocytogenes-stammar

  1. Förbered fasta medier genom att autoklavera hjärn-hjärta infusion agar (BHI) och hälla smälta medier i petriplattor. Låt plattorna torka över natten vid rumstemperatur och övernatta sedan igen vid 37 °C.
  2. Använd en steril slinga, få ett litet prov av L. monocytogenes från antingen tidigare tillverkade fryslager (bakterier upphängda i 20% glycerol i BHI flytande medier, lagrade vid -80 °C) eller från en agarplatta som innehåller kolonier som tidigare träffats för isolering.
  3. Använd aseptisk teknik, strimma provet för isolering av enstaka kolonier. Var noga med att sterilisera slingan mellan korsstreck för att förhindra överdriven överföring och säkerställa isolering av enskilda kolonier av den stam som bedöms. Inkubera plattan/plattan över natten vid 37 °C.
  4. Använd en steril slinga, ta bort en koloni av isolatet och inokulera 2 ml BHI-buljong (utan agar) i ett 14 ml polystyrenrör.
  5. För analyser och infektioner, inkubera buljongkulturen statiskt (utan skakning) över natten i en inkubator på 37 °C. För strumpa av odlade isolat, inkubera buljongkulturen vid 37 °C med skakningar vid 180-200 rpm över natten. Kulturer kan lagras genom att tillsätta glycerol till en slutlig koncentration på 20% och lagra förseglade rör vid -80 °C på obestämd tid.

2. Förvarings- och odlingsförhållanden för H9c2 Hjärt Myoblast-liknande celler

  1. Köp eller erhåll ett fryst lager av H9c2-celler, samt Dubelcos Modified Eagle's Medium (DMEM) som innehåller hög glukos och pyruvat, fetala nötkreatursserum (FBS), L-glutamin (glut) och en Penicillin-Streptomycin-Glutaminblandningar (PSG).  FBS, Glut och PSG bör lagras vid -20 °C, medan DMEM kan lagras vid 4 °C. Det är bra att alikvot FBS i 50 ml koniska rör före frysning.
  2. Tina två alikvoter fbs i en laminär flödeshuv. Tillsätt en alikvot till en 500 ml flaska DMEM, vilket gör en 10% FBS/ DMEM-blandning. Tillsätt därför 6 ml glut och fyll den resulterande lösningen vid 4 °C. Denna lösning kan märkas "DMEM utan antibiotika." (DMEM –Ab)
  3. Tillsätt den andra 50 ml alikvoten FBS till en andra 500 ml flaska DMEM. Lägg till 6 ml PSG och fyll på vid 4 °C. Denna lösning kan märkas "DMEM med antibiotika." (DMEM +Ab)
  4. Ta bort 10 ml DMEM +Ab i laminarhuven och placera den i en 25 ml vävnadskulturkolv.
  5. Lämna kolven i laminarhuven, ta bort en frusen alikvot av H9c2-celler från lagring i flytande kväve och placera snabbt röret i ett 37 °C vattenbad tills kulturen har tinat.
  6. Spraya röret med 70% etanol för att sanera och återvänd sedan till huven. Arbeta snabbt för att minimera celltiden i koncentrerad DMSO, lägg till hela alikvoten av celler till 10 ml DMEM +Ab.  Detta späder ut DMSO tillräckligt för cellens livskraft och vidhäftning över natten.
  7. Placera kolven i en inkubator för vävnadskultur vid 37 °C, 5 % C02och 95 % luftfuktighet över natten.
  8. Följande morgon kontrollerar du celllagret för att säkerställa vidhäftning. Cellerna kommer sannolikt att vara mellan 80-100% konfluenta vid denna tidpunkt.
  9. Ta bort mediet i kolven med hjälp av vakuumet i vävnadshuven och lämna endast cellerna i kolven.
  10. Tillsätt cirka 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA till cellerna och vagga försiktigt i cirka 3 sekunder.
  11. Vänd kolven så att trypsinlösningen inte längre kommer i kontakt med monoskiktet och ta bort trypsinet genom vakuum.
  12. Tillsätt en andra 2 ml alikvot trypsin till cellerna och flytta kolven till ett inverterat mikroskop. Observera cellerna medan du försiktigt gungar kolven för att säkerställa att monoskiktet sprids.
  13. När monoskiktet har skingrats, återgå omedelbart till vävnadskulturhuven och tillsätt 4 ml DMEM +Ab till cellfjädringen.
  14. Ta bort en 2 ml del av cellupphängningen och tillsätt den i en 50 ml vävnadskulturkolv som innehåller 23 ml DMEM +Ab. Vagga kolven försiktigt och placera den sedan i vävnadskulturens inkubator under de förhållanden som anges i steg 2.5.
  15. Kontrollera cellerna dagligen tills de når cirka 80% sammanflöde (cirka 2, 0-4,0 x 105 celler per ml). Det är mycket viktigt att celler inte blir för konfluenta, eftersom de kan differentiera sig till skelettmuskeln myotuber när de svälter av FBS under längretidsperioder 14 och denna differentiering kan förändra bakteriell invasion.  Övervaka cellerna noggrant och börja med ett nytt cellrör om en kultur blir konfluent.
  16. När cellerna når 80% sammanflöde kan de antingen föras in i en annan 50 ml kolv som beskrivits, eller förberedas för invasionsanalys.

3. Förbereda H9c2-celler för invasionsanalys

  1. Ta bort mediet från en 50 ml kolv H9c2-celler som har nått 80% sammanflöde med vakuumambition i vävnadskulturen.
  2. Tillsätt 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA-lösning på monoskiktet och avlägsna omedelbart med vakuumambition.
  3. Tillsätt ytterligare 4 ml portion av 0,25% Trypsin-EDTA till kolven och flytta kolven till ett inverterat mikroskop för att observera spridningen av monoskiktet.
  4. När cellerna har skingrats, återvänd till huven och tillsätt 4 ml DMEM –Ab till cellerna. Pipetting lösningen upp och ner säkerställer fullständig borttagning av celler från botten av kolven.
  5. Efter återupplivning av monoskiktet, ta bort all suspension och placera den i ett 50 ml koniskt rör.
  6. Ta bort en 20 ul del av denna suspension och räkna antalet celler per milliliter med hjälp av en hemocytometer.
  7. När koncentrationen av celler i lösningen har fastställts, justera koncentrationen till 2,25 x 104 celler/ml genom att tillsätta lämplig volym celllösning till färsk DMEM –Ab. Den totala volymen av den justerade lösningen ska vara 25 ml.
  8. När du är i huven steriliserar du glaslock genom att doppa dem i 90% etanol och kort passerar varje täckglas genom en flamma. Tillsätt varje täckglas till en enskild brunn på en 24-brunns vävnadskulturbehandlad platta direkt efter att den har steriliserats.
  9. När alla brunnar har en individuell täcklip, använd en 25 ml rör för att lägga till 1 ml av den utspädda celllösningen till var och en av brunnarna i plattan och tryck ner varje locklip med en steril nål.
  10. Kontrollera varje brunn med hjälp av ett inverterat mikroskop för att säkerställa att liknande mängder celler finns i varje brunn. Sätt 24 brunnsplattan i vävnadskulturens inkubator över natten vid 37 °C i 5% CO2 och 95% luftfuktighet.
  11. Följande morgon, se varje brunn för att säkerställa att täckglasen har jämförbara mängder vidhäftande myoblaster och att täckglasen inte flyter i brunnen.

4. Förbereda stammar av L. monocytogenes för invasionsanalyser

OBS: Allt laboratoriearbete utförs i enlighet med CDC Biosafety Level 2 riktlinjer.

  1. Efter att ha förberett 24-brunnsplattan för analys, använd en steriliserad slinga för att ta bort enstaka kolonier av de stammar som ska undersökas för bakteriell invasion och inokulera var och en i enskilda 14 ml-rör som innehåller 2 ml BHI-buljong.
  2. Placera de inokulerade rören i en inkubator på 37 °C lutad vid 45° och inkubera statiskt (utan skakningar) över natten.
  3. Följande morgon, ta bort odlingsröret från inkubatorn och virveln kort för att säkerställa enhetlig suspension av bakterierna.
  4. Mät kulturens optiska densitet med hjälp av en spektrofotometer vid 600 nm våglängd. Var noga med att nollställa spektrofotometern med steril BHI-buljong innan du läser av den optiska densiteten.
  5. För L. monocytogenesär den optiska densiteten direkt relaterad till koncentrationen av bakterier per ml, så att en densitet på 1.000 = 1,0 x 109 CFU per ml.
  6. Beräkna mängden kultur som behövs för att infektera 2,25 x 104 celler med 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Ta bort mängden kultur som behövs och placera den i ett 1,5 ml centrifugeringsrör.
  8. Snurra kulturen på 19 000 x g i 3 min och kassera sedan supernaten. Knacka den öppna änden av röret mot en pappershandduk för att ta bort överflödiga medier som fastnat på rörets läpp.
  9. Återanvänd bakterierna i 1 ml steril PBS och virvel för att säkerställa tillräcklig blandning. Denna blandning bör innehålla cirka 2,25 x 106 CFU per 20 ul (1,125 x 108 CFU/ml).

5. Utföra invasionsanalysen

  1. Dagen före invasionsanalysen, förbered 24-brunnsplattor av H9c2-celler enligt beskrivningen i avsnitt 3, och även inokulera steril BHI-buljong med önskad stam av Listeria enligt beskrivningen i avsnitt 4.
  2. Med hjälp av protokollet i avsnitt 4, förbereda PBS-återanvända kulturer av de stammar som ska bedömas för invasion. Obs: Infektiös titer kan bedömas vid denna tidpunkt genom att plätera utspädningar av varje prov på fasta medier och räkna upp kolonier efter inkubation över natten.
  3. Ladda minst 20 ul av PBS-bakterielösningen i enskilda brunnar på 24-brunnsplattan. Observera att minst tre enskilda brunnar behövs för varje stam för att uppnå resultat i tre exemplar, så att upp till 8 stammar kan bedömas tillsammans.
  4. Efter att ha laddat brunnarna med bakterier, vagga försiktigt plattan för att uppmuntra homogen spridning av varje prov i brunnen och placera 24-brunnsplattan tillbaka i inkubatorn för 45 min inkubation vid 37 °C och 95% fuktighet, med 5% CO2.
  5. Under denna inkubation bered en alikvot DMEM – Ab (avsnitt 2) genom att helt enkelt ta bort 25 ml DMEM –Ab och placera den i ett 50 ml falkrör (eller motsvarande).
  6. Tillsätt gentamicin till 25 ml DMEM – Ab aliquot till en koncentration av 15 ug/ml (7,5 ul av en 50 mg/ml stamlösning). Placera DMEM –Ab +Gent-lösningen i ett vattenbad på 37 °C under hela inkubationen på 45 minuter.
  7. Alikvot 25 ml PBS i ett 50 ml falkrör och placera i 37 °C vattenbad under inkubationen på 45 minuter.
  8. När inkubationen på 45 minuter är klar tar du bort 24-brunnsplattan och placerar den i huven. Ta bort media som innehåller bakterier från varje brunn genom vakuumambition och byt glasrörspetsar mellan olika stammar.
  9. Tillsätt cirka 1 ml PBS till varje brunn för att tvätta löst vidhäftande bakterier från cellernas yta och ta sedan bort PBS med vakuumambition.
  10. Efter fullständig borttagning av PBS, tillsätt 1 ml DMEM –Ab +Gent till varje brunn. Gentamicin kommer bara att döda de bakterier som förblir utanför cellerna, så de som är intracellulära kommer att förbli livskraftiga.
  11. Placera 24-brunnsplattan tillbaka i inkubatorn och låt inkubera i ytterligare en timme.
  12. Under den timslånga inkubationen bered 14 ml polypropylenrör genom att tillsätta 1 ml sterilt ddH20 till varje rör. Ett rör kommer att krävas för varje täckglas, så för en 24-brunnsplatta, förbered 24 rör totalt.
  13. Efter den timslånga inkubationen, ta bort 24-brunnsplattan från inkubatorn och placera den i huven, tillsammans med rören beredda i steg 5.12.
  14. Använd sterila pincett, ta bort varje täckglas från respektive brunn och placera det omedelbart i ett enskilt rör. Var noga med att doppa pincetterna i etanol och elda dem mellan varje täckglas för att förhindra förorening.
  15. När alla täcken har tagits bort och placerats i enskilda rör kasserar du 24-brunnsplattan.
  16. Gå tillbaka till bänken och virvel varje rör i 5-10 sek.
  17. Ta bort en del från varje rör och placera varje prov i en enskild brunn på en 96-brunnsplatta och späd sedan varje prov med 1:10 utspädningar upp till en utspädning på 1:1 000.
  18. Använd förvärmda och torra LB-plattor och punktplatta var och en av utspädningsserien på agarplattorna. Ett flerkanalsrör kan användas för att plätera 5-10 μl fläckar från varje provs utspädningsserie.
  19. Ta också bort 20 μl prover från varje outspädd brunn och punktplatta denna mängd direkt på LB-agar på en separat platta från utspädningsserien. (Denna större volym kan användas för att räkna upp dåligt invasiva stammar).
  20. När alla prover har prickpläterats kasserar du de 14 ml rör som innehåller täckena. Parafilma 96-brunnsplattan och placera den i en fryslåda vid -80 °C för omformning vid behov.
  21. Låt fläckarna torka helt. Denna process påskyndas kraftigt genom att placera plattorna i huven och ta bort locken.
  22. När fläckarna har torkat, placera plattorna i en 37 °C inkubator över natten.
  23. Följande morgon, räkna antalet kolonier på varje plats i utspädningsserien för vilka koloninummer lätt kan bedömas (mellan cirka 5 och 50 kolonier) (figur 1), och använd serien för att beräkna antalet bakteriella per täckglas för varje bedömd stam.

6. Förbereda stammar av L. monocytogenes för musinfektioner

  1. Natten före infektion, använd en steriliserad slinga för att ta bort enstaka kolonier av de önskade stammarna och inokulera var och en i enskilda 14 ml rör som innehåller 2 ml BHI-buljong.
  2. Placera de inokulerade rören i en inkubator på 37 °C lutad vid 45° och inkubera statiskt (utan skakningar) över natten.
  3. Följande morgon, ta bort odlingsröret från inkubatorn och virveln kort för att säkerställa en enhetlig suspension av bakterierna.
  4. Mät kulturens optiska densitet med hjälp av en spektrofotometer vid 600 nm våglängd. Var noga med att nollställa spektrofotometern med steril BHI-buljong innan du läser av den optiska densiteten. (För L. monocytogenesär den optiska densiteten direkt relaterad till koncentrationen av bakterier per ml, så att en densitet på 1 000 = 1,0 x 109 CFU per ml)
  5. Beräkna mängden kultur som behövs för att infektera varje djur. Injektioner innehåller vanligtvis 200 μl PBS med 10 000 CFU av en enskild stam, vilket innebär en önskad koncentration på 5,00 x 104 CFU/ml.
  6. Ta bort en 5 μl alikvot av varje slutlig utspädning och sprid den direkt på LB-agar.  Inkubera över natten vid 37 °C för att bekräfta den koncentration som används för vaccination.
  7. Injicera varje CFU-suspension inom 1 timme efter utspädning (se nedan).

7. Inokulera L. monocytogenes i möss via svans ven injektion och bedömning bakteriell börda inom lever, mjälte och hjärta

Anm.: Allt djurarbete utförs i enlighet med CDC Biosafety Level 2 riktlinjer.  Möss beställs vanligtvis en vecka i förväg och buras ihop med 5 djur per bur. Möss får acklimatisera sig till den nya laboratoriemiljön i fyra dagar före injektion. Dessa experiment använde 6-8 veckor gamla kvinnliga Swiss-Webster möss som var inrymda 5 till en bur i en barriärmiljö och matade en icke-begränsad kost.

  1. Förbered en bur av möss i taget genom att ta bort locket och mat / vattenbehållare och placera buret under en värmelampa i fem minuter. Denna process gör det möjligt för svansvenerna att vidgas, vilket gör injektioner lättare att utföra.
  2. Ta bort ett djur och placera det i en sele (eller falkrör med änden avskuren) för att hålla fast djuret under injektionen.
  3. Rengör injektionsstället med en alkoholplatta och låt alkoholen avdunsta. Detta rengör inte bara platsen, men utvidgar också svans venen ytterligare.
  4. Använd en 1 ml spruta utrustad med en 27,5 gauge nål, injicera försiktigt musen med 200 μl av önskad kultur i svans venen.
  5. Använd en gasväv för att stoppa blödningar som kan uppstå till följd av injektionen och placera djuret i en ny bur.
  6. Upprepa denna process för de återstående djuren och stammarna. Var noga med att märka varje djurbur med den stam de har fått.
  7. Kontrollera djuren dagligen, ta bort och offra alla djur som verkar vara sjuka.  Om inga djur uppvisar tecken på sjukdom, låt infektionerna fortsätta i 72 timmar innan du offrar alla djur.
  8. För att offra, använd CO2 anestesi från en flaskkälla tills alla andningar har slutat, använd sedan livmoderhalsförskjutning för att säkerställa att djuret är dött.
  9. Efter offer, flytta djuren till en vävnadskulturhuva för dissekering.
  10. Använd ett dissekeringsblock, nåla fast varje djurben med stora mätnålar och spraya djuret med 70% etanol tills det är mättat.
  11. Skär tillbaka bukens och bröstkorgens hud med ett Y-format snitt som sträcker sig från vaginalöppningen upp till xiphoidprocessen och utvecklas sedan upp till axillan på varje arm.
  12. Dra tillbaka huden och ta bort nålarna från varje ben för att hålla dissekeringen öppen.
  13. Skär försiktigt genom bukhinnan och exponera tarmarna, magen, levern och mjälten.
  14. Genom att först skära lever ven och koronar ligament på toppen av levern, börja ta bort levern. Ytterligare ligament som ska tas bort finns under levern, som förbinder den med den första delen av tunntarmen, liksom till muskulaturen på baksidan.
  15. Placera levern i 5 ml sterilt ddH20 i ett 50 ml falkrör.
  16. Ta sedan bort mjälten genom att isolera den och skär försiktigt bort vaskulaturen och ligamenten. Mjälten kommer att avlägsnas lättare än levern. Placera mjälten i ett separat falkrör som innehåller 5 ml steril ddH20.
  17. Placera membranet och skär försiktigt längs bröstkorgen för att visualisera bröstkorgen. Skär genom xiphoidprocessen och bröstbenet till nacken för att öppna bröstkorgen och exponera hjärtat och lungorna.
  18. Använd tång, ta tag i hjärtat försiktigt vid dess spets och lyft det så att aortan och lungkärlen är i spänning. Skär dessa kärl för att frigöra hjärtat.
  19. Placera hjärtat i ett 50 ml falkrör som innehåller 5 ml sterilt ddH20.
  20. Kassera muskroppen och upprepa denna process för varje djur, med rena falkrör som innehåller 5 ml steril ddH20 för varje organ som avlägsnas.
  21. När alla organ har tagits bort, rengör arbetsstationen och återvänd till bänken.
  22. Förbered en uppsättning av 5 rör som ska användas för rengöring och sterilisering av homogenisatorn för varje uppsättning organ från fem möss(dvs. en 5-rörsuppsättning för 5 lever, 5 rör för 5 mjälte och 5 rör för 5 hjärtan). Fyra av rören ska fyllas med 30 ml steril ddH20 och ett ska fyllas med 30 ml 90% EtOH.
  23. Doppa homogenisatorn (medan du kör) i rören som är beredda i steg 7.21 enligt följande för att rengöra sonden med hjälp av en TissueMaster (eller motsvarande homogenisator:
  24. Rör 1 (ddH2O)
    5 sek i rör 2 (ddH2O)
    5 sek i rör 3 (EtOH)
    5 sek i rör 4 (ddH2O)
    5 sek i rör 5 (ddH2O)
  25. Homogenisera en lever med homogenisatorn i minst 2 minuter, eller tills inga synliga delar av organet finns kvar. Använd pincett för att ta bort eventuellt stort skräp från sonden.
  26. Upprepa rengöringsprocessen som beskrivs i steg 7.22
  27. Upprepa homogeniseringsprocessen för de andra leverna, se till att tvätta sonden mellan varje lever med hjälp av processen som beskrivs i steg 7.22.
  28. När alla lever är helt homogeniserade, kassera tvättrören (1-5) för levern.
  29. Upprepa homogeniserings-/rengöringsprocessen för både mjälte och hjärtan också, se till att använda en ny uppsättning tvättrör för varje serie organ. Om tvättrören vid något tillfälle blir grumliga, kassera dem och ersätt med nya rör för att avsluta serien.
  30. När alla organ har homogeniserats, gör en sista rengöringscykel på homogenisatorn och torka den väl för lagring.
  31. Placera ungefär 200 μl av varje organ i en individuell brunn på en 96-brunnsplatta.
  32. Utför seriella utspädningar på organproverna genom att späda ut 1:10 i en serie upp till en utspädning på 1:10 000 (lever och mjälte) eller upp till en utspädning på 1:1 000 (hjärta).
  33. Spotplatta utspädningsserien på förvärmd LB-agar. Ta också bort 20 ul av varje outspädd organ och platta på separata LB-agarplattor för att räkna upp CFU från dåligt koloniserade organ.
  34. Kassera falkrören som innehåller de homogeniserade organen och linda de 96-brunnsplattor som innehåller utspädningsserien med parafilm och placera den i en fryslåda vid -80 °C.
  35. Låt fläckarna torka. Denna process påskyndas genom att plattorna placeras i huven och ta bort locken.
  36. När fläckarna har torkat, placera plattorna i en 37 °C inkubator över natten.
  37. Räkna antalet kolonier på varje plats följande morgon och använd utspädningsserien för att beräkna det totala antalet bakterier per organ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utvalda isolat av L. monocytogenes uppvisar förbättrad invasion av hjärtceller i cellkulturen och i musmodeller av infektion. Figur 1 visar ett exempel på hur bakteriekolonier kan förekomma efter spotplätering av suspensioner på agarmedier. Denna metod möjliggör korrekt bedömning av CFUs i ett prov utan att använda ett stort antal agar mediaplattor. Figur 2 visar ett exempel på en vävnadskulturbaserad analys som jämför stammens förmåga 10403S att invadera hjärtceller med stammen 07PF0776. Mer än dubbelt så många 07PF0776 bakteriell CFU kan återvinnas från infekterade H9c2 hjärtceller efter gentamicin behandling i jämförelse med celler infekterade med 10403S. Skillnader mellan 2 och 4 gånger observeras rutinmässigt för kardiotropa stammar med hjälp av denna analys. Figur 3 visar ett exempel på återhämtning av bakterier från lever, mjälte och hjärtan hos infekterade möss vid 3 dagar efter infektion. Infektion hos möss med den kardiotropa stammen 07PF0776 eller stam 10403S resulterar i jämförbart antal bakterier som återvinns från lever och mjälte av infekterade möss, men möss infekterade med 07PF0776 är mer benägna att ge detekterbara antal bakterier från hjärtat och att uppvisa större bakteriella bördor i detta organ.

Figure 1
Figur 1: Exempel på spotpläteringsteknik för bestämning av bakteriell cfus. H9c2 celler odlas på glas täcklips och smittade med L. monocytogenes var lysed och suspensioner var serially utspädd med 1:10 utspädningar upp till en 1:1,000 utspädning (vänster panel). En flerkanalsrör användes för att pipet 10 ul från varje brunn direkt på en LB agar platta, och plattan inkuberades över natten vid 37 °C (höger panel). Antalet bakterier per täckglas bedöms genom att räkna bakteriell CFU i samband med lämplig utspädning.

Figure 2
Figur 2: L. monocytogenes stam 07PF0776 uppvisar förbättrad invasion av hjärtceller i vävnadskulturen. Invasion analyser utfördes i H9c2 celler med hjälp av en MOI = 100. Grafen visar det genomsnittliga antalet intracellulära bakteriella CFUs återhämtade +/- SE från celler infekterade med 10403S (svart) jämfört med den kardiotropa 07PF0776 stammen (blå). ** anger en betydelse av p <0.01.

Figure 3
Figur 3: L. monocytogenes stam 07PF0776 uppvisar förbättrad invasion av hjärtat i musinfektionsmodeller. Djur inokulerades med 10 000 CFU via svans venen. Infektioner tilläts utvecklas i 72 timmar, då djuren offrades och lever, mjälte och hjärtan samlades in och bearbetades för att bestämma bakteriell CFU per organ. Fasta cirklar representerar CFU som erhålls från enskilda möss, med det genomsnittliga värdet för alla djur inom en grupp som anges med en rad +/- SE. Procentvärdena anger antalet djur som innehåller påvisbar bakteriell CFU i hjärtat. * anger en betydelse av p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. monocytogenes är en utbredd och väl karakteriserad mänsklig patogen, som kan orsaka ett antal olika sjukdom manifestationer15. Bakterien har tidigare beskrivits för sin förmåga att flytta över barriärer, såsom blod-hjärnbarriären och placenta-fetala barriärer, för att nå och kolonisera centrala nervsystemet respektive utveckla fostret. Organismens in vivo-förmåga att kolonisera dessa vävnader kompletteras ofta av en in vitro-förmåga att invadera de representativa cellerna i kulturen som utgör de organ som är riktade. Till exempel har invasion av epitelceller i choroidplexus associerats med organismens förmåga att kolonisera CNS16; och villous trophoblast explants har använts för att representera moderns-fetalabarriären 17. I detta protokoll beskrevs metoder som är användbara för att bedöma bakteriell invasion av hjärtceller i kultur samt för jämförelse av bakteriell kolonisering av hjärtat för enskilda isolat i förhållande till kolonisering av lever och mjälte.

Detta protokoll innehåller ett antal kritiska steg, men bland de mest kritiska är de som innebär användning av rätt bakteriell CFU för antingen infektion av vävnadskulturceller som odlas på täcklips eller infektion hos djur. Om bakteriellt CFU-nummer inte kontrolleras korrekt mellan olika brunnar och djur kan direkta jämförelser mellan prover inte göras. Det är viktigt att dubbelkolla utspädningsserien som används för att generera inokula genom direkt plätering av de slutliga utspädningarna på medieplattor för att garantera att det bakteriella CFU-numret har uppskattats noggrant.

H9c2-cellerna som används i dessa analyser härrör från den nedre halvan av ett 13 dagars embryonalt råtthjärta som mestadels inkluderade ventrikulärvävnad 18. Cellerna förökar sig som mononukleära myoblaster och när de når sammanflöde i vävnadskulturkolvar eller diskar börjar bilda flerkärnade rörstrukturer. Cellerna har en generationstid på cirka 30 timmar18. Serum svält av H9c2 celler har associerats med differentiering av cellerna i skelettmuskulaturceller, medan behandling av myoblaster med 10 nM all-trans retinsyra har associerats med myoblast differentiering i hjärt myocyter14. Detta protokoll var inriktat på L. monocytogenes myoblast cell invasion, men H9c2 cellinjen är en mångsidig cellinje som kan användas för att undersöka effekterna av kontrollerade cell differentiering på bakteriell invasion.

L. monocytogenes stam 07PF0776 isolerades ursprungligen från en HIV-infekterad patient som hade en icke-återupplivningsbar asystolic gripande på grund av att en invasiv L. monocytogenes infektion i hjärtat8. Efterföljande analys av denna stam i mus infektion modeller anges att det hade en förbättrad kapacitet att rikta in sig på och invadera hjärtvävnad. En begränsad analys av ytterligare slumpmässiga isolat av L. monocytogenes tyder på att subpopulationer av bakteriella isolat kan infektera mössens hjärtan i avsaknad av tidigare skador på hjärtvävnad eller hjärtklaffar8. Intressant nog konstaterades två av de bäst karakteriserade L. monocytogenes stammar, 10403S och EGD, vara fattiga kolonisatörer av hjärtceller och vävnad. Genomsekvensering av 07PF0776-isolatet avslöjade inte förekomsten av några nya patogenicitetsöar eller gav bevis på unika genkluster19; detta tyder på att 07PF0776 riktar sig till hjärtceller för invasion genom modifiering av dess befintliga arsenal av virulens genprodukter. Preliminär histokemisk analys visar att 07PF0776 bildar bölder i infekterade mushjärtan som verkar likna den böld som observerats inom den ursprungliga infekterade mänskliga patienten (data visas inte). Huruvida andra cardiotropic L. monocytogenes isolat inducerar liknande hjärt böld bildas återstår att fastställa.

De analyser som presenteras här kan enkelt modifieras för att underlätta undersökningen av olika aspekter av infektion. Enskilda täcken kan fixeras och färgas för antingen ljus- eller fluorescensbaserad mikroskopi, inkubationstider för vävnadskultur kan ökas för mätning och jämförelse av bakterier intracellulära tillväxthastigheter, vävnader och organ kan paraffinbäddas och bearbetas för mikroskopisk undersökning för att undersöka abscessbildning och bakteriell fördelning på cellulär nivå. Vid bedömning av nivåer av bakteriell invasion av vävnadskulturceller eller kolonisering av värdvävnader finns det begränsningar när det gäller den minsta mängd bakterier som varje analys kan upptäcka. In vitro invasion analyser har en lägre gräns för detektion av cirka 300 CFU per coverlip. Om du justerar volymen vatten som används för att virka kan täckglasen öka upptäckten av lågt antal bakterier, med celllysvolymer så låga som 500 μl som visat sig vara användbara för att upptäcka dåligt invasiva stammar. Täcken kan kort doppas i sterilt vatten för att avlägsna överskott av gentamicin före lys av värdceller i mindre volymer. Volymnivåer upp till 5 ml eller mer kan användas för att korrekt räkna upp mycket invasiva stammar. Hos djuren kan organhom homogenater genereras i volymer av 5 ml eller 10 ml ddH20, med lägre volymer som är användbara för att upptäcka lägre bakterienivåer och högre volymer för att bättre räkna upp kraftigt koloniserade organ. Det minsta detektionsområdet för infekterade organ är cirka 100 CFU. Om organ koloniseras konsekvent på höga nivåer, överväg att använda en större volym vatten (10 ml) och utföra fler utspädningar inom 96-brunnsplattan.

De beskrivna metoderna kan tillämpas på organ och vävnader utanför hjärtat. Invasionsanalyser och musinfektioner som dessa har använts för att bedöma kolonisering på en mängd platser, inklusive placenta, hjärna, gallblåsa, lever och tarm. Ändringar av de protokoll som beskrivs ovan kan också göras för att rymma hyperinvasiva och/eller hypervirulenta stammar, och ersättning av hjärtceller med andra celltyper kan göras för att bedöma invasion fenotyper på platser utanför hjärt-kärlsystemet. Eftersom olika celltyper har ändrat känsligheten till L. monocytogenes invasion, justera parametrar såsom MOI och inkubationstider kan vara nödvändigt för att exakt återställa data från analyserna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapporterar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Public Health Service-bidragen AI41816 och AI099339 (N.E.F.) och av F31AI094886-01 (P.D.M.) från NIAID. Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansieringskällorna: s officiella åsikter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Tags

Infektion utgåva 99 Bakteriell patogenes intracellulär patogen vävnadstropism bakterieinvasion hjärtinfektion listerios
Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss <em>med hjälp av Listeria monocytogenes</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter