Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Listeria monocytogenes cause des infections fœtales chez les femmes enceintes et une méningite dans les populations sensibles. Les sous-populations de bactéries peuvent coloniser le tissu cardiaque, provoquant une myocardite chez les patients et les animaux de laboratoire. Ici nous présentons un protocole qui décrit comment évaluer l’invasion de cellules cardiaques de monocytogenes de L. in vitro et la colonisation cardiaque chez les animaux infectés.

Abstract

Listeria monocytogenes est un agent pathogène intracellulaire facultatif à Gram positif capable de causer des infections invasives graves chez les patients immunodéprimés, les personnes âgées et les femmes enceintes. Les manifestations les plus communes de la listériose chez l’homme incluent la méningite, l’encéphalite, et l’avortement foetal. Une conséquence significative mais beaucoup moins documentée de l’infection invahissante de monocytogenes de L. implique le coeur. Le taux de mortalité par maladie cardiaque peut aller jusqu’à 35% malgré le traitement, mais on sait très peu de choses concernant la colonisation du tissu cardiaque par L. monocytogenes et ses pathologies qui en résultent. De plus, il est récemment devenu évident que les sous-populations de L. monocytogenes ont une capacité accrue d’envahir et de croître dans le tissu cardiaque. Ce protocole décrit en détail les méthodes in vitro et in vivo qui peuvent être employées pour évaluer le cardiotropism des isolats de monocytogenes de L. Des méthodes sont présentées pour l’infection des myoblastes cardiaques de rat H9c2 dans la culture de tissu ainsi que pour la détermination de la colonisation bactérienne des coeurs des souris infectées. Ces méthodes sont utiles non seulement pour identifier les souches susceptibles de coloniser le tissu cardiaque chez les animaux infectés, mais peuvent également faciliter l’identification de produits génétiques bactériens qui servent à améliorer l’invasion cellulaire cardiaque et /ou à entraîner des changements dans la pathologie cardiaque. Ces méthodes prévoient également la comparaison directe du cardiotropisme entre plusieurs souches de L. monocytogenes.

Introduction

Listeria monocytogenes est un agent pathogène intracellulaire à Gram positif capable de causer une maladie grave dans les populations réceptives, y compris les personnes âgées, les femmes enceintes, les personnes vivant avec le VIH/sida et les personnes recevant une chimiothérapie1. L’infection dans ces populations est souvent le résultat de l’ingestion de produits alimentaires contaminés, et la plupart des infections sont associées à des éclosions d’origine alimentaire à grande échelle2,3. Chez l’homme et d’autres mammifères, L. monocytogenes est capable de se déplacer à travers la bordure épithéliale de l’intestin grêle, puis d’être transporté vers le foie4,5. Des modèles animaux suggèrent que les bactéries ingérées se répliquent dans les villosités intestinales et transitent vers le foie par la veine portique ou se propagent via les ganglions lymphatiques mésentériques dans la circulation sanguine, conduisant à une dissémination hématogène au foie et à la rate6,7. Dans le foie et la rate, la bactérie est capable de médiatiser l’absorption dans les phagocytes professionnels ainsi que dans les cellules parenchymateuses résidentes, et établit rapidement des infections dans ces organes. À mesure que la charge bactérienne augmente, de nombreuses bactéries sont dispersées dans le sang, où elles sont capables de coloniser davantage les tissus sensibles, y compris le système nerveux central et le placenta (le cas échéant). La colonisation de ces sites exclut les manifestations les plus courantes de listériose chez l’homme, y compris la méningite, l’encéphalite et l’avortement fœtal2.

Il a récemment été démontré que certaines sous-populations de L. monocytogenes ont une capacité accrue d’envahir et de se répliquer dans les tissus cardiaques8. Les manifestations de la participation cardiaque sont variées, et vont de l’endocardite et de la péricardite, à la myocardite fulminante complète avec des anomalies de conduction9-13. Le nombre total de cas cardiaques de L. monocytogenes par an est faible mais peut être sous-estimé car cette facette de l’infection n’est généralement pas bien identifiée. La colonisation du cœur par des agents pathogènes nécessite souvent des prédispositions de l’hôte telles que des dommages valvulaires préexistants ou des valves cardiaques artificielles. Il existe cependant des isolats de L. monocytogenes qui ont été identifiés et qui se distinguent par leur capacité à coloniser le cœur d’animaux infectés en l’absence de dommages cardiaques et/ou d’anomalies8.

Ici sont décrites des méthodes in vitro et in vivo pour évaluer la colonisation bactérienne du tissu cardiaque chez les animaux infectés à l’aide d’essais d’invasion dans la culture tissulaire ainsi que des infections animales vivantes. Ces méthodes se sont avérées utiles non seulement pour identifier les souches ayant le potentiel de coloniser le tissu cardiaque chez les animaux infectés, mais devraient également être utiles pour l’identification des produits génétiques bactériens qui servent à améliorer l’invasion cellulaire cardiaque et /ou entraînent des changements dans la pathologie cardiaque. Ces méthodes facilitent la comparaison du cardiotropisme entre plusieurs souches. Pour les méthodes décrites ici, L. monocytogenes 10403S est utilisé comme représentant bien étudié d’une souche non cardiotrope et l’isolat clinique 07PF0776 est utilisé comme exemple représentatif d’une souche cardiotrope. Ces deux souches ont été choisies pour fournir une comparaison pour l’invasion bactérienne des cellules cardiaques in vitro et la colonisation des cœurs de souris infectées in vivo. L’isolat 07PF0776 est un isolat clinique récupéré d’un abcès interventriculaire qui a causé une arythmie mortelle chez un patient ATTEINT DU VIH+8. Les isolats de L. monocytogenes peuvent varier dans leur potentiel de virulence, et étant donné la propension de Listeria à infecter les personnes immunodéprimées et les femmes enceintes, les personnes de ces populations doivent faire preuve de prudence lorsqu’elles évaluent différents isolats cliniques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Conditions d’entreposage et de culture des souches de L. monocytogenes

  1. Préparez des milieux solides en autoclavant la gélose à perfusion cerveau-cœur (BHI) et en versant le milieu fondu dans des plaques de Pétri. Laisser sécher les plaques pendant la nuit à température ambiante, puis pendant une nouvelle nuit à 37 °C.
  2. À l’aide d’une boucle stérile, obtenir un petit échantillon de L. monocytogenes à partir de stocks congélateurs fabriqués précédemment (bactéries en suspension dans 20 % de glycérol dans un milieu liquide BHI, stockées à -80 °C) ou d’une plaque de gélose contenant des colonies préalablement frappées pour l’isolement.
  3. En utilisant la technique aseptique, stries l’échantillon pour l’isolement de colonie unique. Assurez-vous de stériliser la boucle entre les stries croisées pour éviter le report excessif et assurer l’isolement des colonies individuelles de la souche évaluée. Incuber la ou les plaques pendant la nuit à 37 °C.
  4. À l’aide d’une boucle stérile, retirer une colonie de l’isolat et inoculer 2 ml de bouillon BHI (sans gélose) dans un tube de polystyrène de 14 ml.
  5. Pour les dosages et les infections, incuber la culture de bouillon statiquement (sans secouer) pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C. Pour le stockage d’isolats cultivés, incuber la culture de bouillon à 37 °C en secouant à 180-200 tr/min pendant la nuit. Les cultures peuvent être stockées en ajoutant du glycérol à une concentration finale de 20% et en stockant des tubes scellés à -80 °C indéfiniment.

2. Conditions de stockage et de culture des cellules de type myoblastique cardiaque H9c2

  1. Achetez ou obtenez un stock congelé de cellules H9c2, ainsi que le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dubelco contenant un taux élevé de glucose et de pyruvate, du sérum fœtal bovin (FBS), de la L-glutamine (glut) et un mélange de pénicilline, de streptomycine et de glutamine (PSG).  Fbs, Glut et PSG doivent être stockés à -20 ° C, tandis que le DMEM peut être stocké à 4 ° C. Il est utile de aliquote fbs dans des tubes coniques de 50 ml avant la congélation.
  2. Dans une hotte à flux laminaire, décongeler deux aliquotes de FBS. Ajouter une partie aliquote à une bouteille de 500 ml de DMEM, en faisant un mélange FBS/DMEM à 10 %. A cela, ajoutez 6 ml de Glut et stockez la solution obtenue à 4 °C. Cette solution peut être étiquetée « DMEM sans antibiotiques ». (DMEM –Ab)
  3. À une deuxième bouteille de 500 ml de DMEM, ajouter l’autre aliquote de 50 ml de FBS. Ajouter à cette solution 6 ml de PSG et le stock à 4 °C. Cette solution peut être étiquetée « DMEM avec antibiotiques ». (DMEM +Ab)
  4. Dans la hotte laminaire, retirer 10 ml de DMEM +Ab et placer dans une fiole de culture tissulaire de 25 ml.
  5. En laissant le ballon dans la hotte laminaire, retirer une partie aliquote congelée de cellules H9c2 du stockage dans de l’azote liquide et placer rapidement le tube dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que la culture ait dégelé.
  6. Vaporisez le tube avec 70% d’éthanol à désinfecter, puis retournez à la hotte. En travaillant rapidement pour minimiser le temps cellulaire dans le DMSO concentré, ajoutez la partie aliquote complète des cellules aux 10 ml de DMEM + Ab.  Cela dilue suffisamment le DMSO pour la viabilité et l’adhérence cellulaires pendant la nuit.
  7. Placer le ballon dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C, 5 % C02et 95 % d’humidité pendant la nuit.
  8. Le lendemain matin, vérifiez la couche cellulaire pour vous assurer de l’adhérence. Les cellules seront probablement entre 80-100% confluentes à ce moment-là.
  9. Dans la hotte de culture tissulaire, retirer le milieu contenu dans le ballon à l’aide du vide, en ne laissant que les cellules à l’intérieur du ballon.
  10. Ajouter environ 2 ml de Trypsine-EDTA à 0,25 % dans les cellules et la rocher doucement pendant environ 3 secondes.
  11. Inverser le ballon de telle sorte que la solution de trypsine ne soit plus en contact avec la monocouche et retirer la trypsine sous vide.
  12. Ajouter une deuxième aliquote de 2 ml de trypsine aux cellules et déplacer le ballon vers un microscope inversé. Observez les cellules tout en balançant doucement le ballon pour assurer la dispersion de la monocouche.
  13. Une fois la monocouche dispersée, retournez immédiatement à la hotte de culture tissulaire et ajoutez 4 ml de DMEM +Ab à la suspension cellulaire.
  14. Retirer une partie de 2 ml de la suspension cellulaire et l’ajouter à une fiole de culture tissulaire de 50 ml contenant 23 ml de DMEM +Ab. Balancer doucement le ballon, puis la placer dans l’incubateur de culture tissulaire dans les conditions énumérées à l’étape 2.5.
  15. Vérifiez les cellules quotidiennement jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80% de confluence (environ 2,0-4,0 x 105 cellules par ml). Il est très important que les cellules ne deviennent pas trop confluentes, car elles peuvent se différencier en myotubes de muscle squelettique lorsqu’elles sont privées de FBS pendant de longues périodes de temps14 et cette différenciation peut modifier l’invasion bactérienne.  Surveillez attentivement les cellules et commencez par un nouveau tube de cellules si une culture devient confluente.
  16. Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence, elles peuvent soit être déplacées dans une autre fiole de 50 ml comme cela vient d’être décrit, soit préparées pour le test d’invasion.

3. Préparation des cellules H9c2 pour l’essai d’invasion

  1. Dans la hotte de culture tissulaire, retirer le milieu d’une fiole de 50 ml de cellules H9c2 qui ont atteint 80 % de confluence en utilisant l’aspiration sous vide.
  2. Ajouter 4 ml de solution de Trypsine-EDTA à 0,25% dans la monocouche et retirer immédiatement à l’aide de la sous-aspiration.
  3. Ajouter une autre portion de 4 ml de Trypsine-EDTA à 0,25 % dans le ballon et déplacer le ballon vers un microscope inversé pour observer la dispersion de la monocouche.
  4. Une fois les cellules dispersées, retournez dans le capot et ajoutez 4 ml de DMEM –Ab aux cellules. Pipetter la solution de haut en bas assure l’élimination complète des cellules du fond du ballon.
  5. Après la remise en suspension de la monocouche, retirez toute la suspension et placez-la dans un tube conique de 50 ml.
  6. Retirez une partie de 20 ul de cette suspension et comptez le nombre de cellules par millilitre à l’aide d’un hémocytomètre.
  7. Une fois la concentration de cellules dans la solution déterminée, ajuster la concentration à 2,25 x 104 cellules/ml en ajoutant le volume approprié de solution cellulaire au DMEM frais –Ab. Le volume total de la solution ajustée doit être de 25 ml.
  8. Dans la hotte, stérilisez les lamelle de verre en les trempant dans de l’éthanol à 90% et en passant brièvement chaque lamelle à travers une flamme. Ajouter chaque lamelle de couverture à un puits individuel d’une plaque traitée par culture tissulaire de 24 puits directement après sa stérilisation.
  9. Une fois que tous les puits ont une lamelle individuelle, utilisez une pipette de 25 ml pour ajouter 1 ml de la solution de cellules diluées à chacun des puits de la plaque et poussez chaque lamelle vers le bas avec une aiguille stérile.
  10. Vérifiez chaque puits à l’aide d’un microscope inversé pour vous assurer que des quantités similaires de cellules se trouvent dans chaque puits. Mettez la plaque de 24 puits dans l’incubateur de culture tissulaire pendant la nuit à 37 °C dans 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
  11. Le lendemain matin, regardez chaque puits pour vous assurer que les lamelle de couverture ont des quantités comparables de myoblastes adhérents et que les lamelle ne flottent pas dans le puits.

4. Préparation de souches de L. monocytogenes pour les essais d’invasion

NOTA : Tous les travaux de laboratoire sont effectués conformément aux lignes directrices de niveau 2 des CDC en matière de biosécurité.

  1. Après avoir préparé la plaque de 24 puits pour le dosage, utilisez une boucle stérilisée pour éliminer les colonies individuelles des souches à examiner pour l’invasion bactérienne et inoculer chacune dans des tubes individuels de 14 ml contenant 2 ml de bouillon de BHI.
  2. Placez les tubes inoculés dans un incubateur à 37 °C incliné à 45 ° et incuber statiquement (sans secouer) pendant la nuit.
  3. Le lendemain matin, retirez brièvement le tube de culture de l’incubateur et du vortex pour assurer une suspension uniforme des bactéries.
  4. Mesurer la densité optique de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm. Assurez-vous de mettre à zéro le spectrophotomètre à l’aide d’un bouillon BHI stérile avant de lire la densité optique.
  5. Pour L. monocytogenes, la densité optique est directement liée à la concentration de bactéries par ml, telle qu’une densité de 1.000 = 1.0 x 109 UFC par ml.
  6. Calculer la quantité de culture nécessaire pour infecter 2,25 x 104 cellules avec 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Retirez la quantité de culture nécessaire et placez-la dans un tube de centrifugation de 1,5 ml.
  8. Faites tourner la culture à 19 000 x g pendant 3 min, puis jetez le surnageant. Appuyez sur l’extrémité ouverte du tube contre une serviette en papier afin d’éliminer l’excès de support collé à la lèvre du tube.
  9. Ressusciter les bactéries dans 1 ml de PBS stérile, et vortex pour assurer un mélange suffisant. Ce mélange doit contenir environ 2,25 x 106 UFC par 20 ul (1,125 x 108 UFC/ml).

5. Exécution du test d’invasion

  1. La veille de l’essai d’invasion, préparer des plaques de 24 puits de cellules H9c2 comme décrit à la section 3, et également inoculer un bouillon stérile de BHI avec la ou les souches souhaitées de Listeria, comme décrit à la section 4.
  2. À l’aide du protocole de la section 4, préparer les cultures pbs-remises en suspension des souches à évaluer en cas d’invasion. Remarque : Le titre infectieux peut être évalué à ce stade en plaquant les dilutions de chaque échantillon sur des milieux solides et en énumérant les colonies après une incubation nocturne.
  3. Chargez au moins 20 ul de la solution de bactéries PBS dans les puits individuels de la plaque de 24 puits. Notez qu’au moins trois puits individuels sont nécessaires pour chaque souche afin d’obtenir des résultats en triple exemplaire, de sorte que jusqu’à 8 souches peuvent être évaluées en tandem.
  4. Après avoir chargé les puits avec des bactéries, basculez doucement la plaque pour favoriser la propagation homogène de chaque échantillon dans le puits, et replacez la plaque de 24 puits dans l’incubateur pendant 45 min d’incubation à 37 °C et 95% d’humidité, avec 5% deCO2.
  5. Au cours de cette incubation, préparez une partie aliquote de DMEM – Ab (Section 2) en enlevant simplement 25 ml de DMEM –Ab et en le plaçant dans un tube de faucon de 50 ml (ou équivalent).
  6. Ajouter la gentamicine à la partie aliquote de 25 ml de DMEM –Ab à une concentration de 15 ug/ml (7,5 ul d’une solution mère de 50 mg/ml). Placer la solution de DMEM –Ab +Gent dans un bain d’eau à 37 °C pendant la durée de l’incubation de 45 minutes.
  7. Aliquote 25 ml de PBS dans un tube de faucon de 50 ml et placer dans le bain d’eau à 37 °C pendant les 45 minutes d’incubation.
  8. Une fois l’incubation de 45 minutes terminée, retirez la plaque de 24 puits et placez-la dans le capot. Retirez les milieux contenant des bactéries de chaque puits par aspiration sous vide, en changeant les pointes de pipettes en verre entre les différentes souches.
  9. Ajouter environ 1 ml de PBS à chaque puits afin de laver les bactéries adhérentes de la surface des cellules, puis éliminer le PBS par aspiration sous vide.
  10. Après l’élimination complète du PBS, ajouter 1 ml de DMEM –Ab +Gent à chaque puits. La gentamicine ne tuera que les bactéries qui restent en dehors des cellules, ainsi celles qui sont intracellulaires resteront viables.
  11. Replacez la plaque de 24 puits dans l’incubateur et laissez incuber pendant une heure supplémentaire.
  12. Pendant l’incubation d’une heure, préparer 14 ml de tubes de polypropylène en ajoutant 1 ml de ddH stérile20 à chaque tube. Un tube sera nécessaire pour chaque lamelle de couverture, donc pour une plaque de 24 puits, préparez 24 tubes au total.
  13. Après l’incubation d’une heure, retirez la plaque de 24 puits de l’incubateur et placez-la dans le capot, avec les tubes préparés à l’étape 5.12.
  14. À l’aide d’une pince stérile, retirez chaque lamelle de couverture de son puits respectif et placez-la immédiatement dans un tube individuel. Assurez-vous de tremper la pince à épiler dans de l’éthanol et de les enflammer entre chaque lamelle afin d’éviter toute contamination.
  15. Une fois que toutes les lamelle ont été retirées et placées dans des tubes individuels, jetez la plaque de 24 puits.
  16. Retournez au banc et vortex chaque tube pendant 5-10 sec.
  17. Retirer une portion de chaque tube et placer chaque échantillon dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits, puis diluer en série chaque échantillon en utilisant des dilutions de 1:10 jusqu’à une dilution de 1:1 000.
  18. À l’aide de plaques LB pré-cuites et sèches, plaque spot chacune des séries de dilution sur les plaques de gélose. Un pipet multicanal peut être utilisé pour plaquer des taches de 5 à 10 μl de la série de dilution de chaque échantillon.
  19. Enlevez également les échantillons de 20 μl de chaque puits non dilué et placez cette quantité directement sur la gélose LB sur une plaque distincte de la série de dilution. (Ce volume plus important peut être utilisé pour dénombrer les souches peu invasives).
  20. Une fois que tous les échantillons ont été plaqués spot, jeter les tubes de 14 ml contenant les lamaux de couverture. Parafilmez la plaque de 96 puits et placez-la dans une boîte de congélation à -80 °C pour la replater, si nécessaire.
  21. Laissez les taches sécher complètement. Ce processus est considérablement hâté en plaçant les plaques dans le capot et en enlevant les couvercles.
  22. Une fois les taches séchées, placez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
  23. Le lendemain matin, comptez le nombre de colonies à chaque point de la série de dilution pour lesquelles le nombre de colonies peut être facilement évalué (entre environ 5 et 50 colonies) (figure 1) et utilisez la série pour calculer le nombre de bactéries par lamelle de couverture pour chaque souche évaluée.

6. Préparation des souches de L. monocytogenes pour les infections de souris

  1. La nuit précédant l’infection, utilisez une boucle stérilisée pour éliminer les colonies individuelles des souches souhaitées et inoculer chacune dans des tubes individuels de 14 ml contenant 2 ml de bouillon BHI.
  2. Placez les tubes inoculés dans un incubateur à 37 °C incliné à 45 ° et incuber statiquement (sans secouer) pendant la nuit.
  3. Le lendemain matin, retirez brièvement le tube de culture de l’incubateur et du vortex pour assurer une suspension uniforme des bactéries.
  4. Mesurer la densité optique de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm. Assurez-vous de mettre à zéro le spectrophotomètre à l’aide d’un bouillon BHI stérile avant de lire la densité optique. (Pour L. monocytogenes, la densité optique est directement liée à la concentration de bactéries par ml, telle qu’une densité de 1.000 = 1.0 x 109 UFC par ml)
  5. Calculez la quantité de culture nécessaire pour infecter chaque animal. Les injections contiennent généralement 200 μl de PBS avec 10 000 UFC d’une souche individuelle, ce qui se traduit par une concentration souhaitée de 5,00 x 104 UFC/ml.
  6. Retirer une partie aliquote de 5 μl de chaque dilution finale et l’étaler directement sur la gélose LB.  Incuber pendant une nuit à 37 °C pour confirmer la concentration utilisée pour l’inoculation.
  7. Injecter chaque suspension de UFC dans les 1 heure suivant la dilution (voir ci-dessous).

7. Inoculation de L. monocytogenes chez la souris par injection de veines caudales et évaluation de la charge bactérienne dans le foie, la rate et le cœur

Remarque : Tous les travaux sur les animaux sont effectués conformément aux lignes directrices de niveau de biosécurité 2 des CDC.  Les souris sont généralement commandées une semaine à l’avance et en cage avec 5 animaux par cage. Les souris sont autorisées à s’acclimater au nouvel environnement de laboratoire pendant quatre jours avant l’injection. Ces expériences ont utilisé des souris swiss-webster femelles âgées de 6 à 8 semaines qui ont été logées 5 personnes dans une cage dans un environnement de barrière et nourries avec un régime alimentaire non restreint.

  1. Préparez une cage de souris à la fois en enlevant le couvercle et les bacs de nourriture / eau, et en plaçant la cage sous une lampe chauffante pendant cinq minutes. Ce processus permet aux veines de la queue de se dilater, ce qui rend les injections plus faciles à effectuer.
  2. Retirez un animal et placez-le dans un harnais (ou un tube de faucon dont l’extrémité est coupée) afin de retenir l’animal pendant l’injection.
  3. Nettoyez le site d’injection à l’aide d’un tampon d’alcool et laissez l’alcool s’évaporer. Cela nettoie non seulement le site, mais dilate également davantage la veine de la queue.
  4. À l’aide d’une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de calibre 27,5, injectez doucement à la souris 200 μl de la culture souhaitée dans la veine de la queue.
  5. Utilisez une gaze pour arrêter tout saignement pouvant survenir à la suite de l’injection et placez l’animal dans une cage fraîche.
  6. Répétez ce processus pour les animaux et les souches restants. Assurez-vous d’étiqueter chaque cage d’animaux avec la souche qu’ils ont reçue.
  7. Vérifiez les animaux quotidiennement, en enlevant et en sacrifiant tous les animaux qui semblent être malades.  Si aucun animal ne présente de signes de maladie, laissez les infections se poursuivre pendant 72 heures avant de sacrifier tous les animaux.
  8. Pour sacrifier, utilisez l’anesthésie au CO2 à partir d’une source embouteillée jusqu’à ce que toutes les respirations aient cessé, puis utilisez la luxation cervicale afin de vous assurer que l’animal est mort.
  9. Après le sacrifice, déplacez les animaux vers une hotte de culture tissulaire pour la dissection.
  10. À l’aide d’un bloc de dissection, épinglez chaque jambe de l’animal avec des aiguilles de grande jauge et vaporisez à l’animal 70% d’éthanol jusqu’à ce qu’il soit saturé.
  11. Couper la peau de l’abdomen et du thorax en arrière à l’aide d’une incision en forme de Y qui s’étend de l’ouverture vaginale jusqu’au processus xiphoïde, progressant ensuite jusqu’à l’aisselle de chaque bras.
  12. Retirez la peau et retirez les aiguilles de chaque jambe pour maintenir la dissection ouverte.
  13. Couper doucement à travers le péritoine, exposant les intestins, l’estomac, le foie et la rate.
  14. En coupant d’abord la veine hépatique et le ligament coronal au sommet du foie, commencez à enlever le foie. Des ligaments supplémentaires à enlever se trouvent sous le foie, le reliant à la première section de l’intestin grêle, ainsi qu’à la musculature du dos.
  15. Placer le foie dans 5 ml de ddH20 stérile dans un tube de faucon de 50 ml.
  16. Ensuite, retirez la rate en l’isolant et en coupant doucement la vascularisation et les ligaments. La rate sera enlevée plus facilement que le foie. Placer la rate dans un tube de faucon séparé contenant 5 ml de ddH20 stérile.
  17. Localisez le diaphragme et coupez doucement le long de la cage thoracique afin de visualiser le thorax. Couper à travers le processus xiphoïde et le sternum au niveau du cou afin d’ouvrir le thorax, exposant le cœur et les poumons.
  18. À l’aide de pinces, saisissez doucement le cœur par son apex et soulevez-le de manière à ce que l’aorte et les vaisseaux pulmonaires soient en tension. Coupez ces vaisseaux pour libérer le cœur.
  19. Placer le cœur dans un tube de faucon de 50 ml contenant 5 ml de ddH stérile20.
  20. Jetez la carcasse de la souris et répétez ce processus pour chaque animal, en utilisant des tubes de faucon propres contenant 5 ml de ddHstérile 20 pour chaque organe retiré.
  21. Une fois que tous les organes ont été retirés, nettoyez le poste de travail et retournez au banc.
  22. Préparez un ensemble de 5 tubes à utiliser pour nettoyer et stériliser l’homogénéisateur pour chaque ensemble d’organes de cinq souris(c’est-à-dire un ensemble de 5 tubes pour 5 foies, 5 tubes pour 5 rates et 5 tubes pour 5 cœurs). Quatre de chacun des tubes doivent être remplis de 30 ml stériles ddH2 0,et un doit être rempli de 30 ml 90% EtOH.
  23. À l’aide d’un TissueMaster (ou d’un homogénéisateur équivalent), trempez l’homogénéisateur (en cours d’exécution) dans les tubes préparés à l’étape 7.21 comme suit pour nettoyer la sonde :
  24. Tube 1 (ddH2 O)
    5 sec dans le tube2 (ddH2 O)
    5 sec dans le tube 3 (EtOH)
    5 sec dans le tube 4 (ddH2O)
    5 sec dans le tube 5 (ddH2O)
  25. Homogénéiser un foie à l’aide de l’homogénéisateur pendant au moins 2 min, ou jusqu’à ce qu’il ne reste aucune partie visible de l’organe. Utilisez une pince à épiler pour enlever tout débris important de la sonde.
  26. Répétez le processus de nettoyage décrit à l’étape 7.22
  27. Répéter le processus d’homogénéisation pour les autres foies, en vous assurant de laver la sonde entre chaque foie à l’aide du procédé décrit à l’étape 7.22.
  28. Une fois que tous les foies sont complètement homogénéisés, jetez les tubes à laver (1-5) pour le foie.
  29. Répétez également le processus d’homogénéisation / nettoyage pour la rate et le cœur, en vous assurant d’utiliser un nouvel ensemble de tubes de lavage pour chaque série d’organes. Si, à tout moment, les tubes à laver deviennent troubles, jetez-les et remplacez-les par de nouveaux tubes pour terminer la série.
  30. Une fois que tous les organes ont été homogénéisés, faites un dernier cycle de nettoyage sur l’homogénéisateur et séchez-le bien pour le stockage.
  31. Placer environ 200 μl de chaque organe dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits.
  32. Effectuer des dilutions en série sur les échantillons d’organes en diluant 1:10 dans une série jusqu’à une dilution de 1:10 000 (foie et rate) ou jusqu’à une dilution de 1:1 000 (cœur).
  33. Plaque spot de la série de dilution sur gélose LB préchauffée. Enlevez également 20 ul de chaque organe et plaque non dilués sur des plaques de gélose LB séparées afin d’énumérer l’UFC des organes mal colonisés.
  34. Jeter les tubes de faucon contenant les organes homogénéisés et envelopper les plaques de 96 puits contenant la série de dilution avec du parafilm et les placer dans une boîte de congélation à -80 °C.
  35. Laissez les taches sécher. Ce processus est accéléré en plaçant les plaques dans le capot et en retirant les couvercles.
  36. Une fois les taches séchées, placez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
  37. Comptez le nombre de colonies à chaque endroit le lendemain matin et utilisez la série de dilution pour calculer le nombre total de bactéries par organe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les isolats choisis de monocytogenes de L. montrent l’invasion augmentée des cellules cardiaques dans la culture cellulaire et dans les modèles murins d’infection. La figure 1 montre un exemple de la façon dont les colonies bactériennes peuvent apparaître après le placage ponctuel des suspensions sur un support de gélose. Cette méthode permet une évaluation précise des UFC dans un échantillon sans utiliser un grand nombre de plaques de gélose. La figure 2 montre un exemple d’essai basé sur la culture tissulaire comparant la capacité de la souche 10403S à envahir les cellules cardiaques avec celle de la souche 07PF0776. Plus de deux fois plus de 07PF0776 UFC bactérienne peuvent être récupérées à partir de cellules cardiaques H9c2 infectées après un traitement à la gentamicine par rapport aux cellules infectées par le 10403S. Des différences de 2 à 4 fois sont systématiquement observées pour les souches cardiotropes à l’aide de ce test. La figure 3 montre un exemple de récupération de bactéries du foie, de la rate et du cœur de souris infectées 3 jours après l’infection. L’infection des souris par la souche cardiotrope 07PF0776 ou la souche 10403S entraîne un nombre comparable de bactéries récupérées dans le foie et la rate des souris infectées, mais les souris infectées par la souche 07PF0776 sont plus susceptibles de produire un nombre détectable de bactéries du cœur et de présenter de plus grandes charges bactériennes dans cet organe.

Figure 1
Figure 1 : Exemple de technique de placage ponctuel pour déterminer les UFC bactériennes. Des cellules H9c2 cultivées sur des lamelle de verre et infectées par des monocytogenes de L. ont été lysées et des suspensions ont été diluées en série utilisant des dilutions de 1:10 jusqu’à une dilution de 1:1.000 (panneau gauche). Une pipette multicanal a été utilisée pour pipeter 10 ul de chaque puits directement sur une plaque de gélose LB, et la plaque a été incubée pendant la nuit à 37 °C (panneau de droite). Le nombre de bactéries par lamelle de couverture est évalué en comptant l’UFC bactérienne associée à la dilution appropriée.

Figure 2
Figure 2: La souche 07PF0776 de L. monocytogenes présente une invasion accrue des cellules cardiaques dans la culture tissulaire. Des analyses d’invasion ont été réalisées en cellules H9c2 utilisant un MOI = 100. Le graphique illustre le nombre moyen d’UFC bactériennes intracellulaires récupérées +/- SE à partir de cellules infectées par 10403S (noir) par rapport à la souche cardiotrope 07PF0776 (bleue). ** indique une signification de p <0,01.

Figure 3
Figure 3: La souche 07PF0776 de L. monocytogenes présente une invasion accrue du cœur dans les modèles d’infections murins. Des animaux ont été inoculés avec 10.000 UFC par l’intermédiaire de la veine de queue. On a laissé les infections progresser pendant 72 heures, moment auquel les animaux ont été sacrifiés et les foies, les rates et les cœurs ont été recueillis et traités pour déterminer l’UFC bactérienne par organe. Les cercles pleins représentent l’UFC obtenue à partir de souris individuelles, la valeur moyenne pour tous les animaux d’un groupe est indiquée par une ligne +/- SE. Les valeurs en pourcentage indiquent le nombre d’animaux contenant de l’UFC bactérienne détectable dans le cœur. * indique une signification de p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. monocytogenes est un agent pathogène humain répandu et bien caractérisé, capable de provoquer un certain nombre de manifestations différentes de la maladie15. La bactérie a été précédemment décrite pour sa capacité à se déplacer à travers des barrières, telles que les barrières hémato-encéphaliques et placentaires-fœtales, afin d’atteindre et de coloniser le système nerveux central et le fœtus en développement, respectivement. La capacité in vivo de l’organisme à coloniser ces tissus est souvent complétée par une capacité in vitro à envahir les cellules représentatives en culture qui composent les organes ciblés. Par exemple, l’invasion des cellules épithéliales dans le plexus choroïde a été associée à la capacité de l’organisme à coloniser le SNC16; et des explants trophoblastiques villeux ont été utilisés pour représenter la barrière materno-fœtale17. Dans ce protocole, on a décrit les méthodes qui sont utiles pour évaluer l’invasion bactérienne des cellules de coeur dans la culture aussi bien que pour la comparaison de la colonisation bactérienne du coeur pour des isolats individuels relativement à la colonisation du foie et de la rate.

Ce protocole contient un certain nombre d’étapes critiques, mais parmi les plus critiques figurent celles impliquant l’utilisation de l’UFC bactérienne correcte pour l’infection des cellules de culture tissulaire cultivées sur des lamaux de couverture ou l’infection des animaux. Si le nombre d’UFC bactériennes n’est pas correctement contrôlé entre différents puits et animaux, il est impossible de faire des comparaisons directes entre les échantillons. Il est important de revérifier les séries de dilution utilisées pour générer l’inocula par placage direct des dilutions finales sur les plaques média afin de garantir que le nombre d’UFC bactériens a été estimé avec précision.

Les cellules H9c2 utilisées dans ces essais sont dérivées de la moitié inférieure d’un cœur de rat embryonnaire de 13 jours qui comprenait principalement du tissu ventriculaire18. Les cellules se propagent sous forme de myoblastes mononucléés et, lorsqu’elles atteignent la confluence dans les flacons de culture tissulaire ou les plats, commencent à former des structures tubulaires multinucléées. Les cellules ont une durée de génération d’environ 30 heures18. La famine sérique des cellules H9c2 a été associée à la différenciation des cellules en cellules musculaires squelettiques, tandis que le traitement des myoblastes avec de l’acide rétinoïque 10 nMall-trans a été associé à la différenciation des myoblastes en myocytes cardiaques14. Ce protocole s’est concentré sur l’invasion cellulaire de myoblaste de monocytogenes de L., cependant la variété de cellule H9c2 est une variété de cellule polyvalente qui pourrait être employée pour étudier les effets de la différenciation cellulaire commandée sur l’invasion bactérienne.

La souche 07PF0776 de L. monocytogenes a été isolée à l’origine chez un patient infecté par le VIH qui avait un arrêt asystolique non résusitatable dû à une infection invasive à L. monocytogenes du cœur8. L’analyse subséquente de cette souche dans des modèles d’infection de souris a indiqué qu’elle avait une capacité accrue de cibler et d’envahir le tissu cardiaque. Une analyse limitée d’isolats aléatoires supplémentaires de L. monocytogenes suggère que des sous-populations d’isolats bactériens sont capables d’infecter le cœur de souris en l’absence de tout dommage préalable au tissu cardiaque ou aux valves cardiaques8. Intéressant, deux des meilleures contraintes caractérisées de monocytogenes de L., 10403S et EGD, se sont avérées des colonisateurs pauvres des cellules et des tissus cardiaques. Le séquençage du génome de l’isolat 07PF0776 n’a révélé la présence d’îlots de pathogénicité nouveaux ni fourni de preuves de grappes génétiques uniques19; cela suggère que 07PF0776 cible les cellules cardiaques pour l’invasion par la modification de son arsenal existant de produits de gène de virulence. L’analyse histochimique préliminaire indique que 07PF0776 forme des abcès dans les cœurs de souris infectés qui semblent similaires à l’abcès observé chez le patient humain infecté d’origine (données non présentées). Si d’autres isolats cardiotropic de monocytogenes de L. induisent la formation cardiaque semblable d’abcès reste à déterminer.

Les analyses présentées ici peuvent être facilement modifiées pour faciliter l’examen de différents aspects de l’infection. Les lamelles individuelles peuvent être fixées et colorées pour la microscopie à lumière ou à fluorescence, les temps d’incubation de la culture tissulaire peuvent être augmentés pour la mesure et la comparaison des taux de croissance intracellulaires des bactéries, les tissus et les organes peuvent être incorporés et traités pour un examen microscopique afin d’examiner la formation d’abcès et la distribution bactérienne au niveau cellulaire. Lors de l’évaluation des niveaux d’invasion bactérienne des cellules de culture tissulaire ou de colonisation des tissus hôtes, il existe des limites en termes de quantité minimale de bactéries que chaque essai peut détecter. Les essais d’invasion in vitro ont une limite inférieure de détection d’environ 300 UFC par lamelle de couverture. L’ajustement du volume d’eau utilisé pour faire tourbilloner les lamelles peut améliorer la détection d’un faible nombre de bactéries, les volumes de lyse cellulaire aussi bas que 500 μl s’avérant utiles pour détecter les souches peu invasives. Les lamelle peuvent être brièvement trempées dans de l’eau stérile pour éliminer l’excès de gentamicine avant la lyse des cellules hôtes en plus petits volumes. Des niveaux de volume allant jusqu’à 5 ml ou plus peuvent être utilisés pour dénombrer correctement les souches hautement invasives. Chez les animaux, les homogénats d’organes peuvent être générés envolumes de 5 ml ou 10 ml de ddH2 0, des volumes plus faibles étant utiles pour détecter des niveaux plus faibles de bactéries, et des volumes plus élevés pour mieux dénombrer les organes fortement colonisés. La plage de détection minimale pour les organes infectés est d’environ 100 UFC. Si les organes sont constamment colonisés à des niveaux élevés, envisagez d’utiliser un plus grand volume d’eau (10 ml) et d’effectuer plus de dilutions dans la plaque de 96 puits.

Les méthodes décrites peuvent être appliquées à des organes et des tissus à l’extérieur du cœur. Des essais d’invasion et des infections de souris comme ceux-ci ont été utilisés pour évaluer la colonisation dans une multitude de sites, y compris le placenta, le cerveau, la vésicule biliaire, le foie et l’intestin. Des modifications des protocoles décrits ci-dessus peuvent également être apportées afin d’accueillir des contraintes hyperinvasives et/ou hypervirulentes, et la substitution des cellules cardiaques avec d’autres types de cellules peut être faite pour évaluer des phénotypes d’invasion à des sites en dehors du système cardio-vasculaire. Étant donné que différents types de cellules ont modifié les susceptibilités à l’invasion de L. monocytogenes, l’ajustement des paramètres tels que le MOI et les temps d’incubation peut être nécessaire afin de récupérer avec précision les données des essais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne font état d’aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions ai41816 et AI099339 (N.E.F.) du Service de santé publique et par F31AI094886-01 (P.D.M.) du NIAID. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des sources de financement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Tags

Infection Numéro 99 Pathogenèse bactérienne agent pathogène intracellulaire tropisme tissulaire invasion bactérienne infection cardiaque listériose
Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide <em>de Listeria monocytogenes</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter