Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering bakteriel invasion af hjerteceller i kultur og hjerte kolonisering i inficerede mus ved hjælp af Listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Listeria monocytogenes forårsager fosterinfektioner hos gravide kvinder og meningitis hos modtagelige befolkningsgrupper. Subpopulationer af bakterier kan kolonisere hjertevæv, forårsager myocarditis hos patienter og forsøgsdyr. Her præsenterer vi en protokol, der beskriver, hvordan man vurderer L. monocytogenes hjertecelleinvasion in vitro og hjertekolonisering hos inficerede dyr.

Abstract

Listeria monocytogenes er et Gram-positivt fakultets intracellulært patogen, der er i stand til at forårsage alvorlige invasive infektioner hos immunkompromitterede patienter, ældre og gravide kvinder. De mest almindelige manifestationer af listeriose hos mennesker omfatter meningitis, encephalitis og fosterabort. En betydelig, men langt mindre dokumenteret sequelae af invasive L. monocytogenes infektion involverer hjertet. Dødeligheden fra hjertesygdomme kan være op til 35% på trods af behandling, men meget lidt er kendt med hensyn til L. monocytogenes kolonisering af hjertevæv og dets deraf følgende patologier. Derudover er det for nylig blevet klart, at delpopulationer af L. monocytogenes har en øget kapacitet til at invadere og vokse inden for hjertevæv. Denne protokol beskriver i detaljer in vitro- og in vivo-metoder, der kan bruges til vurdering af kardiotropisme af L. monocytogenes isolater. Metoder præsenteres for infektion af H9c2 rotte hjerte myoblaster i vævskultur samt til bestemmelse af bakteriel kolonisering af hjerter af inficerede mus. Disse metoder er nyttige ikke kun til at identificere stammer med potentiale til at kolonisere hjertevæv hos inficerede dyr, men kan også lette identifikationen af bakterielle genprodukter, der tjener til at forbedre hjertecelleinvasion og / eller drive ændringer i hjertepatologi. Disse metoder giver også mulighed for direkte sammenligning af kardiotropisme mellem flere L. monocytogenes stammer.

Introduction

Listeria monocytogenes er et Gram-positivt intracellulært patogen, der kan forårsage alvorlig sygdom hos modtagelige befolkningsgrupper, herunder ældre, gravide kvinder, hiv/aids-personer og personer, der får kemoterapi1. Infektion i disse populationer er ofte et resultat af indtagelse af forurenede fødevarer, og de fleste infektioner er forbundet med store fødevarebårne udbrud2,3. Hos mennesker og andre pattedyr er L. monocytogenes i stand til at translokere over tyndtarmens epitelkant og derefter transporteres til leveren4,5. Dyremodeller tyder på, at indtagede bakterier replikeres i tarmens villi og transit til leveren gennem portalvenen eller spredes via de mesenteriske lymfeknuder i blodet, hvilket fører til hæmatotogen formidling til leveren og milt6,7. I leveren og milten er bakterien i stand til at formidle optagelse i både professionelle fagocytter såvel som bosiddende parenchymale celler og etablerer hurtigt infektioner i disse organer. Efterhånden som bakteriebelastningen øges, spredes mange bakterier tilbage i blodet, hvor de er i stand til yderligere at kolonisere modtagelige væv, herunder centralnervesystemet og moderkagen (hvor de er til stede). Kolonisering af disse steder udelukker de mest almindelige manifestationer af listeriose hos mennesker, herunder meningitis, encephalitis og fosterabort2.

Udvalgte delpopulationer af L. monocytogenes har for nylig vist sig at have en øget kapacitet til at invadere og replikere i hjertevæv8. Manifestationer af hjerte involvering er varierede, og spænder fra endocarditis og pericarditis, til fulminant myocarditis komplet med ledning abnormiteter9-13. Det samlede antal L. monocytogenes hjertetilfælde om året er lavt, men kan være undervurderet, da denne facet af infektion er ikke generelt anerkendt. Kolonisering af hjertet af patogener kræver ofte værtsdispositioner såsom allerede eksisterende valvular skader eller kunstige hjerteklapper. Der er dog isolater af L. monocytogenes, der er blevet identificeret, der er bemærkelsesværdige for deres evne til at kolonisere hjerter af inficerede dyr i mangel af hjerteskader og / eller abnormiteter8.

Heri er beskrevet in vitro og in vivo metoder til vurdering af bakteriel kolonisering af hjertevæv i inficerede dyr ved hjælp af invasionsanalyser i vævskultur samt levende dyreinfektioner. Disse metoder har vist sig nyttige til ikke kun at identificere stammer med potentiale til at kolonisere hjertevæv hos inficerede dyr, men bør også være nyttige til identifikation af bakterielle genprodukter, der tjener til at forbedre hjertecelleinvasion og / eller resultere i ændringer i hjertepatologi. Disse metoder letter sammenligningen af kardiotropisme mellem flere stammer. For de metoder, der er beskrevet her, anvendes L. monocytogenes 10403S som en velunderprøvet repræsentant for en ikke-kardiotropisk stamme, og det kliniske isolate 07PF0776 bruges som et repræsentativt eksempel på en kardiotropisk stamme. Disse to stammer blev valgt til at give en sammenligning for bakteriel invasion af hjerteceller in vitro og kolonisering af hjerter af inficerede mus in vivo. Den isolere 07PF0776 er en klinisk isolere inddrives fra en mellemliggende byld, der forårsagede en dødelig arytmi i en HIV + patient8. L. monocytogenes isolater kan variere i deres virulens potentiale, og i betragtning af tilbøjeligheden til Listeria at inficere personer med immunosuppression og gravide kvinder, personer i disse populationer bør udvise forsigtighed, mens vurderingen af forskellige kliniske isolater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opbevarings- og kulturforhold for L. monocytogenes stammer

  1. Forbered solide medier ved autoklavering hjerne-hjerte infusion agar (BHI) og hælde smeltet medier i petriskåle. Lad pladerne tørre natten over ved stuetemperatur, og overnatter derefter igen ved 37 °C.
  2. Ved hjælp af en steril løkke udtages en lille prøve L. monocytogenes fra enten tidligere fremstillede fryselagre (bakterier suspenderet i 20% glycerol i BHI flydende medier, opbevaret ved -80 °C) eller fra en agarplade indeholdende kolonier, der tidligere er ramt for isolation.
  3. Brug aseptisk teknik, streak prøven for enkelt koloni isolation. Sørg for at sterilisere løkken mellem tværstriber for at forhindre overskydende fremførsel og sikre isolering af individuelle kolonier af den stamme, der vurderes. Pladen/pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
  4. Ved hjælp af en steril løkke fjernes en koloni af det isolat og podes 2 ml BHI bouillon (uden agar) i et 14 ml polystyrenrør.
  5. For assays og infektioner inkuberes bouillonkulturen statisk (uden at ryste) natten over i en 37 °C inkubator. Til oplagring af dyrkede isolater inkuberes bouillonkulturen ved 37 °C med rysten ved 180-200 omdrejninger natten over. Kulturer kan oplagres ved at tilsætte glycerol til en endelig koncentration på 20% og opbevare forseglede rør ved -80 °C på ubestemt tid.

2. Opbevaring og dyrkning betingelser for H9c2 Hjerte Myoblast-lignende celler

  1. Køb eller få en frossen bestand af H9c2-celler samt Dubelco's Modified Eagle's Medium (DMEM), der indeholder høj glukose og pyruvat, FBS (Fetal Bovine Serum), L-glutamin (Glut) og en Penicillin-Streptomycin-Glutamine blandinger (PSG).  FBS, Glut og PSG skal være på lager ved -20 °C, mens DMEM kan opbevares ved 4 °C. Det er nyttigt at aliquot FBS i 50 ml koniske rør før frysning.
  2. I en laminar flow hætte, optø to aliquots af FBS. Der tilsættes en aliquot til en 500 ml flaske DMEM, hvilket giver en blanding på 10% FBS/DMEM. Til dette tilsættes 6 ml glut og den resulterende opløsning oplagres ved 4 °C. Denne løsning kan mærkes "DMEM uden antibiotika." (DMEM -Ab)
  3. Til en anden 500 ml flaske DMEM tilsættes de øvrige 50 ml aliquot FBS. Til denne opløsning tilsættes 6 ml PSG og lager ved 4 °C. Denne løsning kan mærkes "DMEM med antibiotika." (DMEM +Ab)
  4. Mens du er i laminarhætten, fjernes 10 ml DMEM +Ab og anbringes i en 25 ml vævskulturkolbe.
  5. Kolben efterlades i laminarhætten, fjernes en frossen prøve af H9c2-celler fra opbevaring i flydende nitrogen, og røret anbringes hurtigt i et 37 °C vandbad, indtil kulturen er optøet.
  6. Sprøjt røret med 70% ethanol for at desinficere, og vend derefter tilbage til emhætten. Arbejd hurtigt for at minimere celletid i koncentreret DMSO, tilsæt den fulde aliquot af celler til 10 ml DMEM +Ab.  Dette fortynder DMSO tilstrækkeligt til natten celle levedygtighed og overholdelse.
  7. Kolben anbringes i en vævskulturinkubator ved 37 °C, 5 % C02og 95 % fugtighed natten over.
  8. Den følgende morgen skal du kontrollere cellelaget for at sikre overholdelse. Celler vil sandsynligvis være mellem 80-100% sammenflydende på dette tidspunkt.
  9. I vævskulturhætten fjernes de medier, der er indeholdt i kolben, ved hjælp af vakuumet, så kun cellerne i kolben efterlades.
  10. Der tilsættes ca. 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA til cellerne og klippes forsigtigt i ca. 3 sek.
  11. Inverter kolben således, at trypsinopløsningen ikke længere er i kontakt med monolayeren, og fjern trypsinen ved vakuum.
  12. Der tilsættes en anden 2 ml prøvetagning til cellerne, og kolben flyttes til et omvendt mikroskop. Overhold cellerne, mens du forsigtigt vugger kolben for at sikre, at monolaget spredes.
  13. Når monolayeren er spredt, skal du straks vende tilbage til vævskulturhætten og tilsætte 4 ml DMEM +Ab til celleaffjedringen.
  14. En 2 ml del af celleophænget fjernes, og der tilsættes den til en 50 ml vævskulturkolbe, der indeholder 23 ml DMEM +Ab. Kolben rystes forsigtigt, og derefter anbringes den i vævskulturinkubatoren under de betingelser, der er anført i trin 2.5.
  15. Kontroller cellerne dagligt, indtil de når ca. 80% sammenløb (ca. 2,0-4,0 x 105 celler pr. ml). Det er meget vigtigt, at cellerne ikke bliver for sammenflydende, da de kan differentiere sig til skeletmuskulatur myotuber, når de sultes af FBS i længere tid14, og denne differentiering kan ændre bakterieinvasion.  Overvåg cellerne omhyggeligt og start med et nyt rør af celler, hvis en kultur bliver sammenflydende.
  16. Når cellerne når 80% sammenløb, kan de enten føres ind i en anden 50 ml kolbe som netop beskrevet, eller forberedt til invasion assay.

3. Forberedelse H9c2 Celler til Invasion Assay

  1. I vævskulturhætten skal du fjerne mediet fra en 50 ml kolbe H9c2-celler, der har nået 80% sammenløb ved hjælp af vakuum aspiration.
  2. Der tilsættes 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA-opløsning til monolayeren, og der fjernes straks ved hjælp af vakuum aspiration.
  3. Der tilsættes yderligere 4 ml portion 0,25% Trypsin-EDTA til kolben, og kolben flyttes til et omvendt mikroskop for at observere monolagsspredningen.
  4. Når cellerne er spredt, vende tilbage til emhætten og tilsæt 4 ml DMEM-Ab til cellerne. Pipettering af opløsningen op og ned sikrer fuldstændig fjernelse af celler fra bunden af kolben.
  5. Efter resuspension af monolayer, fjerne alle suspensionen og læg den i en 50 ml konisk rør.
  6. Fjern en 20 ul del af denne suspension og tælle antallet af celler pr milliliter ved hjælp af en hæmocytometer.
  7. Når koncentrationen af celler i opløsningen er bestemt, justeres koncentrationen til 2,25 x 104 celler/ml ved at tilsætte det relevante rumfang af celleopløsningen til frisk DMEM -Ab. Det samlede volumen af den justerede opløsning skal være 25 ml.
  8. Mens der i emhætten, sterilisere glas coverslips ved at dyppe dem i 90% Ethanol og kort passerer hver coverslip gennem en flamme. Tilsæt hver coverslip til en individuel brønd af en 24-brønds vævskulturbehandlet plade umiddelbart efter, at den er steriliseret.
  9. Når alle brønde har en individuel coverlip, skal du bruge en 25 ml pipet til at tilføje 1 ml af den fortyndede celleopløsning til hver af brøndene i pladen og skubbe hver coverlip ned med en steril nål.
  10. Kontroller hver brønd ved hjælp af et omvendt mikroskop for at sikre, at lignende mængder celler er i hver brønd. Sæt 24-brøndpladen i vævskulturinkubatoren natten over ved 37 °C i 5% CO2 og 95% fugtighed.
  11. Den følgende morgen, se hver brønd for at sikre, at coverslips har sammenlignelige mængder af vedhængende myoblaster, og at coverslips ikke flyder i brønden.

4. Forberedelse Stammer af L. monocytogenes for Invasion Assays

BEMÆRK: Alt laboratoriearbejde udføres i overensstemmelse med CDC's retningslinjer for biosikkerhedsniveau 2.

  1. Efter at have forberedt 24-brøndspladen til analyse, skal du bruge en steriliseret løkke til at fjerne enkelte kolonier af de stammer, der skal undersøges for bakteriel invasion og pode hver i individuelle 14 ml rør, der indeholder 2 ml BHI bouillon.
  2. De podede rør anbringes i en 37 °C inkubator, der vippes ved 45° og inkuberes statisk (uden rysten) natten over.
  3. Den følgende morgen skal du fjerne dyrkningsrøret fra inkubatoren og vortex kort for at sikre ensartet suspension af bakterierne.
  4. Den optiske tæthed af kulturen måles ved hjælp af et spektrofotometer ved 600 nm bølgelængde. Sørg for at nulstille spektrofotometeret ved hjælp af steril BHI-bouillon, før du læser den optiske tæthed.
  5. For L. monocytogeneser den optiske massefylde direkte relateret til koncentrationen af bakterier pr. ml, således at en massefylde på 1,000 = 1,0 x 109 CFU pr. ml.
  6. Beregn den mængde kultur, der er nødvendig for at inficere 2,25 x 104 celler med 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Fjern den nødvendige mængde kultur og læg den i et 1,5 ml centrifugerør.
  8. Drej kulturen på 19.000 x g i 3 min, og kassér derefter supernatanten. Tryk på den åbne ende af røret mod et køkkenrulle for at fjerne overskydende medier, der sidder fast på rørets læbe.
  9. Resuspend bakterierne i 1 ml steril PBS, og vortex at sikre tilstrækkelig blanding. Denne blanding skal indeholde ca. 2,25 x 106 CFU pr. 20 ul (1,125 x 108 CFU/ml).

5. Udførelse af invasionen Assay

  1. Dagen før invasionsanalysen skal du forberede 24-brønds plader af H9c2-celler som beskrevet i afsnit 3 og også vaccinere steril BHI-bouillon med den eller de ønskede stammer af Listeria som beskrevet i afsnit 4.
  2. Ved hjælp af protokollen i afsnit 4, forberede PBS-genopbrugte kulturer af stammerne, der skal vurderes for invasion. Bemærk: Infektiøs titer kan vurderes på dette tidspunkt ved at plating fortyndinger af hver prøve på faste medier og opregne kolonier efter natten inkubation.
  3. 20 ul af PBS-bakterieopløsningen læsses i individuelle brønde på 24-brøndspladen. Bemærk, at der er behov for mindst tre individuelle brønde for hver stamme for at opnå resultater i tre eksemplarer, så op til 8 stammer kan vurderes i tandem.
  4. Efter at brøndene er lastet med bakterier, skal pladen forsigtigt klippes for at tilskynde til ensartet spredning af hver prøve i brønden og placere 24-brøndspladen tilbage i inkubatoren i 45 minutters inkubation ved 37 °C og 95% fugtighed med 5% CO2.
  5. Under denne inkubation fremstilles et aliquot af DMEM – Ab (afsnit 2) ved blot at fjerne 25 ml DMEM-Ab og placere det i et 50 ml falkerør (eller tilsvarende).
  6. Der tilsættes gentamicin til 25 ml DMEM –Ab aliquot til en koncentration på 15 mg/ml (7,5 ul af en 50 mg/ml stamopløsning). Dmem-Ab +Gent-opløsningen anbringes i et vandbad på 37 °C i hele 45 min. inkubationen.
  7. 25 ml PBS til et 50 ml falkerør til en 50 ml og anbringes i vandbadet på 37 °C under inkubationen på 45 minutter.
  8. Når 45 minutters inkubation er færdig, skal du fjerne 24-brøndspladen og placere den i emhætten. Fjern medier, der indeholder bakterier fra hver brønd ved vakuum aspiration, skiftende glas pipet tips mellem forskellige stammer.
  9. Tilsæt ca. 1 ml PBS til hver brønd for at vaske løst klæbende bakterier fra overfladen af cellerne, og fjern derefter PBS ved hjælp af vakuum aspiration.
  10. Efter fuldstændig fjernelse af PBS tilsættes 1 ml DMEM –Ab +Gent til hver brønd. Den gentamicin vil kun dræbe de bakterier, der forbliver uden for cellerne, således dem, der er intracellulære vil forblive levedygtige.
  11. Placer 24-brøndspladen tilbage i inkubatoren og lad den inkubere i yderligere en time.
  12. I løbet af den timelange inkubation fremstilles 14 ml polypropylenrør ved tilsætning af 1 ml steril ddH20 til hvert rør. Et rør vil være påkrævet for hver coverlip, så for en 24-brønds plade, forberede 24 rør i alt.
  13. Efter den timelange inkubation skal du fjerne 24-brøndspladen fra inkubatoren og placere den i emhætten sammen med rørene tilberedt i trin 5.12.
  14. Brug steril pincet, fjern hver coverlip fra sin respektive brønd og læg den straks i et individuelt rør. Sørg for at dyppe pincet i ethanol og flamme dem mellem hver coverlip for at forhindre forurening.
  15. Når alle coverlips er blevet fjernet og placeret i individuelle rør, kassér 24-brøndspladen.
  16. Vend tilbage til bænken og vortex hvert rør i 5-10 sek.
  17. Fjern en portion fra hvert rør, og placer hver prøve i en individuel brønd på en 96-brønds plade, og fortynd derefter hver prøve serielt med 1:10 fortyndinger op til en 1:1.000 fortynding.
  18. Ved hjælp af forvarmede og tørre LB-plader skal du få øje på hver af fortyndingsserien på agarpladerne. En multikanalpipet kan bruges til at pladen 5-10 μl pletter fra hver prøves fortyndingsserie.
  19. Der udtages også 20 μl prøver fra hver ufortyndet brønd, og denne mængde er direkte på LB agar på en separat plade fra fortyndingsserien. (Denne større mængde kan bruges til at opregne dårligt invasive stammer).
  20. Når alle prøverne er blevet punktbelagt, kasseres de 14 ml rør, der indeholder dækslerne. Parafilm 96-brøndspladen, og læg den i en frysekasse ved -80 °C for om nødvendigt at replatere.
  21. Lad pletterne tørre helt. Denne proces fremskyndes meget ved at placere pladerne i emhætten og fjerne lågene.
  22. Når pletterne er tørret, anbringes pladerne i en 37 °C inkubator natten over.
  23. Den følgende morgen tælles antallet af kolonier på hvert sted i fortyndingsserien, for hvilke koloninumre let kan vurderes (mellem ca. 5 og 50 kolonier) (figur 1), og serien bruges til at beregne antallet af bakterielle per coverslip for hver vurderet stamme.

6. Forberedelse Stammer af L. monocytogenes for museinfektioner

  1. Natten før infektion skal du bruge en steriliseret løkke til at fjerne enkelte kolonier af de ønskede stammer og vaccinere hver i individuelle 14 ml rør, der indeholder 2 ml BHI bouillon.
  2. De podede rør anbringes i en 37 °C inkubator, der vippes ved 45° og inkuberes statisk (uden rysten) natten over.
  3. Den følgende morgen skal du fjerne dyrkningsrøret fra inkubatoren og vortex kort for at sikre en ensartet suspension af bakterierne.
  4. Den optiske tæthed af kulturen måles ved hjælp af et spektrofotometer ved 600 nm bølgelængde. Sørg for at nulstille spektrofotometeret ved hjælp af steril BHI-bouillon, før du læser den optiske tæthed. (For L. monocytogeneser den optiske massefylde direkte relateret til koncentrationen af bakterier pr. ml, således at en massefylde på 1,000 = 1,0 x 109 CFU pr. ml)
  5. Beregn mængden af kultur, der er nødvendig for at inficere hvert dyr. Injektioner indeholder typisk 200 μl PBS med 10.000 CFU af en individuel stamme, hvilket svarer til en ønsket koncentration på 5,00 x 104 CFU/ml.
  6. En 5 μl aliquot af hver endelig fortynding og smørpladen fjernes direkte på LB agar.  Inkuber natten over ved 37 °C for at bekræfte den koncentration, der anvendes til podning.
  7. Indsprøjt hver CFU-affjedring inden for 1 time efter fortynding (se nedenfor).

7. Podning L. monocytogenes i mus via Hale Vene Injektion og vurdering bakteriel byrde i leveren, milten, og Heart

Bemærk: Alt dyrearbejde udføres i overensstemmelse med CDC's retningslinjer for biosikkerhedsniveau 2.  Mus bestilles typisk en uge i forvejen og bures sammen med 5 dyr pr. Bur. Mus får lov til at akklimatisere sig til det nye laboratoriemiljø i fire dage før injektion. Disse eksperimenter brugte 6-8 uger gamle kvindelige schweiziske-Webster mus, der var opstaldet 5 til et bur i en barriere miljø og fodret med en ikke-begrænset kost.

  1. Forbered et bur af mus ad gangen ved at fjerne låget og mad / vandbeholdere og placere buret under en varmelampe i fem minutter. Denne proces giver mulighed for hale vener til at udvide, hvilket gør injektioner lettere at udføre.
  2. Fjern et dyr og læg det i en sele (eller falkerør med enden afskåret) for at fastholde dyret under injektionen.
  3. Rengør injektionsstedet ved hjælp af en alkoholpude, og lad alkoholen fordampe. Dette renser ikke kun stedet, men udvider også yderligere haleåren.
  4. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte udstyret med en 27,5 gauge nål, injiceres forsigtigt musen med 200 μl af den ønskede kultur i haleåren.
  5. Brug en gaze til at stoppe enhver blødning, der kan opstå som følge af injektionen, og læg dyret i et frisk bur.
  6. Gentag denne proces for de resterende dyr og stammer. Sørg for at mærke hvert bur af dyr med den stamme, de har modtaget.
  7. Kontroller dyrene dagligt, fjerne og ofre eventuelle dyr, der synes at være i syge.  Hvis ingen dyr udviser tegn på sygdom, skal du lade infektionerne fortsætte i 72 timer, før de ofrer alle dyr.
  8. For at ofre, brug CO2 anæstesi fra en flaskekilde, indtil alle respirationer er stoppet, og brug derefter cervikal dislokation for at sikre, at dyret er dødt.
  9. Efter ofringen skal du flytte dyrene til en vævskulturhætte til dissektion.
  10. Ved hjælp af en dissektionsblok fastgøres hvert ben af dyret med store målernåle og sprøjter dyret med 70% ethanol, indtil det er mættet.
  11. Skær huden i maven og brystkassen tilbage ved hjælp af et Y-formet snit, der strækker sig fra vaginal åbning til xiphoid processen, skrider derefter op til axillaen på hver arm.
  12. Træk huden tilbage og fjern nålene fra hvert ben for at holde dissektionen åben.
  13. Skær forsigtigt gennem bughinden, udsætter tarmene, maven, leveren og milten.
  14. Ved først at skære den leveråre og koronar ledbånd øverst i leveren, begynder at fjerne leveren. Yderligere ledbånd, der skal fjernes, findes under leveren, der forbinder den til den første del af tyndtarmen, samt til ryggens muskulatur.
  15. Leveren anbringes i 5 ml steril ddH20 i et 50 ml falkerør.
  16. Fjern derefter milten ved at isolere den og forsigtigt skære vaskulaturen og ledbåndene væk. Milten vil blive fjernet lettere end leveren. Milten anbringes i et separat falkerør med en steril ddHpå 5ml 2 0.
  17. Find mellemgulvet og skær forsigtigt langs brystkassen for at visualisere brystkassen. Skær gennem xiphoidprocessen og brystbenet til nakken for at åbne brystkassen og udsætte hjertet og lungerne.
  18. Brug pincet, tag hjertet forsigtigt ved dets spids, og løft det på en sådan måde, at aorta- og lungekarrene er i spænding. Skær disse fartøjer for at befri hjertet.
  19. Hjertet anbringes i et 50 ml falkerør, der indeholder 5 ml steril ddH20.
  20. Musekroppen kasseres, og denne proces gentages for hvert dyr ved hjælp af rene falkerør, der indeholder 5 ml steril ddH20 for hvert fjernet organ.
  21. Når alle organer er fjernet, skal du rengøre arbejdsstationen og vende tilbage til bænken.
  22. Forbered et sæt af 5 rør, der skal anvendes til rengøring og sterilisering af homogenisatoren for hvert sæt organer fra fem mus(dvs. et 5 rørsæt til 5 lever, 5 rør til 5 milt og 5 rør til 5 hjerter). Fire af rørene skal fyldes med 30 ml steril ddH20, og et skal fyldes med 30 ml 90% EtOH.
  23. Ved hjælp af en TissueMaster (eller tilsvarende homogenisator) dyppes homogenisatoren (under løb) i de rør, der fremstilles i trin 7.21, som følger for at rengøre sonden:
  24. Rør 1 (ddH2O)
    5 sek i Tube 2 (ddH2O)
    5 sek i Tube 3 (EtOH)
    5 sek i Tube 4 (ddH2O)
    5 sek i Tube 5 (ddH2O)
  25. Homogeniser en lever ved hjælp af homogenisatoren i mindst 2 minutter, eller indtil der ikke er nogen synlige dele af organet tilbage. Brug pincet til at fjerne store rester fra sonden.
  26. Gentag den rengøringsproces, der er beskrevet i trin 7.22
  27. Gentag homogeniseringsprocessen for de andre lever, og sørg for at vaske sonden mellem hver lever ved hjælp af den proces, der er beskrevet i trin 7.22.
  28. Når alle leveren er fuldstændig homogeniseret, kassér vaskerørene (1-5) til leveren.
  29. Gentag homogenisere / ren proces for både milt og hjerter så godt, og sørg for at bruge et nyt sæt af vaskerør for hver serie af organer. Hvis vaskerørene på noget tidspunkt bliver uklare, skal de kasseres og udskiftes med nye rør for at afslutte serien.
  30. Når alle organerne er blevet homogeniseret, skal du gøre en sidste rengøringscyklus på homogenisatoren og tørre den godt til opbevaring.
  31. Der anbringes ca. 200 μl af hvert organ i en individuel brønd på en 96-brønds plade.
  32. Udfør serielle fortyndinger på organprøverne ved at fortynde 1:10 i en serie op til en 1:10,000 fortynding (lever og milt) eller op til en 1:1,000 fortynding (hjerte).
  33. Spotplade fortyndingsserien på forvarmet LB agar. Fjern også 20 ul af hvert ufortyndet organ og plade på separate LB agar plader for at opregne CFU fra dårligt koloniserede organer.
  34. Falkerørene med de homogeniserede organer kasseres, og de 96-brøndsplader, der indeholder fortyndingsserien, pakkes ind i parafilmen, og den anbringes i en fryserboks ved -80 °C.
  35. Lad pletterne tørre. Denne proces fremskyndes ved at placere pladerne i emhætten og fjerne lågene.
  36. Når pletterne er tørret, anbringes pladerne i en 37 °C inkubator natten over.
  37. Tæl antallet af kolonier på hvert sted den følgende morgen og brug fortyndingsserien til at beregne det samlede antal bakterier pr. organ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udvalgte isolater af L. monocytogenes udviser øget invasion af hjerteceller i cellekultur og i musemodeller af infektion. Figur 1 viser et eksempel på, hvordan bakteriekolonier kan forekomme efter spot plating af suspensioner på agar medier. Denne metode giver mulighed for nøjagtig vurdering af CFU'er i en prøve uden brug af et stort antal agarmedieplader. Figur 2 viser et eksempel på en vævskulturbaseret analyse, der sammenligner belastningens evne til at invadere hjerteceller med belastningen 07PF0776. Mere end dobbelt så mange 07PF0776 bakteriel CFU kan inddrives fra inficerede H9c2 hjerteceller efter gentamicin behandling i forhold til celler inficeret med 10403S. Forskelle på 2 til 4 gange er rutinemæssigt observeret for kardiotrope stammer ved hjælp af denne analyse. Figur 3 viser et eksempel på genvinding af bakterier fra lever, milt og hjerter af inficerede mus ved 3 dage efter infektion. Infektionen af mus med den kardiotrope stamme 07PF0776 eller stamme 10403S resulterer i et sammenligneligt antal bakterier genvundet fra leveren og milten hos inficerede mus, men mus inficeret med 07PF0776 er mere tilbøjelige til at give påviselige antal bakterier fra hjertet og udvise større bakterielle byrder i dette organ.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på spotbelægningsteknik til bestemmelse af bakterielle CFU'er. H9c2 celler dyrket på glas coverlips og inficeret med L. monocytogenes blev lysed og suspensioner blev serielt fortyndet ved hjælp af 1:10 fortyndinger op til en 1:1,000 fortynding (venstre panel). En multikanalpipet blev brugt til at pipet 10 ul fra hver brønd direkte på en LB agar plade, og pladen blev inkuberet natten over ved 37 °C (højre panel). Antallet af bakterier pr. coverslip vurderes ved at tælle bakteriel CFU, der er forbundet med den relevante fortynding.

Figure 2
Figur 2: L. monocytogenes stamme 07PF0776 udviser øget invasion af hjerteceller i vævskultur. Invasionsanalyser blev udført i H9c2 celler ved hjælp af en MOI = 100. Grafen viser det gennemsnitlige antal intracellulære bakterielle CFU'er genvundet +/- SE fra celler inficeret med 10403S (sort) versus den kardiotrope 07PF0776 stamme (blå). ** angiver betydningen af p <0.01.

Figure 3
Figur 3: L. monocytogenes stamme 07PF0776 udviser øget invasion af hjertet i museinfektion modeller. Dyret blev podet med 10.000 CFU via halen vene. Infektioner fik lov til at udvikle sig i 72 timer, hvorefter dyrene blev ofret, og lever, milt og hjerter blev indsamlet og behandlet for at bestemme bakteriel CFU pr. Organ. Faste cirkler repræsenterer CFU opnået fra individuelle mus, med den gennemsnitlige værdi for alle dyr inden for en gruppe angivet med en linje +/- SE. Procentværdierne angiver antallet af dyr, der indeholder påviselig bakteriel CFU i hjertet. * angiver betydningen af p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. monocytogenes er et udbredt og velkaraktereret menneskeligt patogen, der er i stand til at forårsage en række forskellige sygdoms manifestationer15. Bakterien er tidligere blevet beskrevet for sin evne til at translokere på tværs af barrierer, såsom blod-hjerne-barriere og placenta-foster barrierer, for at nå og kolonisere centralnervesystemet og udvikle fosteret, henholdsvis. Organismens in vivo-evne til at kolonisere disse væv suppleres ofte af en in vitro-evne til at invadere de repræsentative celler i kulturen, der udgør de målrettede organer. For eksempel har invasion af epitelceller i choroid plexus været forbundet med organismens evne til at kolonisere CNS16; og villous trophoblast explants er blevet brugt til at repræsentere mødre-føtalbarriere 17. I denne protokol er der beskrevet metoder, der er nyttige til vurdering af bakteriel invasion af hjerteceller i kultur samt til sammenligning af bakteriel kolonisering af hjertet for individuelle isolater i forhold til kolonisering af leveren og milten.

Denne protokol indeholder en række kritiske trin, men blandt de mest kritiske er dem, der involverer brugen af den korrekte bakterielle CFU til enten infektion af vævskulturceller dyrket på coverslips eller infektion af dyr. Hvis bakterielT CFU-nummer ikke kontrolleres korrekt mellem forskellige brønde og dyr, kan der ikke foretages direkte sammenligninger mellem prøverne. Det er vigtigt at dobbelttjekke den fortyndingsserie, der anvendes til at generere inoculaen, ved direkte udtynding af de endelige fortyndinger på medieplader for at sikre, at det bakterielle CFU-nummer er blevet nøjagtigt estimeret.

De H9c2-celler, der anvendes i disse assays, stammer fra den nederste halvdel af et 13-dages embryonalt rottehjerte, som hovedsagelig omfattede ventrikulært væv18. Cellerne formere sig som mononukleerede myoblaster og ved at nå sammenløb i vævskultur kolber eller retter begynder at danne multinukleerede rørformede strukturer. Cellerne har en generationstid på ca. 30 timerog 18. Serum sult af H9c2 celler har været forbundet med differentiering af cellerne i skeletmuskulatur celler, mens behandling af myoblaster med 10 nMall-trans retinosyre har været forbundet med myoblast differentiering i hjerte myokytter14. Denne protokol var fokuseret på L. monocytogenes myoblast celle invasion, men H9c2 celle linje er en alsidig celle linje, der kan bruges til at undersøge virkningerne af kontrolleret celle differentiering på bakteriel invasion.

L. monocytogenes stamme 07PF0776 blev oprindeligt isoleret fra en HIV-inficeret patient, der havde en ikke-resusitatable asystolisk anholdelse på grund af en invasiv L. monocytogenes infektion i hjertet8. Efterfølgende analyse af denne stamme i museinfektionsmodeller viste, at den havde en forbedret kapacitet til at målrette og invadere hjertevæv. En begrænset analyse af yderligere tilfældige isolater af L. monocytogenes tyder på, at underpopulationer af bakterielle isolater er i stand til at inficere musens hjerter i mangel af forudgående skade på hjertevæv eller hjerteklapper8. Interessant nok blev to af de bedst karakteriserede L. monocytogenes stammer, 10403S og EGD, fundet at være dårlige kolonister af hjerteceller og væv. Genomsekvensering af 07PF0776-isatet afslørede ikke tilstedeværelsen af nye patogene øer eller fremlagde bevis for unikke genklynger19; Dette tyder på, at 07PF0776 er rettet mod hjerteceller til invasion gennem ændring af dets eksisterende arsenal af virulensgenprodukter. Foreløbig histokemisk analyse viser, at 07PF0776 danner bylder i inficerede musehjerter, der ligner den byld, der er observeret hos den oprindelige inficerede menneskelige patient (data vises ikke). Hvorvidt andre kardiotropiske L. monocytogenes isolater fremkalde lignende hjerte byld dannelse er endnu ikke fastlagt.

De assays præsenteret her kan let ændres for at lette undersøgelsen af forskellige aspekter af infektion. Individuelle coverslips kan fastsættes og farves for enten lys eller fluorescens-baseret mikroskopi, væv kultur inkubationstider kan øges til måling og sammenligning af bakterier intracellulære vækstrater, væv og organer kan paraffin indlejres og behandles til mikroskopisk undersøgelse for at undersøge byld dannelse og bakteriel distribution på cellulært niveau. Ved vurdering af niveauer af bakteriel invasion af vævskulturceller eller kolonisering af værtsvæv er der begrænsninger med hensyn til den mindste mængde bakterier, som hver analyse kan detektere. In vitro invasion assays har en nedre grænse for påvisning af ca 300 CFU per coverslip. Justering af mængden af vand, der anvendes til at hvirvle coverlips kan øge påvisning af et lavt antal bakterier, med celle lysis mængder så lavt som 500 μl viser sig nyttigt at opdage dårligt invasive stammer. Coverslips kan kortvarigt dyppes i sterilt vand for at fjerne overskydende gentamicin før lysis af værtsceller i mindre mængder. Volumenniveauer på op til 5 ml eller derover kan bruges til korrekt opregning af meget invasive stammer. Hos dyrene kan der genereres organ homogenater i mængder på 5 ml eller 10 ml ddH20, hvor lavere mængder er nyttige til at detektere lavere niveauer af bakterier, og højere mængder for bedre at opregne stærkt koloniserede organer. Det mindste detektionsområde for inficerede organer er ca. 100 CFU. Hvis organer konsekvent koloniseres ved høje niveauer, skal du overveje at bruge en større mængde vand (10 ml) og udføre flere fortyndinger inden for 96-brøndspladen.

De beskrevne metoder kan anvendes på organer og væv uden for hjertet. Invasionsanalyser og museinfektioner som disse er blevet brugt til at vurdere kolonisering på en lang række steder, herunder moderkagen, hjernen, galdeblæren, leveren og tarmen. Der kan også foretages ændringer af de protokoller, der er beskrevet ovenfor, for at imødekomme hyperinvasive og/eller hypervirulente stammer, og der kan foretages substitution af hjerteceller med andre celletyper for at vurdere invasionsphoenotyper på steder uden for det kardiovaskulære system. Da forskellige celletyper har ændret følsomheden over for L. monocytogenes invasion, kan det være nødvendigt at justere parametre som MOI og inkubationstider for nøjagtigt at gendanne data fra assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud AI41816 og AI099339 (N.E.F.) og af F31AI094886-01 (P.D.M.) fra NIAID. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringskildernes officielle synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).

Tags

Infektion Problem 99 Bakteriel patogenese intracellulær patogen vævstropisme bakteriel invasion hjerteinfektion listeriose
Vurdering bakteriel invasion af hjerteceller i kultur og hjerte kolonisering i inficerede mus ved hjælp <em>af Listeria monocytogenes</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter