Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Super-resolution Imaging af Natural Killer Cell Immunologisk Synapse på et glas-understøttet Planar lipiddobbeltlaget

Published: February 11, 2015 doi: 10.3791/52502
* These authors contributed equally

Introduction

Den immunologiske synapse (IS) ligger i en kritisk fase for celle aktivering og funktion 1. Det er det primære medium, som antigenpræsentation og cellemedieret immunitet udføres. De tidligste mikroskopiske undersøgelser af synapsedannelse udnyttede en celle-celle-konjugat systemet 2. Den største begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at de fleste af konjugaterne vil blive set 'i profil ", som det var, og begrænser dermed observatørens visning af synaptiske selve strukturen. I 1999 Dustin laboratorium rettet denne begrænsning ved at anvende glas-understøttet lipiddobbeltlag (SLB) teknik 3, som var blevet banebrydende tidligere af McConnel laboratoriet 4,5. Denne tilgang bortskaffes antigenpræsenterende celler (APC'er) til fordel for et glas-støttede plane lipid overflade, i hvilke proteiner kan knyttes og bevæge sig frit i to dimensioner. Ved hjælp af denne metode, Dustin og kolleger var i stand til at peer direkte op i than Synapse hjælp af høj opløsning fluorescensmikroskopi og for første gang får en "face-to-face" se på strukturen af ​​IS.

Med brugen af SLB systemet har detaljer, som IS kan visualiseres blevet begrænset kun af de begrænsninger af nuværende billeddannelsesteknikker 6-8. Brug standard Belysningsteknik, det minimum opløsning (dvs. mindste afstand mellem to forskellige objekter, hvor de kan skelnes) har været <200 nm på grundlag af Rayleigh kriterium 9. Denne grænse hindrer billeddannelse af meget fine, molekylær skala strukturer, der udgør synapsen, og indtil udviklingen af super-opløsning billeddannelse teknikker 10-12 blev visualisering af disse strukturer begrænset til billeddannelse af fikserede celler ved anvendelse af elektronmikroskopi.

Med den seneste fremkomsten af ​​en række super opløsning teknikker, såsom SIM-kort (struktureret belysning mikroskopi), PALM (fotoaktiveret lokalisering mikroskopi), STORM (stokastisk optisk genopbygning mikroskopi), og STED 10-12, efterforskere er nu i stand til at studere disse synaptiske strukturer i hidtil uset detalje, som har til gengæld, forudsat en stadig afklaret forståelse af IS. Fordelene ved STED mikroskopi er blevet beskrevet før den 13.. Her beskriver vi super-opløsning billeddannelse med STED mikroskopi udstyret med den nyudviklede 660 nm udtynding laser. Sammenlignet med konventionelle 592 nm udtømning laser, 660 nm laser giver mulighed for en bredere udvalg af fluorescerende farvestoffer (se http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), især disse røde fluoroforer.

Andre publikationer har beskrevet STED billeddannelse af NK-celle synapser på antistof-coatede objektglas 13,14. Her er SLB kombineret med super opløsning STED mikroskopi at studere NK-celle synapse. Denne teknik har den fordel i forhold til antistof-coatede objektglas for at være en fluid mosaik, hvor de indlejrede overfladeproteiner kan bevæge sig frit i en flad todimensional overflade (xy planet). Dette efterligner mere trofast den organiske og mobile overflade af et mål celle, og dermed bedre rekapitulerer dannelsen af ​​en fysiologisk relevant immun synapser.

Målet med denne protokol er at give slutbrugeren med en detaljeret beskrivelse af, hvordan billedet den immunologiske synapse af NK-celler ved at kombinere SLB-systemet og super opløsning STED mikroskopi. Det vil give slutbrugeren med de nødvendige trin: forberede liposomer, konstruere protein-embedded dobbeltlag, fastlægge protein tæthed på lipiddobbeltlagene, og erhverve billeder super-opløsning ved hjælp STED mikroskopi. Disse teknikker er ikke begrænset til området for immunologi og kan anvendes bredt på tværs af en række forskellige discipliner.

Protocol

1. Fremstilling af liposomer

  1. Beregn mængde chloroform-suspenderet stamopløsninger af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-cap biotinyl (Biotin-PE) at gøre fortyndede lagre på den ønskede slutkoncentration. For at gøre endelige koncentrationer på 400 uM DOPC og 80 uM Biotin-PE phospholipider ved 10 ml hver, starter ved at placere 629 pi 10 mg / ml DOPC og 88 pi 10 mg / ml Biotin-PE i separate glas kromatografi rør.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at rengøre glas Hamilton sprøjter og glas kromatografi rør ved at rense opløsning (1 L 95% ethanol til 120 ml vand indeholdende 60 g kaliumhydroxid, KOH), mens overførsel chloroform-ophængt stamopløsning af DOPC og biotin-PE.
  2. Tør chloroform med en strøm af argon i den kemiske hætte. Forsegl kromatografi røret ved parafilm.
  3. Underkaste nyligt tørrede liposomer til et højt vakuum i et lyophilizER O / N for at fjerne enhver resterende chloroform. For samme dag afsluttet, tør for 60-90 min.
  4. Mens frysetørreren kører, forberede nogle fortyndingsbuffer. Til denne protokol, forberede 25 ml bestående af 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCI; og 2% (efter vægt) n-octyl-β-D-glucopyranosid (OG) detergent. Bland de to første ingredienser sammen først, derefter fortrænge ilt med argon, før du tilføjer den tørre OG pulver. Efter tilberedning filtrere OG løsning med 0,2 mikron celluloseacetatmembran, og opbevares ved 4 ° C.
  5. Desuden forberede to skrue-top flasker med 1 L Tris-saltopløsning-puffer ved de samme koncentrationer, men uden OG. Placer en destilleret vand renset magnetisk omrørerstav i bunden af ​​hver. Forbered 6 yderligere liter Tris-saltopløsning-puffer. Fjerne oxygen fra alle flasker med argon og placere dem ved 4 ° C samt.
  6. Efter lyofilisering opløses de tørrede lipider i Tris-saltopløsning OG buffer at lave en 4 mM opløsning af hver. Efter eksempelmængder, tilsættes 2 ml til DOPC rør, og 0,2 ml til biotin-PE rør det.
  7. Bland biotin-PE lipider med DOPC lipider. Dette forbedrer mobiliteten af ​​SLB, som den koblede biotin kan forringe fluiditet af fosfat hovedgrupper. For at gøre en endelig koncentration på 80 uM Biotin-PE, bland 0,2 ml 4 mM Biotin-PE og 1 ml 4 mM DOPC. Derefter tilsættes 8,8 ml af Tris-saltopløsning OG buffer.
  8. For en endelig koncentration på 400 uM DOPC, blot blande 1 ml af 4 mM DOPC med 9 ml Tris-saltopløsning OG.
  9. Fyld sonikator med isvand. Sæt glasrør med den fortyndede phospholipid i midten af ​​sonikator ved hjælp af et hjælpeprogram klemme. Soniker fortyndede phospholipid i 10 minutter, indtil opløsningen bliver klar.
    BEMÆRK: Læg is i sonikator vandbad for at holde temperaturen lav, da lydbehandling vil generere varme.
  10. Fyld i rørene med argon at fortrænge ilten i luften over væsken, og forsegle dem med parafilm.
  11. 2. Dialyse af liposomer

    1. Skær to sektioner af tør dialyserør (molekylvægt cut-off: 12-14.000, diameter: 6,4 mm), i en passende længde (i dette eksempel 40 cm), en for hver phospholipid fortynding fra rullen.
    2. Rehydrere rørsektioner ved at lade dem i blød i en 200 ml destilleret vand i et bægerglas i 2 min.
    3. Mikrobølgeovn dette i 5 minutter ved høj indstilling, eller i det mindste indtil vandet kommer i kog.
    4. Bind en knude i den ene ende af hvert rør og skyl ud interiør med nogle ml Tris-saltopløsning-OG buffer. Derefter omhyggeligt presse så meget af denne vaskebuffer som muligt for at minimere mængden af ​​buffer resterende inde.
    5. I en laminar flow hætte, tilsæt de fortyndede fosfolipider i hvert rør og klemme de åbne ender med en lille lukning dialyse rør for at udelukke al luft. Komplet luft udelukkelse vil kræve ofre af en lille volumen af ​​prøven ved at klemme under &# 8220; vand linje ".
    6. Fordyb prøverne i de udarbejdede tidligere flasker Tris-saltvandsbuffer uden OG. Forskyd ilt i flasken med argon, inden en ny forsegling og sted at røre O / N ved 4 °.
    7. Overfør slangen i en ny flaske Tris-saltopløsning-puffer uden OG hver 12 timer i mindst 3 gange.
    8. Kort før fjernelse af den dialyserede lipider, udarbejde et antal små rør i at udportionerer lipiderne ved at fylde hver med argon at fortrænge oxygen.
    9. Efter 36 timer, tage dialyse flasker i laminar flow hætte og fjerne dialyseslanger fra flaskerne. Har en bænk ble eller bæger på hånden til at indsamle den våde afstrømning.
    10. Skær dialyserøret over klippet, og fjern derefter klippet og omhyggeligt overføre dialyserede lipidopløsning via pipette i 1 ml prøver i tilberedte rør fyldt med argon gas på is.
    11. Alikvot den vandige liposomopløsningen bruge argonstrøm at fortrænge ilt igen jegn hvert rør.
    12. Opbevar liposomer ved 4 °. Må ikke nedfryses.

    3. Bestemmelse af antistof Density på lipiddobbeltlaget

    1. Forbered en fortyndingsrække af biotinyleret, fluorescens-mærket antistof, 50 pi i volumen for hver fortynding, ved følgende koncentrationer: 0 nM (blank), 10 nM, 50 nM, 100 nM og 500 nM. (Herefter benævnt "prøve-serien").
    2. Tilsæt 1 pi silicaperler i 6 brønde i en 96-brønds V-bundplade. Sørg for at ryste perlerne godt før pipettering, da de har tendens til at bosætte sig.
      BEMÆRK: Hvis har bestilt tørre perler i stedet suspenderet Følg producentens anvisninger på at udvande.
    3. Til disse perler, tilsættes 2 pi blandet DOPC: biotinylgrupper phospholipider ved et 1: 1 forhold. Gør dette for hver brønd.
    4. Pulse pladen på en vortexer på medium styrke 3 gange i 10 sek hver for at fremme interaktion med perler og phospholipiderne.
    5. Tilsæt 150 pi af 5% CASein til hver brønd. Bland godt ved pipettering op og ned tre gange.
    6. Lad pladen inkuberes i casein opløsningen i 10 min, derefter vaske det ud. At vaske, fylde hver brønd til et samlet volumen på 250 pi med HEPES-bufret saltvand (HBS) med 1% humant serumalbumin (HSA). Centrifuger ved 1000 xg i 2 min. Pipette, og kassere de øverste 200 pi af supernatanten og gentag to gange for i alt tre vaskecykler.
    7. Der tilsættes 50 pi streptavidin ved en 333 ng / ml koncentration. Pulse pladen igen 3x 10 sek, og lad det sidde på en ryster i 15 min. Wash 3x som i trin 6 for at fjerne ubundet streptavidin.
    8. Der tilsættes 50 ul af fluorescensmærkede biotinyleret antistof fra den tidligere fremstillede fortyndingsrække (se trin 3.1) til hver brønd, og erstatte pladen på rysteapparat i 20-30 min. Wash 3x som i trin 6 for at fjerne ubundet antistof.
    9. Efter den sidste vask resuspenderes perlerne i 100 pi af HBS / 1% HSA, derefter overføres til en FACS rør. Gentag dette to gange for atsikre en effektiv fjernelse af alle perler fra brønden, for i alt 300 pi, og gøre dette for hver brønd.
    10. Bring de resulterende rør til flowcytometer. Det er tid til at læse dem.
    11. Tilsæt 1 dråbe fra flasken mærket "B" fra fluorescensintensiteten kalibrering (FIC) bead kit (herefter benævnt "standard serien") til en FACS rør og fortyndes med 300 pi HBS / 1% HSA.
    12. Læs dette rør, men registrerer ikke data endnu. For nu blot at sikre, at de blanke kugler er korrekt nulstillet. Lav et histogram, der viser fluorescens af perlerne målt i den rigtige kanal, derefter skifte spændingen på excitation laser ned, indtil toppen er længst til venstre side af histogrammet.
    13. Fjern røret og tilsættes 1 dråbe af hver af de andre 4 rør i serie (mærket 1 til 4) til det samme rør. Nu placere røret i maskinen igen, og registrere de resulterende data, der skal anføres som 5 forskellige toppe. Læs hvert enkelt rør fra prøven serien.
    14. Anvendelse af FACS analyse software, tegne en port, der spænder over hele bredden af ​​hver top i standard serie histogram ved halvmaksimal punkt. Det er en gate for hver top. Gør det samme for hver prøve. Bemærk MFI (gennemsnitlige fluorescensintensitet) for hver port.
    15. Ved hjælp af en input regnearksprogram de målte MFI-værdier i det relevante sted. Også indtaste MESF (Molekyler af tilsvarende Opløselig Fluorokrom) værdier (gennemsnitligt antal fluorescerende molekyler belægning hver perle) for hver flaske i standard serien. Denne information kan findes ved at følge anvisningerne på plast jar rørene kom i.
    16. Brug regneark plotte MFI mod MESF værdier, skaber en lineær korrelation mellem antallet af fluoroforer og den målte intensitet.
    17. Brug modulet af 'proteiner og labels' i mikro-volumen spektrofotometer til at bestemme forholdet mellem farvestoffet til protein i det mærkede antistof.
    18. Input mærkning effektivitet prøveproteinet den gennemsnitlige diameter af perlerne overtrukket med lipider og MFI værdi for hver indgang. Regnearket vil automatisk bruge formlen fra den linje graf genereret i trin 3.16 at beregne MESF værdier for hver protein fortynding og seeding tæthed af prøven protein ved hver koncentration.

    4. isolerende og dyrkning human NK-celler

    1. Afmål 15 ml perifert blod eller buffy coat i en 50 ml konisk rør. Fortynd dette blod med PBS indeholdende 1% FBS i forholdet 1: 1.
    2. Tilføj 13 ml Ficoll forsigtigt til bunden af ​​røret med en 10 ml serologisk pipette.
    3. Centrifuger dette rør i 20 minutter ved 1.200 xg med speederen og brække eller ved deres laveste indstillinger.
    4. Efter centrifugering anvende en serologisk pipette til at indsamle den flydende uklar hvid midterste lag af perifere mononukleære blodceller (PBMC'er), which skal sidde og skæringspunktet mellem en klar gul øvre lag og en mere uklar svagt farvet nedre lag, som begge sidder over et nederste lag af røde blodlegemer (RBC). BEMÆRK Undgå at indsamle nogen RBC i indsamling af PBMC'er.
    5. Placer de indsamlede PBMC'er i en ny 50 ml konisk rør, og fortyndes til kapacitet med PBS indeholdende 1% FBS. Centrifuge igen, denne gang med bremsen og speederen på maksimum, i 5 minutter ved 300 x g.
    6. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 10 ml PBS indeholdende 1% FBS.
    7. Tæl celler, mens centrifugering igen på de samme indstillinger som i trin 4.6.
    8. Supernatanten gang mere, og cellerne resuspenderes i R10-medium ved en densitet på 10 millioner celler / ml.
    9. Tage 30 millioner celler i et 5 ml polystyrenrør og isolere NK-celler under anvendelse af en magnetisk separation kit, ifølge producentens anvisninger. Efter isolering, tælle cellerne en mere og resuspender ved en densitet på 500,000 celler / ml i R10 komplet medium (88% RPMI, 10% FBS, 1% HEPES, 1% natriumpyruvat) suppleret med IL-2 (100 U / ml). Kultur ved 37 ° i en CO2-inkubator, og erstatte medium 2-3 gange om ugen.

    5. Montering af Glass-støttede Planar lipiddobbeltlaget

    1. Forbered 100 ml Piranha-opløsning ved at blande 30% hydrogenperoxid med svovlsyre i et forhold på 1: 3 i et bæger.
      BEMÆRK: Altid udføre arbejde med skadelige stoffer som svovlsyre i en ordentligt udpeget stinkskab.
    2. Ind i denne løsning, fordybe 2 rektangulære # 1.5 dækglas i Piranha løsning til 20-30 min.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at rense dækglas ved Piranha løsning.
    3. Mens dækglas renses, tage 1 tube tidligere fremstillet 400 um DOPC lipider og 1 tube tidligere fremstillet 80 pM Biotin-PE lipiderne. Transportere dem på is til argon tank.
    4. Fortrænge oxygen i et nyt mikrocentrifugerør med argon,tilsæt derefter sammen DOPC og biotin-PE ved en 1: 1-forhold. Specifik volumen vil variere baseret på eksperimentelle behov, men bør være på minimum 2 pl hver. Forskyd ilt i blandingen røret igen med argon gas, og de enkelte reagenmiddel så godt, før han vendte tilbage sidstnævnte til køleskabet.
    5. Når de er færdige rengøring grundigt skylles dækglas med destilleret vand. Indstil dækglassene ud at lufttørre i nogle minutter.
    6. Udtag 1,5 pi af liposomets blanding fremstillet i trin 5.4 og udportionerer det i en enkelt dråbe ind i en af ​​lane kamre kammerets dias. Anvendelsen af ​​2 dråber per bane er typisk, men ikke nødvendig.
    7. Hurtigt og effektivt placere tørre dækglas over dråber. Sørg for, at dråberne er tilstrækkeligt placeres således, at de ikke fusionere, når dækglasset er placeret. Desuden skal du sørge for, at dråberne forbliver cirkulær og veldefineret, uden at røre kanterne af kammerets vægge. Tryk hårdt nedi mellem og omkring hver bane for at sikre en vandtæt forsegling mellem dækglasset og dias.
    8. Afmærk placering af dråberne ved hjælp af en markør pen
    9. Pass 100 pi vandig 5% casein gennem kammeret til at blokere dobbeltlaget. Prøv at sikre, at der ikke er nogen bobler i flowet kammeret.
    10. Indsprøjtes 100 pi streptavidin i en koncentration på 333 ng / ml i hver bane. Inkuber i 10-15 min ved stuetemperatur. Derefter vaskes ved at køre 3 ml HBS / 1% HSA gennem hver bane for at fjerne overskydende streptavidin.
    11. Tilsæt 100 pi biotinyleret fluorescerende mærket anti-CD16 som Alexa Fluor 568 ved proteinkoncentrationen tidligere bestemt at være mest effektive i afsnit 3. Der inkuberes i mørke i 20-30 min. Vask igen ved at køre 3 ml HBS / 1% HSA gennem hver bane.
    12. Flow 100 pi D-biotin i en koncentration 25 nM gennem kammeret for at binde eventuelle overskydende streptavidin og dermed eliminere risikoen for ikke-specifik binding af streptavidin til cellerne.
    13. Tæl NK-celler og resuspender i en koncentration på 500.000 / ml i HBS / 1% HSA.
    14. Mens nedspinning cellerne vaskes D-biotin ud af kammeret med en anden 3 ml HBS / 1% HSA per lane.
    15. Tjek mobilitet ligander på SLB ved fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) på en total intern refleksion fluorescens (TIRF) eller konfokal mikroskopi før tilsætning NK-celler.
    16. Når cellerne er færdig spinding og er blevet resuspenderet ved den ønskede koncentration, tilsættes 100 pi til hver bane.
    17. Placer kammeret i et 37 ° 5% CO 2-inkubator i 30-60 min.
    18. Efter denne inkubationsperiode fikseres cellerne med 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 10-20 min. Vask ved at køre 3 ml PBS gennem hver bane for at fjerne paraformaldehyd.
    19. Tilføj 400 pi blokerende buffer (5% normal donkey serum og 0,2% Tritron X-100 i PBS). Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
    20. Stain F-actin og perforin ved annonceding 200 pi fortyndet fluorescens-mærket phalloidin (1 enhed / ml mærket phalloidin) og fluorescens-mærket anti-perforin mAb (500 ng / ml anti-perforin mAb). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    21. Vask ved at køre 3 ml PBS. Kammeret er klar til billeddannelse.

    6. billeddannelse af NK Synapse på lipiddobbeltlaget hjælp STED

    1. Tænd alle nødvendige hardware moduler.
    2. Start billedet analyse software. Aktiver både resonante scanning og Sted moduler. Efter at disse valg, vent ca. 3-5 min for softwaren at indlede.
    3. Klik på fanen "Konfiguration" i toppen af skærmen.
    4. Vælg "Laser Config" tænd det hvide lys og STED 592 nm lasere.
    5. Vælg den 100x objektiv, og justere excitation laserstråle med 592 nm udtynding laser.
    6. Vælg "Laser Config" modul, skal du slukke for 592 udtømninglaser, og tænd for 660 nm udtynding laser.
    7. Placer dias på scenen, over linsen. Bring cellerne bundet på det afgrænsede dobbeltlaget regionen i fokus ved hjælp af hvidt lys lampe og okularer.
    8. Retur til "Acquisition" fanen, direkte til højre for "Configuration" fanen.
    9. Klik på fanen "Skift til WhiteLight", så slå denne modul om og træk excitation laser linje til den passende bølgelængde.
    10. Vælg den ønskede detektor fra listen over dem, der findes, og sæt derefter afsløring rækkevidde til at omfatte det passende område af bølgelængder.
      BEMÆRK: Læg aldrig detekteringsområde direkte under excitationsstrålen.
    11. Klik på "Seqential" knappen i venstre "Acquire" værktøjslinjen for at åbne sekventiel scanning dialog i bunden af værktøjslinjen til venstre. Dette giver brugeren mulighed for at tilføje flere sekvenser, hvermed en anden exciteringsstrålen for en anden farve. Klik på "Mellem Frames", og derefter indstille excitation frekvens, detektor, og detekteringsområde for hver ekstra farve som i trin 6.9 og 6.10.
    12. Når alle indstillinger er optimeret, hit "Start" for at starte købet processen.
    13. Påfør fri deconvolution software (Huygens) under anvendelse af en indstilling designet til STED udfoldning, som tidligere beskrevet 13.

Representative Results

Figur 1 viser resultatet af antistoffet densitet på lipiddobbeltlaget. Princippet er at anvende faste perler at gøre standardkurve for MESF versus MFI via flowcytometri (A). MFI af prøven serien blev omdannet til MESF ved hjælp af standardkurven. Antistoffet densitet på lipiddobbeltlaget er lineært korreleret med koncentrationen antistof (B). Figur 2 viser triple-farve STED billede af NK synapse på glas-support plane lipiddobbeltlag. Anti-CD16-antistof på lipiddobbeltlaget akkumuleres, udløser F-actin dannelse og den polarisering og penetration af perforin gennem F-actin mesh på omdrejningspunktet panel af immunologisk synapse i NK-celler. Ved hjælp af denne kombinerede metode, kan man rent observere microclusters af fluorescensmærkede anti-CD16 i SLB, som direkte afspejler gruppering af CD16 på NK-celle. Sammenlignet med den konventionelle konfokale billede, strukturen af ​​CD16 central klynge er lettere erkendt hos STED billede på grund af de nedfiskede omgivende fluorescens. Endvidere ultrastruktur actincytoskelettet set med væsentligt forbedret opløsning. I overensstemmelse med tidligere observationer 16,17, er perforin-positive lytiske granula set placeret over regioner med lav F-actin densitet i STED billede, en afgørende detalje, som er for det meste tabt i konfokalt billede.

Figur 1
Figur 1. Density af 3G8 antistoffet på lipiddobbeltlaget. (A) lineær korrelation mellem MESF og MFI for standard serie. (B) lineær korrelation mellem protein densitet og koncentration til prøveprotein fortyndingsrække, der viser antallet af fluorescens-mærket protein monomerer pr arealenhed som en funktion af stigende koncentration på lipid-coated siLică perler.

Figur 2
Figur 2. STED billeddannelse af NK synapse på plane lipiddobbeltlag. Primær NK-celler blev stimuleret på SLB indeholdende biotinyleret fluorescensmærket anti-CD16 (rød), fast, permeabiliseret og derefter farvet med phalloidin (blå) og anti-F-actin (grøn). En enkelt celle blev først afbildet under den normale konfokal indstilling, og derefter indstillingen STED. Konfokal og Placering billeder blev deconvoluted hjælp Huygens-software. Scale bar, 1 pm. Klik her for en større version af dette tal.

Discussion

Det nye ved den aktuelle undersøgelse er, at den kombinerer SLB teknik med STED at studere NK celle synapser. Tidligere undersøgelser har afbildet lipiddobbeltlaget med TIRF at studere T-celle synapsedannelse 8 og signalmolekyle handel på plasmamembranen 6. Andre har beskrevet STED billeddannelse af NK-celle synapser under anvendelse af antistof-overtrukne objektglas 13,14. Den heri beskrevne yderligere hybrid metode bygger på disse bestræbelser ved billeddannelse af NK-celle synapse med forstærket klarhed ydes af super-resolution imaging på lipiddobbeltlaget overflade, som bedre modeller den dynamiske overflade af en APC.

Selvom SLBs er kunstige membraner mangler af cytoskelet, lipidklumper og andre ligander, at de faktiske target celler eller APC'er besidder, kan denne teknik rekapitulere vigtige funktioner såsom mobilitet og orienteringen af ​​ligander. Dette gør det muligt SLB systemet til at fungere som en reduktionistisk tilgang dissekere tHan bidrag enkelte receptorer og ligander til dannelse af IS og dynamikken i ER. Det vigtigste element i SLBs er, at forskerne kan kombinere denne teknik med høj opløsning billedteknik, såsom konfokal og TIRF mikroskopi. Indførelsen af ​​STED mikroskopi yderligere øger denne fordel, der giver hidtil usete indsigt i, er forskning og kliniske anvendelser.

En potentiel kritik af dette system er, at SLB ikke i tilstrækkelig grad efterligner den komplekse overflade af en APC, hvilket giver anledning til potentielt ikke-fysiologiske anatomiske træk i de resulterende synapser. Selv om det er rigtigt, at den begrænsede repertoire af overflademolekyler på SLB ikke fuldt rekapitulere heterogent befolkede overflade af en APC, kan denne grænse også være fordelagtigt, at den gør det muligt for forskere at bestemme indflydelsen af ​​individuelle receptor og ligand-interaktioner på synapsedannelse .

Ther er flere afgørende skridt i processen. Blandt de mest kritiske er, at oxidation af liposomerne forhindres gennem konstant med argon at fortrænge oxygen i røret og opløsning, såsom i trin 1.10, 2.6 og 2.11. Oxidation af lipider vil resultere i nedsat lipid mobilitet og dermed bringe evne overfladeproteiner at bevæge sig frit og deltage i synaptisk strukturering. Ligeledes er det også afgørende at fjerne alle de chloroform i liposomet ved frysetørring (trin 1.2). Ved bestemmelsen af ​​protein tæthed i lipiddobbeltlaget, er det vigtigt først at dispergere silicium perler til en homogen suspension fri klynger. Om nødvendigt kan anvendes lydbehandling af perler. I samle SLB de tidlige trin (5,1 til 5,8), hvor dækglassene rengøres, dråberne er placeret, og dækglas anbringes er afgørende. En fejl i nogen af ​​disse kan nødvendiggøre at starte eksperimentet derover (fra begyndelsen af ​​afsnit 5). Af denne grund er detskal rengøres flere dækglas, end der vil være behov for at spare tid i tilfælde af et uheld.

Ikke-klyngedannelse er den hyppigste problem, når man arbejder med dette system. Hvis der, når visualisere cellerne i det sidste trin, man ikke kan finde fluorescerende synapser, der er et par skridt, der kan tages. En anden plet for beslægtede celleoverfladereceptor kan tilsættes til kammeret for at kontrollere, at cellen ikke har dannet en synapse med dobbeltlaget, mens celler kan klæbe uspecifikt til dækglas eller dobbeltlag overflade, synaptisk-involverede overfladeproteiner bør vises som adskilte klynger på planet af celle-dobbeltlag interface, mens uengagerede overfladeproteiner skal vises som diffus farvning omkring omkredsen af ​​cellen. Hvis denne metode mislykkes, bør man kontrollere deres celler via flowcytometri for at sikre, at den pågældende markering man håber at undersøge udtrykkes i passende overflod på celleoverfladen. Visse overflade proteins er kendt for at være nedreguleret på lang sigt in vivo kultur.

Mens denne protokol detaljer specifikt, hvordan at visualisere NK-celle synapsedannelse kan SLB systemet anvendes til at studere synapsedannelse i en immunocyt tænkelige blot ved substitution af den primære ligand i trin 5.11. Flere ligander kan også tilsættes samtidigt. Man behøver heller ikke bruge et streptavidin-biotin-system til at klæbe overfladeproteiner i dobbeltlaget. Nikkel-NTA: histidin interaktioner er også levedygtige. Men på grund af den høje styrke og specificitet af streptavidin: biotin interaktion, vores laboratorium foretrækker dette system. Man kan også variere koncentrationen af ​​celler tilføjet på dobbeltlaget fra den foreskrevne densitet i trin 5.13, samt varigheden af ​​den efterfølgende inkubationsperiode for at observere synapser på forskellige stadier af modning. Dette kan endda gøres levende, selv om dette naturligvis udelukker visualisere intracellulære structures (medmindre de allerede er mærket med en fusioneret fluorescerende tag; vores laboratorium bruger nogle af disse ændrede cellelinjer). På grund af den høje grad af tilpasning muligt i denne protokol, kan man bruge den grundlæggende SLB teknik, sammen med STED billedbehandling, for at løse en utrolig bred vifte af spørgsmål i immunologi, cellebiologi og biokemi, herunder grundlæggende lipid dynamik 15, synapsedannelse 16, intracellulær signalering 17 og tumorcellemetastase 18.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
Avanti  850375C Liposome preparation
18:1 Biotinyl Cap PE
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)
Avanti  870273C  Liposome preparation
Argon gas, compressed Airgas  UN1006 Liposome preparation
A lyophilizer Labconco  Freezone 7740020 Liposome preparation
Lyophilizer tubes Labconco  7540200 Liposome preparation
Chromatography Columns Santa Cruz sc-205558 Liposome preparation
1 M Tris pH 8.0 Ambion  AM9856 Liposome preparation
5 M NaCl Ambion  AM9759 Liposome preparation
Octyl-β-D-glucopyranoside Sigma-Aldrich  O1008 Liposome preparation
Dialysis tubing Spectrum Labs  132676 Liposome preparation
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) Corning 3896 antibody density determination
Non-functionalized silica beads Bangs Laboratories  SS06N antibody density determination
FACS tubes Fisher Scientific  14-959-2A  antibody density determination
QuantumTM MESF beads Bangs Laboratories Variable antibody density determination
Casein  Sigma-Aldrich  C0875 Lipid bilayer preparation
HEPES buffered saline + 1% HSA Homemade Lipid bilayer preparation
Streptavidin  Life technologies  434301 Lipid bilayer preparation
Fluorescently-labeled biotinylated protein  Homemade Lipid bilayer preparation
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 ibidi  80608 Lipid bilayer preparation
25x75 mm glass coverslip ibidi  10812 Lipid bilayer preparation
Hydrogen peroxide (30%) Fisher Scientic  BP2633 Lipid bilayer preparation
Sulfuric acid Sigma-Aldrich  258105 Lipid bilayer preparation
D-Biotin Invitrogen  B20656 Lipid bilayer preparation
Lens paper VWR  54826-001 For imaging
Type F Immersion Oil Leica  11 513 859 For imaging
A Leica TCS STED microscope Leica For imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dustin, M. L., Long, E. O. Cytotoxic immunological synapses. Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).
  2. Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers. Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).
  5. Tscharner, V., McConnell, H. M. Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces. Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).
  6. Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. J. Vis. Exp. , (2012).
  7. Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers. J. Vis. Exp. , (2012).
  8. Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. , (2008).
  9. Michalet, X., Weiss, S. Using photon statistics to boost microscopy resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).
  10. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  11. Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).
  12. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J. Vis. Exp. , (2014).
  14. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
  15. Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS). Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).
  16. Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses. Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).
  17. Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells. Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).
  18. Wu, J. C., et al. Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture. Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).

Tags

Immunologi naturlige dræberceller immunologisk synapse billedbehandling STED støttet lipiddobbeltlag super-opløsning
Super-resolution Imaging af Natural Killer Cell Immunologisk Synapse på et glas-understøttet Planar lipiddobbeltlaget
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, P., Bertolet, G., Chen, Y.,More

Zheng, P., Bertolet, G., Chen, Y., Huang, S., Liu, D. Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer. J. Vis. Exp. (96), e52502, doi:10.3791/52502 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter