Introduction
Den immunologiska synaps (IS) ligger i ett kritiskt skede för cellaktivering och funktion 1. Det är den primära medium genom vilket antigenpresentation och cellmedierad immunitet utförs. De tidigaste mikroskopiska studier av synaps bildning utnyttjade en cell-cell-konjugat systemet 2. Den huvudsakliga begränsningen med detta tillvägagångssätt är att de flesta av konjugaten kommer att ses "i profil", så att säga, vilket begränsar betraktarens uppfattning av den synaptiska strukturen själv. År 1999 Dustin laboratoriet upp denna begränsning genom att utnyttja den glas stöds lipidbiskiktet (SLB) teknik 3, som hade banat tidigare av McConnel laboratoriet 4,5. Detta tillvägagångssätt skaffas antigenpresenterande celler (APC) till förmån för en glas stöds plana lipid yta, i vilken proteiner kan fästas och röra sig fritt i två dimensioner. Med denna metod, Dustin och kollegor kunde to peer direkt upp i tHan Synapse använder hög upplösning fluorescensmikroskopi, och för första gången får en "face-to-face" titta på strukturen i IS.
Med hjälp av SLB-systemet, har detalj med vilken IS kan visualiseras begränsats endast av begränsningarna hos nuvarande avbildningstekniker 6-8. Använda standardbelysningstekniker, den lägsta upplösningen (dvs minsta avstånd mellan två skilda objekt där de kan urskiljas) har varit <200 nm utifrån Rayleigh kriterium 9. Denna gräns hindrar avbildning av mycket fina, molekylnivå strukturer som utgör synapsen, och fram till utvecklingen av super-upplösningsavbildningstekniker 10-12, var visualisering av dessa strukturer begränsas till avbildning av fixerade celler med användning av elektronmikroskopi.
Med den senaste tidens tillkomsten av en rad superupplösningsteknik, såsom SIM (strukturerad belysning mikroskopi), Palm (photoactivated lokalisering mikroskopi), STORM (stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi), och STED 10-12, utredare har nu möjlighet att studera dessa synaptiska strukturer i oöverträffad detaljrikedom, vilket i sin tur gav en alltmer klar förståelse av IS. Fördelarna med STED mikroskopi har beskrivits före 13. Här beskriver vi superupplösning avbildning med STED mikroskopi utrustad med nyutvecklade 660 nm utarmning laser. Jämfört med konventionella 592 nm utarmning laser tillåter 660 nm laser för en bredare urval av fluorescerande färgämnen (se http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), särskilt dessa röda fluoroforer.
Andra publikationer har beskrivit STED avbildning av NK-cell synapser på antikroppsbelagda glasskivor 13,14. Här, är SLB-systemet i kombination med superupplösning STED mikroskopi för att studera NK-cell synapsen. Denna teknik har fördelen framför antikropps-belagda objektglasen för att vara ett fluidum mosaik, i vilken de inbäddade ytproteiner kan röra sig fritt i ett platt tvådimensionell yta (xy-planet). Detta härmar mer troget den organiska och mobila ytan av en målcell, och följaktligen bättre rekapitulerar bildandet av en fysiologiskt relevant immun synapsen.
Målet med detta protokoll är att ge slutanvändaren med en detaljerad beskrivning av hur man bilden den immunologiska synapsen av NK-celler genom att kombinera SLB-systemet och super-upplösning STED mikroskopi. Det kommer att ge slutanvändaren med nödvändiga åtgärder för att: bereda liposomerna, konstruera protein inbäddade bilayers, bestämma proteintäthet på lipidbiskikten, och förvärva super upplösning använder STED mikroskopi. Dessa tekniker är inte begränsade till området för immunologi, och kan grovt utnyttjas inom en mängd olika discipliner.
Protocol
1. Framställning av liposomer
- Beräkna mängden kloroform suspenderade stamlösningar av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-cap biotinyl (Biotin-PE) att göra utspädda lager i den önskade slutliga koncentrationen. För att göra slutliga koncentrationer av 400 iM DOPC och 80 iM Biotin-PE fosfolipider vid 10 ml vardera, börja med att placera 629 pl 10 mg / ml DOPC och 88 il 10 mg / ml Biotin-PE i separata glas kromatografi rören.
OBS: Det är viktigt att rengöra glas Hamilton sprutor och glas kromatografi rören genom rengöringslösning (1 L 95% etanol till 120 ml vatten innehållande 60 g kaliumhydroxid, KOH), medan överföring av kloroform-upphängd stamlösning av DOPC och Biotin-PE. - Torka kloroform med en ström av argon i den kemiska huva. Täta kromatografirör med parafilm.
- Utsätta nyligen torkade liposomer till ett högt vakuum i en lyophilizer O / N för att avlägsna eventuellt kvarvarande kloroform. För samma dag färdigställande, torka 60-90 minuter.
- Medan lyofilisatorn körningar, förbereda några utspädningsbuffert. För detta protokoll, förbereda 25 ml bestående av 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; och 2% (i vikt) n-oktyl-β-D-glukopyranosid (OG) rengöringsmedel. Blanda de två första ingredienserna först, sedan förskjuta syre med argon innan du lägger det torra OG pulvret. Efter framställning, filtrera OG-lösning med 0,2 mikron cellulosaacetatmembran, och förvara vid 4 ° C.
- Bered dessutom två skruv-top flaskor med ett L av Tris-koksaltbuffert vid samma koncentrationer men utan OG. Placera en destillerat vatten rengjord magnetisk omrörarstav i botten av vardera. Förbered Ytterligare 6 liter av tris-saltbuffert. Avlägsna syre från alla flaskorna med argon och placera dem vid 4 ° C samt.
- Efter frystorkning, upplösa de torkade lipider i Tris-saltlösning OG buffert för att göra en 4 mM lösning av varje. Efter förebildvolymer, tillsätt 2 ml till DOPC röret, och 0,2 ml till Biotin-PE-rör.
- Blanda samman biotin-PE lipider med DOPC lipider. Detta förbättrar rörligheten av SLB, eftersom den kopplade biotin kan försämra rörligheten på de fosfathuvudgrupperna. För att göra en slutlig koncentration av 80 ^ M Biotin-PE, blanda 0,2 ml 4 mM Biotin-PE och 1 ml 4 mM DOPC. Därefter till 8,8 ml Tris-saltlösning OG buffert.
- För en slutlig koncentration av 400 iM DOPC, helt enkelt blanda 1 ml 4 mM DOPC med 9 ml Tris-saltlösning OG.
- Fyll sonikator med isvatten. Placera glasröret som innehåller den utspädda fosfolipid i centrum av sonikator genom att använda ett verktyg klämma. Sonikera utspädda fosfolipid i 10 min tills lösningen blir klar.
OBS: Lägg is i sonicator vattenbad för att hålla temperaturen låg eftersom ultraljudsbehandling kommer att generera värme. - Fyll i rören med argon för att tränga undan syret i luften ovanför vätskan, och täta dem med parafilm. 2. Dialys av liposomer
- Skär två sektioner av torr dialysrör (molekylviktsgräns: 12-14,000, diameter: 6,4 mm) av lämplig längd (i detta exempel, 40 cm), en för varje fosfolipid utspädning från rullen.
- Rehydrera slangsektioner genom att låta dem dra i en 200 ml destillerat vatten i en glasbägare för 2 min.
- Micro detta för 5 minuter vid en hög inställning, eller åtminstone tills vattnet kommer till en koka.
- Knyt en knut i ena änden av varje rör och skölj ur interiör med några milliliter Tris-saltlösning-OG-buffert. Därefter minutiöst pressa ut så mycket av denna tvättbuffert som möjligt för att minimera mängden buffert kvar inuti.
- I ett laminärt flöde huva, lägg de utspädda fosfolipider i varje rör och klämma de öppna ändarna med en liten dialysröret stängning för att utesluta all luft. Komplett luft utslagning kommer att kräva uppoffringar av en liten volym av provet genom kläm nedanför &# 8220; vattenlinje ".
- Doppa proverna i de framställda tidigare flaskor tris-koksaltbuffert utan OG. Förskjutning syre i flaskan med argon innan återförslutning och plats att röra O / N vid 4 °.
- Överför slangen i en ny flaska av tris-koksaltbuffert utan OG varje 12 timmar under minst tre gånger.
- Strax före avlägsnande av de dialyserade lipider, förbereda ett antal små rör i vilken att alikvot lipiderna genom att fylla vardera med argon för att förskjuta syre.
- Efter 36 timmar, ta dialys flaskorna i laminärt flöde huva och ta bort dialysrören från flaskorna. Ha en bänk blöja eller bägare till hands för att samla in den våta avrinning.
- Skär dialysslangen ovanför klippet, sedan bort klippet och försiktigt överföra dialyse lipidlösningen via pipett i 1 ml portioner i förväg förberedda rör fyllda med argongas på is.
- Alikvotera vatten liposomlösningen använder argonström att förskjuta syre igen jagn varje rör.
- Förvara liposomerna vid 4 °. Får ej frysas.
- Bered en spädningsserie av biotinylerad, fluorescensmärkt antikropp, 50 | il i volym för varje utspädning, vid följande koncentrationer: 0 nM (blank), 10 nM, 50 nM, 100 nM och 500 nM. (Hädanefter benämnt "provserie").
- Lägg ett pl av kiseldioxidpärlor i 6 brunnar i en 96-brunnars v-bottnad platta. Var noga med att skaka pärlorna väl före pipettering, eftersom de tenderar att bosätta sig.
OBS: Om att ha beställt torra kulor i stället tillfälligt, följ tillverkarens instruktioner för att späda. - Till dessa pärlor, tillsätt 2 pl blandad DOPC: Biotinyl fosfolipider på en 1: 1-förhållande. Gör detta för varje brunn.
- Pulse plattan på en vortexer vid medelhög styrka tre gånger under 10 sekunder vardera att främja samverkan med pärlorna och fosfolipiderna.
- Lägg 150 pl av 5% casein till varje brunn. Blanda väl genom att pipettera upp och ned tre gånger.
- Låt plattan inkubera i kasein-lösning under 10 min, sedan tvätta ut det. Att tvätta, fyll varje brunn till en total volym av 250 | il med HEPES-buffrad saltlösning (HBS) med ett% humant serumalbumin (HSA). Centrifugera vid 1000 xg under 2 minuter. Pipettera ut och kassera de bästa 200 pl av supernatanten och upprepa två gånger för totalt tre tvättcykler.
- Lägg 50 pl streptavidin vid en 333 ng / ml koncentration. Puls plattan igen 3x 10 sek, och låt det sitta på en shaker i 15 min. Tvätta 3x som i steg 6 för att avlägsna obundet streptavidin.
- Lägg 50 pl av den fluorescensmärkta biotinylerad antikropp från den tidigare beredda utspädningsserie (se steg 3.1) till varje brunn, och ersätta plattan på skakare under 20-30 min. Tvätta 3x som i steg 6 för att avlägsna obunden antikropp.
- Efter den sista tvätten, resuspendera pärlorna i 100 pl HBS / 1% HSA, sedan överföra till en FACS rör. Upprepa detta två gånger tillsäkerställa ett effektivt avlägsnande av alla pärlorna från brunnen, för totalt 300 | il, och gör detta för varje brunn.
- Ta de resulterören till flödescytometern. Det är dags att läsa dem.
- Lägg en droppe från flaskan märkt "B" från fluorescensintensitet kalibreringen (FIC) vulst sats (nedan kallade "standardserie") till ett FACS-rör, och späd med 300 | il HBS / 1% HSA.
- Läs detta rör, men inte registrera data ännu. För nu, helt enkelt se till att de tomma pärlorna är korrekt nollställd. Gör ett histogram som visar fluorescens av pärlorna som uppmätts i den lämpliga kanalen, sedan skifta spänningen av exciteringslaser ned tills toppen ligger längst till vänster sida av histogrammet.
- Ta bort röret och tillsätt en droppe av varje av de andra fyra rör i serien (märkta 1 till 4) till samma rör. Nu, placera röret i maskinen igen och spela in de resulterande data, vilket bör visas som fem distinkta toppar. Läs varje enskild slang från provserien.
- Använda FACS analysprogram, rita en grind som spänner över hela bredden av varje topp i standardserien histogrammet vid halva maximala punkten. Det är en grind för varje topp. Gör samma sak för varje prov. Notera MFI (medelfluorescensintensitet) för varje grind.
- Med hjälp av en kalkylprogram ingång de uppmätta MFI-värden på lämplig plats. Även mata in MESF (molekyler Motsvarande Löslig Fluorokrom) värden (genomsnittligt antal fluorescerande molekyler beläggning varje pärla) för varje flaska i standardserien. Denna information kan hittas genom att följa anvisningarna på plastburk rören kom in.
- Använd kalkyl plottas MFI mot MESF värdena, vilket skapar en linjär korrelation mellan antalet fluoroforer och den uppmätta intensiteten.
- Använd modulen av "proteiner & etiketter" i mikro-volymen spektrofotometer för att bestämma förhållandet färgämne till proTein i den märkta antikroppen.
- Ingång märkningseffektiviteten av proteinprovet, den genomsnittliga diametern hos pärlorna belagda med lipider, och MFI-värdet för varje post. Kalkylbladet kommer automatiskt att använda formeln från linjediagram genereras i steg 3.16 för att beräkna MESF värden för varje protein utspädning och sådd tätheten av proteinprovet vid varje koncentration.
- Alikvotera 15 ml perifert blod eller buffy coat i en 50 ml koniskt rör. Späd detta blod med PBS innehållande 1% FBS vid förhållandet 1: 1.
- Lägg 13 ml Ficoll försiktigt till botten av röret med en 10 ml serologisk pipett.
- Centrifugera detta rör under 20 min vid 1200 xg med gaspedalen och den avbrytbara eller på sina lägsta inställningarna.
- Efter centrifugering, använd en serologisk pipett för att samla den flytande grumlig vita mellanlager av perifera mononukleära blodceller (PBMC), wso m bör sitta och skärningspunkten mellan en klar gul övre skikt och ett mer grumlig blek-färgad undre skikt, vilka båda sitta ovanför en understa skiktet av röda blodkroppar (RBC). OBS Inte för att samla in några RBC vid insamlingen av PBMC.
- Placera de uppsamlade PBMC i ett nytt 50 ml koniskt rör och späd till kapacitet med PBS innehållande 1% FBS. Centrifugera igen, denna gång med bromsen och gaspedalen på max, i 5 min vid 300 x g.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml PBS innehållande 1% FBS.
- Räkna celler medan centrifugering en gång på samma inställningar som i steg 4.6.
- Kasta bort supernatanten en gång mer, och återsuspendera cellerna i R10-medium vid en densitet av 10 miljoner celler / ml.
- Ta 30000000 celler i ett 5 ml polystyrenrör, och isolera NK-celler med användning av en magnetisk separation kit, enligt tillverkarens instruktioner. Efter isolering, räkna cellerna en mer och resuspendera vid en densitet av 500,000 celler / ml i R10 komplett medium (88% RPMI, 10% FBS; 1% HEPES; 1% natriumpyruvat) kompletterat med IL-2 (100 U / ml). Kultur vid 37 ° i en CO2-inkubator, och ersätta medel 2-3 gånger i veckan.
- Bered 100 ml Piranha-lösning genom att blanda 30% väteperoxid med svavelsyra i ett förhållande av 1: 3 i en bägare.
OBS: Gör alltid arbetet med skadliga ämnen som svavelsyra i en korrekt utsedd dragskåp. - In i denna lösning, fördjupa två rektangulära # 1.5 täck i piraya lösning för 20-30 min.
OBS: Det är viktigt att rengöra täck med piraya lösning. - Medan täck rengörs, ta 1 tub tidigare förberett 400 pm DOPC lipider och 1 tub tidigare framställda 80 iM Biotin-PE lipider. Transportera dem på is till argon tanken.
- Förskjutning syre i ett nytt mikrocentrifugrör med argon,sedan lägga ihop DOPC och Biotin-PE på en 1: 1-förhållande. Specifik volym varierar beroende på experimentella behov, men bör vara minst 2 pl vardera. Förskjutning syre i blandningen röret gång med argongas, och de enskilda reagensrören också, innan han återvände senare till kylskåpet.
- När de är färdiga rengöring, skölj täck med destillerat vatten. Ställ täck ut lufttorka i några minuter.
- Uttag 1,5 il av liposomblandningen som framställts i steg 5,4 och delprov den i en enda droppe till en av körfälts kamrarna i kammarobjektglas. Användningen av två droppar per körfält är typiskt, men inte nödvändigt.
- Snabbt och effektivt placera torra täck över dropparna. Se till att dropparna är tillräckligt åtskilda så att de inte går samman när täckglaset placeras. Dessutom, se till att dropparna förblir cirkulära och väldefinierad, utan att röra kanterna på kammarens väggar. Tryck bestämt nedåtmellan och runt varje bana för att garantera en vattentät tätning mellan täckglas och bild.
- Markera positionerna för dropparna att använda en märkpenna
- Passera 100 pl av vattenhaltig 5% kasein genom kammaren för att blockera tvåskiktsmembran. Försök att se till att det inte finns några bubblor i flödet kammaren.
- Injicera 100 pl av streptavidin vid en koncentration av 333 ng / ml i varje bana. Inkubera under 10-15 min vid RT. Därefter tvättar genom att köra tre ml HBS / 1% HSA genom varje körfält för att avlägsna överskottet av streptavidin.
- Lägg 100 il biotinylerad fluorescensmärkt anti-CD16 såsom Alexa Fluor 568 vid proteinkoncentration som tidigare bestämts för att vara mest effektiv i avsnitt 3. Inkubera i mörker under 20-30 min. Tvätta igen genom att köra 3 ml HBS / 1% HSA genom varje körfält.
- Flöde 100 pl av D-biotin vid en koncentration 25 nM genom kammaren i syfte att binda eventuellt överskott streptavidin och därför eliminera risken för icke-specifik bindning av streptavidin till cellerna.
- Räkna NK-celler och återsuspendera i en koncentration av 500.000 / ml i HBS / 1% HSA.
- Medan spinna ned cellerna, tvätta D-biotin ut ur kammaren med en annan 3 ml HBS / 1% HSA per bana.
- Kontrollera rörlighet ligander på SLB efter fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) på en total inre reflektion fluorescens (TIRF) eller konfokalmikroskopi före tillsats NK-celler.
- När cellerna har avslutat spinning och har återsuspenderades vid den önskade koncentrationen, tillsätt 100 | il till varje bana.
- Placera kammaren i en 37 ° 5% CO2 inkubator under 30 till 60 min.
- Efter denna inkubationsperiod fixera cellerna med 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur under 10-20 minuter. Tvätta genom att köra 3 ml PBS genom varje bana för att avlägsna paraformaldehyden.
- Lägg 400 | il blockerande buffert (5% normal donkey serum och 0,2% Tritron X-100 i PBS). Inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter.
- Stain F-aktin och perforin genom annonsending 200 fil utspätt fluorescensmärkt falloidin (1 enhet / ml märkt falloidin) och fluorescensmärkt anti-perforin mAb (500 ng / ml anti-perforin mAb). Inkubera vid rumstemperatur under 1 h.
- Tvätta genom att köra 3 ml PBS. Kammaren är redo för avbildning.
- Slå på alla nödvändiga hårdvarumoduler.
- Starta bild analysprogram. Aktivera både resonant scanning och sted moduler. Efter att dessa val, vänta ca 3-5 min för programvaran för att initiera.
- Klicka på "Configuration" -fliken längst upp på skärmen.
- Välj "Laser Config" slå sedan på det vita ljuset och STED 592 nm lasrar.
- Välj 100x mål, och rikta excitation laserstråle med 592 nm utarmning laser.
- Välj "Laser Config" modul, stäng av 592 utarmninglaser, och sväng på 660 nm utarmning laser.
- Placera bilden på scenen, över linsen. Ta cellerna bundna på avgränsade tvåskikts regionen i fokus med vitt ljus lampan och okularen.
- Återgå till "Förvärv" -fliken, direkt till höger om "Configuration" -fliken.
- Klicka på fliken "Växla till Whitelight", sväng då att modulen och dra excitation laserlinjen till lämplig våglängd.
- Välj önskad detektorn från listan över de som finns tillgängliga, ställ sedan in detektionsområdet till att omfatta lämpligt urval av våglängder.
OBS: ALDRIG sätta detektionsområdet direkt under excitationsstrålen. - Klicka på "Seqential" -knappen i vänstra "Hämta" i verktygsfältet för att få upp Sekventiell Skanning dialogen i botten av den vänstra verktygsfältet. Detta tillåter användaren att lägga till flera sekvenser, var och enmed en annan exciteringsstråle för en annan färg. Klicka på "Mellan Frames", och ställ sedan in excitationsfrekvens, detektor, och detektionsområde för varje ytterligare färg som i steg 6.9 och 6.10.
- När alla inställningar är optimerade, hit "Start" för att börja förvärvsprocessen.
- Applicera fri deconvolution programvara (Huygens) med användning av en inställning avsedd för STED avfaltning, såsom beskrivits tidigare 13.
3. Fastställande av antikropps Densitet på lipidbiskiktet
4. Infångning och odling av humana NK-celler
5. Montering av Glass-stött Planar lipidbiskiktet
6. Imaging av NK Synapse på lipidbilagret använder STED
Representative Results
Figur 1 visar resultatet av antikroppstätheten på lipiddubbelskiktet. Principen är att använda standard pärlor för att göra standardkurva av MESF kontra MFI via flödescytometri (A). MFI av provserien omvandlades till MESF med hjälp av standardkurvan. Antikroppsdensiteten på lipiddubbelskiktet är linjärt korrelerad med antikroppskoncentrationen (B), fig. 2 visar den trippelfärgade STED avbildar av NK synaps på glas-support plana lipiddubbelskikt. Anti-CD16 antikropp på lipidbiskiktet ackumuleras, utlöser F-aktin bildning och polariseringen och penetration av perforin genom F-aktin mesh vid bränn panel av immunologisk synaps i NK-celler. Med hjälp av denna kombinerade metoden, kan man rent observera microclusters av fluorescerande anti-CD16 inom SLB, som direkt speglar gruppering av CD16 på NK cellen. Jämfört med den konventionella konfokala bilden strukturen hos CD16 central kluster lättare urskiljas i STED bilden på grund av den utarmat omgivnings fluorescens. Vidare är ultrastrukturen av aktincytoskelettet ses med signifikant förbättrad upplösning. I överensstämmelse med tidigare observationer 16,17, är perforin positiva lytiska granuler sett placerad över regioner med låg F-aktin densitet i STED bild, en avgörande detalj som oftast går förlorad i den konfokala bilden.
Figur 1. Densitet för 3G8 antikropp på lipidbiskiktet. (A) Linjär korrelation mellan MESF och MFI för standardserie. (B) Linjär korrelation mellan proteintäthet och koncentration för provproteinspädningsserie, som visar antalet fluorescensmärkta protein monomerer per ytenhet som en funktion av ökande koncentration på lipid belagda silica pärlor.
Figur 2. STED avbildning av NK synaps på planar lipiddubbelskikt. Primära NK-celler stimulerades på SLB innehållande biotinylerad fluorescensmärkt anti-CD16 (red), fixerades, permeabiliserades och färgades sedan med falloidin (blå) och anti-F-aktin (grön). En enskild cell först avbildas under normala konfokala inställningen och sedan inställningen STED. Konfokala och sted bilderna deconvoluted med Huygens programvara. Skala bar, 1 pm. Klicka här för en större version av denna siffra.
Discussion
Det nya med den aktuella studien är att den kombinerar SLB-tekniken med STED att studera NK cell synapser. Tidigare studier har avbildat lipiddubbelskiktet med TIRF för att studera T-cell synaps bildning 8 och signalmolekyl handel på plasmamembranet 6. Andra har beskrivit STED avbildning av NK-cell synapser använder antikroppsbelagda glasskivor 13,14. Hybrid metod som beskrivs häri ytterligare bygger på dessa insatser genom att avbilda NK cellen synaps med ökad tydlighet ges genom superupplösning som avbildar på lipidbiskiktet ytan, vilket bättre modeller för dynamiska ytan av en APC.
Även SLBs är artificiella membraner saknar av cytoskelettet, lipidaggregat och andra ligander som faktiska målceller eller APC besitter, kan denna teknik rekapitulera viktiga funktioner som rörlighet och orientering av ligander. Detta tillåter SLB systemet att fungera som ett reduktionistiskt tillvägagångssätt dissekera tHan bidrag enskilda receptorer och ligander till bildandet av IS och dynamik IS. Den viktigaste funktionen i SLBs är att forskarna kan kombinera denna teknik med hög upplösning avbildning, såsom konfokal och TIRF mikroskopi. Införandet av STED mikroskopi ökar ytterligare denna fördel, ger oanade insikter i IS forskning och dess kliniska tillämpningar.
En potentiell kritik av detta system är att det SLB inte i tillräcklig utsträckning efterlikna den komplexa ytan av en APC, vilket ger upphov till potentiellt icke-fysiologiska anatomiska drag i de resulterande synapser. Även om det är sant att den begränsade repertoar av ytmolekyler på SLB inte helt rekapitulera den heterogent befolkade ytan av en APC, kan denna gräns också vara fördelaktigt eftersom det tillåter utredarna att fastställa påverkan av enskilda receptor och ligand interaktioner på synaps bildning .
THär finns flera avgörande steg i processen. Bland de mest kritiska är att oxidation av liposomerna förebyggas genom ständigt med argon för att förskjuta syre i röret och lösningen, såsom i steg 1,10, 2,6, och 2,11. Oxidation av lipider kommer att resultera i minskad fett rörlighet, vilket hindrar möjligheten för ytproteiner att röra sig fritt och delta i synaptiska strukturering. Likaså är det också mycket viktigt att avlägsna all kloroform i liposomen genom lyofilisering (steg 1.2). Vid bestämning av proteindensiteten i lipiddubbelskiktet, är det av vikt att först dispergera kiselpärlor i en homogen suspension fri från kluster. Om så är nödvändigt, kan sonikering av pärlor appliceras. I monterings SLB, de tidiga stegen (5,1-5,8), där täck städas, dropparna är placerade, och täck är fäst är avgörande. Ett misstag i någon av dessa kan kräva att starta experimentet över (från början av avsnitt 5). Av denna anledning är detgod praxis att rengöra fler täck än kommer att behövas för att spara tid vid ett missöde.
Icke-klustring är den vanligaste frågan när man arbetar med det här systemet. Om, när visualisera cellerna i det slutliga steget, inte en att hitta några fluorescerande synapser, finns det några steg som kan vidtas. En annan fläck för det besläktade cellytreceptor kan tillsättas till kammaren för att kontrollera att cellen inte har bildat en synaps med dubbelskiktet, medan celler kan vidhäfta ospecifikt till glastäckglas eller biskikt yta, synaptiskt-inblandade ytproteiner bör visas som distinkta kluster vid planet för den cell tvåskikts-gränssnittet, medan unengaged ytproteiner bör visas som diffus färgning runt omkretsen av cellen. Om denna metod misslyckas, bör en kontrollera deras celler via flödescytometri för att säkerställa att den speciella markören en hoppas att studera uttrycks i tillräcklig överflöd på cellytan. Vissa yta proteins är kända för att vara nedregleras över lång sikt in vivo kultur.
Medan detta protokoll detaljer speciellt hur man visualisera NK cell synaps bildning, kan SLB-systemet användas för att studera synaps bildning i någon immunocyt tänkbara enkelt genom substitution av den primära liganden i steg 5.11. Flera ligander kan också tillsättas samtidigt. Man behöver heller inte använda en streptavidin-biotin systemet för vidhäftning av ytproteiner inom biskiktet. Nickel-NTA: histidin interaktioner är också lönsamt. Emellertid, på grund av den höga hållfastheten och specificiteten av streptavidin: biotin interaktion, föredrar vårt labb detta system. Man kan också variera koncentrationen av celler tillsatta på dubbelskiktet från den föreskrivna tätheten i steg 5.13, samt längden på den efterföljande inkubationstiden för att observera synapser i olika skeden av mognad. Detta kan även göras levande, även om detta naturligtvis utesluter möjligheten att visualisera intracellulär structures (såvida de inte redan har märkts med en smält fluorescerande tag; vårt labb använder några sådana förändrade cellinjer). På grund av den höga graden av anpassning möjlig i detta protokoll, kan man använda den grundläggande SLB-tekniken, tillsammans med STED avbildning, för att ta itu med ett otroligt varierat utbud av frågor i immunologi, cellbiologi och biokemi, inklusive grundläggande lipid dynamik 15, synaps bildning 16, intracellulär signalering 17, och tumörcellmetastas 18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
| 18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
| Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
| A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
| Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
| Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
| 1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
| Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
| 96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
| Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
| FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
| QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
| Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
| HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
| Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
| 25x75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
| Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
| D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
| Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
| Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
| A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |
References
- Dustin, M. L., Long, E. O. Cytotoxic immunological synapses. Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers. Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).
- Tscharner, V., McConnell, H. M. Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces. Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).
- Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. J. Vis. Exp. , (2012).
- Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers. J. Vis. Exp. , (2012).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. , (2008).
- Michalet, X., Weiss, S. Using photon statistics to boost microscopy resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J. Vis. Exp. , (2014).
- Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS). Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).
- Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses. Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).
- Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells. Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).
- Wu, J. C., et al. Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture. Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).
