Introduction
De immunologische synaps (IS) ligt op een cruciaal knooppunt voor cel activatie en functie 1. Het is de primaire middel waardoor antigeenpresentatie en celgemedieerde immuniteit worden uitgevoerd. De vroegste microscopische studies van synapsvorming gebruikt een cel- conjugaat systeem 2. De belangrijkste beperking van deze benadering is dat de meeste conjugaten worden gezien in profiel, als het ware, waardoor weergave van de synaptische structuur zelf van de waarnemer beperken. In 1999, het Dustin laboratorium gericht deze beperking door gebruik te maken van de glas-ondersteunde lipidedubbellaag (SLB) techniek 3, die al eerder door de McConnel laboratorium van 4,5 had een pionier. Deze benadering verwijderd antigeen presenterende cellen (APC's) ten gunste van een glas ondersteunde vlakke lipide oppervlak waarin eiwitten kunnen worden bevestigd en vrij bewegen in twee dimensies. Met behulp van deze methode, waren Dustin en collega's in staat om direct tot peer in thij synaps met behulp van hoge resolutie fluorescentie microscopie, en voor de eerste keer krijg je een "face-to-face" blik op de structuur van de IS.
Met het gebruik van SLB systeem heeft de details waarmee de IS kan worden gevisualiseerd is beperkt door de beperkingen van de huidige beeldvormingstechnieken 6-8. Met behulp van standaard technieken verlichting, de minimale resolutie (dwz minimumafstand tussen twee verschillende voorwerpen waarin zij onderscheiden kunnen worden) is <200 nm op basis van Rayleigh criterium 9. Deze beperking belemmert de beeldvorming van zeer fijne, moleculaire schaal bouwsels de synaps en tot de ontwikkeling van superresolutie beeldvormingstechnieken 10-12, werd visualisatie van deze structuren beperkt tot beeldvorming van gefixeerde cellen met elektronenmicroscopie.
Met de recente komst van een verscheidenheid van super-resolutie technieken zoals SIM (gestructureerde verlichting microscopie), PALM (fotogeactiveerde lokalisatie microscopie), STORM (stochastische optische reconstructie microscopie), en STED 10-12, onderzoekers zijn nu in staat om deze synaptische structuren te bestuderen in ongekend detail, dat heeft op zijn beurt voorzien van een steeds duidelijker begrip van de IS. De voordelen van STED microscopie beschreven vóór 13. Hier beschrijven we super-resolutie beeldvorming met STED microscopie uitgerust met de nieuw ontwikkelde 660 nm uitputting laser. Vergeleken met de conventionele 592 nm uitputting laser, de 660 nm laser maakt een bredere selectie van fluorescerende kleurstoffen (zie http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), vooral deze rode fluoroforen.
Andere publicaties hebben de STED beeldvorming van NK-cel synapsen beschreven op antilichaam-gecoate glaasjes 13,14. Hier wordt de SLB-systeem in combinatie met super-resolutie STED microscopie aan de NK-cel synaps bestuderen. Deze techniek heeft het voordeel boven antilichaambeklede objectglaasjes van een vloeistof is mozaïek, waarbij het ingebedde manteleiwitten vrij in een vlakke tweedimensionale vlak (XY-vlak) kan bewegen. Dit bootst getrouwer de organische en mobiele oppervlak van een doelcel, en derhalve beter recapituleert de vorming van een fysiologisch relevante immune synaps.
Het doel van dit protocol is om de eindgebruiker met een gedetailleerde beschrijving van hoe het imago van de immunologische synaps van NK-cellen te bieden door het combineren van de SLB-systeem en super-resolutie STED microscopie. Het zal de eindgebruiker met de stappen die nodig zijn om te voorzien: de voorbereiding van de liposomen, bouwen-eiwit ingebed dubbellagen, bepalen de eiwit dichtheid op de lipidendubbellagen, en het verwerven van super-resolutie beelden met behulp van STED microscopie. Deze technieken zijn niet beperkt tot het gebied van immunologie, en kan breed worden toegepast in verschillende disciplines.
Protocol
1. Bereiding van liposomen
- Bereken de hoeveelheid chloroform gesuspendeerd voorraadoplossingen van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-cap biotinyl (Biotin-PE) voor het verwaterde aandelen maken op de gewenste uiteindelijke concentratie. Eindconcentraties van 400 uM en 80 uM DOPC biotine-PE fosfolipiden maken bij elk 10 ml, allereerst plaatsen 629 ui 10 mg / ml DOPC en 88 pl 10 mg / ml biotine-PE in afzonderlijke glazen chromatografiebuizen.
LET OP: het is belangrijk om glas Hamilton spuiten en glazen chromatografie buizen reinigen met het schoonmaken oplossing (1 L 95% ethanol en 120 ml water met 60 g kaliumhydroxide, KOH), terwijl het overbrengen-chloroform opgeschort voorraad oplossing van DOPC en biotine-PE. - Droog de chloroform met een stroom van argon in de chemische kap. Dicht de chromatografiebuis door parafilm.
- Betreft de nieuwe gedroogd liposomen een hoog vacuüm in een lyophilizER O / N om eventuele resten chloroform te verwijderen. Voor dezelfde dag voltooid, droog voor 60-90 min.
- Terwijl de vriesdroger runs, bereiden wat verdunning buffer. Voor dit protocol bereiden 25 ml met 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; en 2% (gew) n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG) wasmiddel. Meng de eerste twee ingrediënten samen eerst, dan verdringt zuurstof met argon voor het toevoegen van de droge OG poeder. Na voorbereiding, filtreer de OG oplossing 0,2 micron celluloseacetaat membraan en bewaar bij 4 ° C.
- Breng in twee schroefdop flessen 1 L Tris-buffer zoutoplossing in dezelfde concentraties, maar zonder OG. Plaats een gedestilleerd water gereinigd magnetische roerstaaf in de bodem van elk. Bereid 6 extra liters van het Tris-zoutoplossing buffer. Verwijderen van zuurstof uit de flessen met argon en plaats ze bij 4 ° C ook.
- Na vriesdrogen, los de gedroogde lipiden in de Tris-zoutoplossing OG buffer een 4 mM oplossing van elk merk. Naar het voorbeeldvolumes, 2 ml aan de DOPC buis en 0,2 ml biotine-PE-buis.
- Meng de biotine-PE lipiden met de DOPC lipiden. Dit verbetert de mobiliteit van de SLB, als de gekoppelde biotine de vloeibaarheid van het fosfaat kopgroepen kunnen beïnvloeden. Tot een eindconcentratie van 80 uM biotine-PE maken, meng 0,2 ml 4 mM biotine-PE en 1 ml van 4 mM DOPC. Voeg vervolgens 8,8 ml van de Tris-zoutoplossing OG buffer.
- Voor een eindconcentratie van 400 uM DOPC eenvoudig mengen 1 ml 4 mM DOPC met 9 ml Tris-zoutoplossing OG.
- Vul het sonicator met ijswater. Plaats de glazen buis met het verdunde fosfolipide in het midden van de sonicator met een hulpprogramma klem. Ultrasone trillingen de verdunde fosfolipide gedurende 10 minuten totdat de oplossing helder.
OPMERKING: ijs toevoegen in de sonicator waterbad om de temperatuur laag te houden, omdat geluidsgolven warmte zal genereren. - Vul de buis met argon om de zuurstof verdringen in de lucht boven de vloeistof en verzegeld met parafilm. 2. Dialyse van liposomen
- Snijd twee delen droog dialyseslang (molecuulgewicht cut-off: 12-14,000, diameter: 6.4 mm) van geschikte lengte (in dit voorbeeld, 40 cm), één voor elke fosfolipide verdunning van de rol.
- Rehydrateren de buizenstelgedeelten door hen te laten weken in een 200 ml gedestilleerd water in een bekerglas gedurende 2 minuten.
- Magnetron deze gedurende 5 minuten op een hoge stand, of ten minste tot het water op kookpunt komt.
- Een knoop aan het ene uiteinde van elke buis en spoel het interieur met enkele milliliters van Tris-zout-OG buffer. Daarna zorgvuldig knijp zoveel deze wasbuffer mogelijk de hoeveelheid buffer in de resterende minimaliseren.
- In een laminaire stroming kap, voeg de verdunde fosfolipiden in elke buis en klem de open einden met een kleine dialysebuis sluiting, zodat alle lucht uit te sluiten. Compleet lucht uitsluiting zal het offer van een klein volume van het monster nodig door klemmen onder de &# 8220; waterlijn ".
- Dompel de monsters in de eerder bereide flessen Tris-buffer zoutoplossing zonder OG. Verdringen van zuurstof in de fles met argon alvorens opnieuw verzegelen en plaats te roeren O / N bij 4 °.
- Breng de slang in een nieuwe fles Tris-buffer zoutoplossing zonder OG elke 12 h gedurende minstens 3 keer.
- Kort voor het verwijderen van de gedialyseerde lipiden, stelt een aantal kleine buisjes waarin de lipiden aliquot vult elk met argon om de zuurstof te verdringen.
- Na 36 uur, neem de dialyse flessen in de laminaire stroming kap en verwijder de dialyse buizen van de flessen. Hebben een bankje luier of beker bij de hand om de natte runoff verzamelen.
- Snijd de dialysebuizen boven de clip, verwijder dan de clip en het gedialyseerd lipide-oplossing via een pipet voorzichtig in een 1 ml porties in de pre-bereide buizen gevuld met argon gas op ijs.
- Aliquot de waterige liposoom-oplossing, gebruikt u de argon stroom aan zuurstof weer verdringen in elke buis.
- Bewaar de liposomen bij 4 °. Niet invriezen.
- Bereid een verdunningsreeks van gebiotinyleerd, fluorescentie-gemerkt antilichaam, 50 ul volume voor elke verdunning, bij de volgende concentraties: 0 nM (blanco), 10 nM, 50 nM, 100 nM en 500 nM. (Hierna aangeduid als "sample-serie").
- Voeg 1 ul van silicapareltjes in 6 wells van een 96-well V-bodemplaat. Zorg ervoor dat de kralen goed schudden voor pipetteren, omdat ze de neiging om zich te vestigen.
OPMERKING: Als hebben besteld droge korrels in plaats van geschorst, volgt u de instructies van de fabrikant om te verdunnen. - Om deze kralen, voeg 2 pl gemengde DOPC: biotinyl fosfolipiden bij een 1: 1 verhouding. Doe dit voor elk putje.
- Pulse de plaat op een vortexer met gemiddelde sterkte 3 maal gedurende 10 seconden elke interactie met de kralen en de fosfolipiden bevorderen.
- Voeg 150 ul 5% casein aan elk putje. Meng goed door en neer te pipetteren driemaal.
- Laat de plaat broeden in het caseïne-oplossing gedurende 10 minuten, dan was het uit. Te wassen, vult elk putje tot een totaal volume van 250 ui met HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS) met 1% humaan serum albumine (HSA). Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 2 min. Pipet en verwerp de top 200 ul van supernatant, en herhaal twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
- Voeg 50 ul van streptavidine op 333 ng / ml concentratie. Pulse de plaat weer 3x 10 sec, en laat het zitten op een shaker voor 15 min. Was 3x als in stap 6 tot en ongebonden streptavidine verwijderen.
- Voeg 50 ul van de fluorescent gelabelde gebiotinyleerde antilichaam uit de eerder bereide verdunningsreeks (zie stap 3.1) aan elk putje, en vervangt de plaat op de shaker gedurende 20-30 min. Was 3x als in stap 6 om ongebonden antilichaam te verwijderen.
- Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 100 ul HBS / 1% HSA, dan naar een FACS buis. Herhaal dit twee keer tezorgen voor efficiënte verwijdering van alle korrels uit de put, voor een totaal van 300 pl, en doe dit voor elke wel.
- Breng de verkregen buizen naar de flowcytometer. Het is tijd om ze te lezen.
- Voeg 1 druppel uit het flesje gemerkt "B" van de fluorescentie-intensiteit kalibratie (FIC) bead kit (hierna "standaardreeks") in een FACS buis en verdund met 300 ui HBS / 1% HSA.
- Lees deze buis, maar de data gewoon nog niet opnemen. Voor nu, gewoon zorgen dat de lege kralen goed zijn op nul gezet. Maak een histogram dat de fluorescentie van de kralen gemeten in het juiste kanaal, dan verschuiven de spanning van de excitatie laser naar beneden totdat de piek ligt in het uiterste linkerkant van het histogram.
- Verwijder de buis en voeg 1 druppel van elk van de andere 4 buizen in de reeks (label 1 tot 4) aan dezelfde buis. Nu, plaats de buis in de machine weer, en het hieruit resulterende gegevens, die moet verschijnen als 5 verschillende pieken. Lees elke individuele buis uit de reeks monsters.
- Met behulp van FACS-analyse software, trek een poort die de gehele breedte van elke piek in de standaard serie histogram op de helft van de maximale punt. Dat is een poort voor elke piek. Doe hetzelfde voor elk monster. Let op de MFI (gemiddelde fluorescentie-intensiteit) voor elke poort.
- Met behulp van een spreadsheet programma invoer de gemeten MFI-waarden in de juiste plaats. Ook het invoeren van de MESF (Moleculen van Equivalent Oplosbare Fluorochroom) waarden (gemiddeld aantal fluorescerende moleculen coaten elke kraal) voor elke fles die in de standaard serie. Deze informatie kan worden gevonden door het volgen van de aanwijzingen op de plastic pot de buizen kwam.
- Gebruik de spreadsheet plot de MFI tegen MESF waarden, waardoor een lineaire correlatie tussen het aantal fluoroforen en de gemeten intensiteit.
- Met de module 'eiwitten en labels in de micro-volume spectrofotometer de verhouding tussen kleurstof pro bepaleneiwit in het gemerkte antilichaam.
- Voer de labelingsefficiëntie van het monstereiwit, de gemiddelde diameter van de korrels bekleed met lipiden en de MFI-waarde voor elke invoer. De spreadsheet wordt automatisch gebruik maken van de formule uit de lijngrafiek gegenereerd in stap 3.16 naar de MESF waarden te berekenen voor elk eiwit verdunning en het zaaien dichtheid van het monster eiwit bij elke concentratie.
- Aliquot 15 ml perifeer bloed of buffy coat in een 50 ml conische buis. Verdun het bloed met PBS met 1% FBS in een verhouding van 1: 1.
- Voeg 13 ml Ficoll langzaam naar de bodem van de buis met 10 ml serologische pipet.
- Centrifuge deze buis gedurende 20 minuten bij 1200 xg het gaspedaal en het afbreken of het laagst instellingen.
- Na centrifugeren gebruik een serologische pipet tot de drijvende melkachtige witte middenlaag van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te verzamelen, which moeten zitten en de kruising tussen een heldere gele bovenste laag en een meer troebel lichtgekleurde onderlaag, die beide zitten boven een onderste laag van rode bloedcellen (RBC). NB Niet elke RBC te verzamelen in het verzamelen van de PBMCs.
- Plaats de verzamelde PBMC in een nieuwe 50 ml conische buis, en verdun tot de capaciteit met PBS met 1% FBS. Centrifugeer opnieuw, ditmaal met de rem en gaspedaal maximum voor 5 min bij 300 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml PBS met 1% FBS.
- Tel de cellen tijdens nogmaals op dezelfde instellingen centrifugeren als in stap 4.6.
- Verwijder het supernatant weer en resuspendeer de cellen in R10 medium bij een dichtheid van 10 miljoen cellen / ml.
- Neem 30 miljoen cellen in een 5 ml polystyreen buis en isoleren NK cellen met een magnetische scheiding kit volgens de instructies van de fabrikant. Na afsluiting, tellen de cellen één en resuspendeer in een dichtheid van 500,000 cellen / ml in R10 compleet medium (88% RPMI, 10% FBS, 1% HEPES, 1% natrium pyruvaat) aangevuld met IL-2 (100 U / ml). Kweken bij 37 ° C in een CO2 incubator en vervang 2-3 maal per week medium.
- Bereid 100 ml Piranha-oplossing door het mengen van 30% waterstofperoxide met zwavelzuur in een verhouding van 1: 3 in een bekerglas.
OPMERKING: voeren werken met schadelijke stoffen zoals zwavelzuur altijd in een correct aangewezen chemische dampkap. - In deze oplossing, dompel 2 rechthoekige # 1.5 dekglaasjes in piranha oplossing voor 20-30 min.
OPMERKING: Het is essentieel om de dekglaasjes reinigen door piranha oplossing. - Terwijl de dekglaasjes worden gereinigd, neem 1 tube van vooraf bereide 400 uM DOPC lipiden en 1 tube van eerder 80 uM biotine-PE lipiden voorbereid. Vervoeren ze op ijs om de argon tank.
- Verplaats zuurstof in een nieuwe microcentrifugebuis met argon,voeg samen de DOPC en biotine-PE bij een 1: 1 verhouding. Specifiek volume zal variëren op basis van experimentele behoeften, maar moet op minimaal 2 pl elk. Verdringen van zuurstof in het mengsel buis eenmaal meer met argon gas, en de individuele reagensbuizen ook, alvorens terug te keren van de laatste naar de koelkast.
- Nadat ze klaar schoonmaken Spoel de dekglaasjes met gedestilleerd water. Stel de dekglaasjes aan de lucht drogen gedurende enkele minuten.
- Zuig 1.5 ul van de liposoom mengsel bereid in stap 5.4 en aliquot in een druppel in een van de kamers baan van de kamer schuif. Het gebruik van 2 druppels per laan is typisch, maar niet noodzakelijk.
- Snel en efficiënt plaats de droge dekglaasje over de druppeltjes. Zorg ervoor dat de druppels voldoende afstand zodat zij niet fuseren zodra het dekglaasje geplaatst. Zorg er verder voor dat de druppels blijven ronde en goed gedefinieerde, zonder het aanraken van de randen van de wanden. Druk deze stevig aantussen en rond elke baan om een waterdichte afdichting tussen het dekglaasje en glijbaan zorgen.
- Markeer de posities van de druppels met een viltstift
- Pass 100 pl waterige 5% caseïne door de kamer om de bilaag te blokkeren. Probeer ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de stroom kamer.
- Injecteer 100 ui streptavidine bij een concentratie van 333 ng / ml in elke laan. Incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Daarna wassen door het uitvoeren van 3 ml HBS / 1% HSA door elke baan om de overtollige streptavidine verwijderen.
- Voeg 100 ul gebiotinyleerde fluorescent gemerkt anti-CD16 zoals Alexa Fluor 568 aan de eiwitconcentratie eerder bepaalde meest effectief in punt 3. Incubeer in het donker gedurende 20-30 minuten te zijn. Was opnieuw door het uitvoeren van 3 ml HBS / 1% HSA door elke baan.
- Flow 100 pl D-biotine in een concentratie 25 nM door de kamer om eventuele overmaat streptavidine de kans op niet-specifieke binding van st binden waardoor derhalvereptavidin aan de cellen.
- Telling NK-cellen en resuspendeer in een concentratie van 500.000 / ml in HBS / 1% HSA.
- Terwijl het draaien van de cellen af, was het D-biotine uit de kamer met een andere 3 ml HBS / 1% HSA per rijstrook.
- Controleer de mobiliteit van liganden op de SLB door fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP) op een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie voorafgaand aan het toevoegen NK-cellen.
- Nadat de cellen klaar centrifugeren en werden opnieuw gesuspendeerd in de gewenste concentratie, voeg 100 ul aan elke baan.
- Plaats de kamer in een 37 ° 5% CO2 incubator gedurende 30-60 min.
- Daarna worden, zet de cellen met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10-20 min. Was door het uitvoeren van 3 ml PBS door elke baan om de paraformaldehyde verwijderen.
- Voeg 400 ul blokkerende buffer (5% normaal ezel serum en 0,2% Tritron X-100 in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Vlek F-actine en perforine door adding 200 ui verdund fluorescentie-gemerkt falloïdine (1 eenheid / ml gemerkt falloïdine) en fluorescentie-gemerkt anti-perforin mAb (500 ng / ml anti-perforin mAb). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was door draaien 3 ml PBS. De kamer is klaar voor de beeldvorming.
- Zet alle benodigde hardware modules.
- Start de software voor beeldanalyse. Enable zowel resonante scannen en STED modules. Na het maken van deze keuzes, wacht ongeveer 3-5 minuten voor de software te starten.
- Klik op het tabblad "Configuration" aan de bovenkant van het scherm.
- Selecteer "Laser Config" en zet dan het witte licht en STED 592 nm lasers.
- Kies het 100x objectief, en lijn de excitatie laserstraal met de 592 nm uitputting laser.
- Selecteer de "Laser Config" module, schakel dan de 592 uitputtinglaser, en afslag op de 660 nm uitputting laser.
- Plaats de dia op het toneel, over de lens. Breng de cellen gebonden op de afgebakende bilayer regio in beeld met behulp van het witte licht lamp en de lenzen.
- Terug naar het tabblad "Acquisition", direct aan de rechterkant van het tabblad "Configuratie".
- Klik op het tabblad "Overschakelen naar WhiteLight", zet dan die module op en sleep de excitatie laser lijn naar de juiste golflengte.
- Selecteer de gewenste detector uit de lijst van beschikbare kamers, stel vervolgens het detectiebereik van de passende reeks van golflengten omvatten.
OPMERKING: NOOIT het detectiebereik direct onder de excitatiebundel. - Klik op de "Seqential" knop in de linker "Acquire" werkbalk om de Sequential Scanning dialoog in de bodem van de werkbalk linker brengen. Hierdoor kan de gebruiker meerdere sequenties toevoegen, elkeen andere excitatie balk een andere kleur. Klik op "Tussen Frames", en vervolgens de excitatiefrequentie, detector, en detectiebereik voor elke extra kleur als in de stappen 6.9 en 6.10.
- Als alle instellingen zijn geoptimaliseerd, hit "Start" om de overname te beginnen.
- Breng de gratis deconvolutie software (Huygens) met behulp van een instelling ontworpen voor STED deconvolutie, zoals eerder 13 beschreven.
3. Bepaling van antilichaam dichtheid van de lipide bilaag
4. isoleren en kweken van menselijke NK-cellen
5. Montage van de Glass-ondersteunde Planar lipidendubbellaag
6. Beeldvorming van het NK Synapse op lipidendubbellaag behulp STED
Representative Results
Figuur 1 toont het resultaat van het antilichaam dichtheid van de lipide bilaag. Het principe is standaard kraaltjes met de standaardkromme van MESF versus MFI via stroomcytometrie (A) maken. De MFI van de reeks monsters werd omgezet in MESF met de standaard curve. Het antilichaam dichtheid van de lipide bilaag lineair gecorreleerd met de concentratie antilichaam (B). Figuur 2 toont de triple-color STED beeld van NK synaps op glas support vlakke lipide dubbellaag. Anti-CD16 antilichaam op de lipide bilaag accumuleert, triggering F-actine vorming en de polarisatie en penetratie van perforine via de F-actine maas in het brandpunt panel van immunologische synaps NK-cellen. Met behulp van deze gecombineerde aanpak, kan men netjes houden aan de microclusters van fluorescent gelabelde anti-CD16 binnen de SLB, die direct weerspiegelt de clustering van CD16 op het NK cel. Vergeleken met de conventionele confocale beeld, de structuur van CD16 central cluster wordt gemakkelijker onderscheiden in beeld STED vanwege de uitgeputte ambient fluorescentie. Bovendien wordt de ultrastructuur van het actine cytoskelet zien met aanzienlijk verbeterde resolutie. In overeenstemming met eerdere waarnemingen 16,17, worden de perforine-positieve lytische korrels gezien gepositioneerd boven gebieden met een lage F-actine dichtheid in de STED afbeelding, een cruciaal detail die meestal is verloren in de confocale afbeelding.
Figuur 1. Dichtheid van 3G8 antilichaam op lipide bilaag. (A) lineaire correlatie tussen MESF en MFI voor standaard series. (B) Lineaire correlatie tussen eiwit dichtheid en concentratie monstereiwit verdunningsreeks, waarin het aantal fluorescentie-gemerkt eiwit monomeren per oppervlakte-eenheid als functie van toenemende concentratie op lipiden gecoate siLica kralen.
Figuur 2. STED beeldvorming van NK synaps op vlakke lipide dubbellaag. Primaire NK-cellen werden gestimuleerd op de SLB met gebiotinyleerde fluorescent gemerkt anti-CD16 (rood), vaste, permeabel, en vervolgens gekleurd met falloïdine (blauw) en anti-F-actine (groen). Een afzonderlijke cel werd voor het eerst in beeld gebracht onder de normale confocale instelling en de STED instelling. Confocale en STED beelden werden deconvoluted behulp Huygens software. Schaal bar, 1 micrometer. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Discussion
De nieuwheid van de huidige studie is dat het een combinatie van de SLB-techniek met STED NK cel synapsen bestuderen. Eerdere studies hebben de lipidebilaag afgebeeld met TIRF aan T-cel synapsvorming 8 en signalering molecuul mensenhandel op het plasmamembraan 6 bestuderen. Anderen hebben STED beeldvorming van NK-cel synapsen beschreven met behulp van antilichamen gecoat glas dia 13,14. De hybride werkwijze die hierin verder beschreven bouwt voort op deze inspanningen van de beeldvorming van de NK-cel synaps met de verbeterde helderheid geboden door super-resolutie beeldvorming over de lipidebilaag oppervlak, dat betere modellen het dynamische oppervlak van een APC.
Hoewel SLBs zijn kunstmatige membranen ontbreken van cytoskelet, lipid rafts en andere liganden die eigenlijke doel cellen of APC's bezitten, kan deze techniek belangrijke functies, zoals de mobiliteit en oriëntatie van liganden recapituleren. Dit maakt het SLB systeem dienen als reductionistische benadering ontleden tHij bijdrage van individuele receptoren en liganden voor de vorming van de IS en de dynamiek van IS. Het belangrijkste kenmerk van SLBs dat onderzoekers deze techniek met hoge resolutie beeldvormingstechnieken, zoals confocale microscopie en TIRF kunnen combineren. De introductie van STED microscopie nog verder verhoogt dit voordeel, het verstrekken van ongekende inzichten in IS onderzoek en de klinische toepassingen.
Een mogelijke kritiek van dit systeem is dat de SLB het complex oppervlak van een APC niet adequaat nabootsen en dus het potentieel niet-fysiologische anatomische kenmerken in de resulterende synapsen. Hoewel het waar is dat de beperkte repertoire van oppervlaktemoleculen op de SLB niet volledig herhalen het heterogeen bevolkte oppervlak van een APC, kan deze limiet ook voordelig zijn doordat zij kunnen onderzoekers de invloed van afzonderlijke receptor en ligand interacties op synapsvorming bepalen .
THier zijn een aantal cruciale stappen in het proces. Een van de meest kritische is dat oxidatie van de liposomen worden voorkomen door voortdurend met argon om de zuurstof in de buis en oplossing verplaatsen zoals in stap 1.10, 2.6 en 2.11. Oxidatie van de lipiden leidt tot verminderde lipiden mobiliteit, waardoor de mogelijkheid van oppervlakte-eiwitten vrij kunnen bewegen en deelnemen synaptische structureren belemmeren. Evenzo is het ook cruciaal voor al chloroform in het liposoom verwijderd door lyofilisatie (stap 1.2). Bij het bepalen van eiwit dichtheid in de lipide bilaag, is het van belang om eerst dispergeren silicium korrels in een homogene suspensie vrij van clusters. Indien nodig, kan sonicatie kralen worden toegepast. Bij de montage van de SLB, de eerste stappen (5,1-5,8), waarin de dekglaasjes worden gereinigd, de druppels zijn geplaatst, en dekglaasje wordt aangebracht zijn van vitaal belang. Een fout in een van deze kan noodzakelijk het starten van het experiment boven (vanaf het begin van hoofdstuk 5). Daarom is hetgoede gewoonte om meer coverslips schoon te maken dan nodig zal zijn om tijd te besparen in het geval van een ongeluk.
Niet-clustering is de meest voorkomende probleem bij het werken met dit systeem. Indien bij het visualiseren van de cellen in de laatste stap, een niet fluorescerend synapsen vinden, zijn er een paar stappen die genomen kunnen worden. Een vlek van de verwante celoppervlak receptor worden toegevoegd aan de kamer om te verifiëren dat de cel niet vormde een synaps met de bilaag, terwijl cellen niet-specifiek hechten aan de glazen dekglaasje of bilaag oppervlak synaptisch-betrokken oppervlakte-eiwitten moeten weergegeven als afzonderlijke clusters op het vlak van de cel-bilaag-interface, terwijl unengaged oppervlakte eiwitten diffuse kleuring verschijnt rond de omtrek van de cel. Indien deze methode niet, moet men de cellen via flowcytometrie te controleren of het specifieke marker men hoopt studeren wordt uitgedrukt in gepaste overvloed op het celoppervlak. Bepaalde oppervlak proteins is bekend dat neerwaarts gereguleerd op lange termijn in vivo kweken.
Hoewel dit protocol informatie specifiek hoe NK cel synapsvorming visualiseren, kan de SLB-systeem worden gebruikt om synapsvorming studeren in elke immunocyt denkbare simpelweg door substitutie van de primaire ligand in stap 5.11. Meerdere liganden kunnen ook gelijktijdig worden toegevoegd. Men hoeft ook geen streptavidine-biotine systeem voor het hechten van de oppervlakte-eiwitten in de bilaag. Nikkel-NTA: histidine interacties zijn ook haalbaar. Echter, vanwege de hoge sterkte en specificiteit van de streptavidine: biotine interactie, ons lab voorkeur dit systeem. Men kan ook variëren van de concentratie van cellen toegevoegd aan de bilaag van de voorgeschreven dichtheid in stap 5.13, alsmede de duur van de daaropvolgende incubatietijd om synapsen observeren in verschillende stadia van rijping. Dit kan zelfs live worden gedaan, hoewel dit natuurlijk sluit de mogelijkheid van het visualiseren van intracellulaire structures (tenzij ze al zijn gelabeld met een gesmolten fluorescerend label; ons lab maakt gebruik van een paar van zulke veranderde cellijnen). Door de hoge mate van maatwerk mogelijk in dit protocol, kan men de elementaire SLB techniek te gebruiken, samen met STED beeldvorming, een ongelooflijk breed scala aan vragen in de immunologie, celbiologie en biochemie aan te pakken, met inbegrip van basis lipide dynamiek 15, synapsvorming 16 intracellulaire signalering 17 en tumorcelmetastase 18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
| 18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
| Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
| A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
| Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
| Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
| 1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
| Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
| 96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
| Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
| FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
| QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
| Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
| HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
| Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
| 25x75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
| Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
| D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
| Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
| Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
| A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |
References
- Dustin, M. L., Long, E. O. Cytotoxic immunological synapses. Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers. Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).
- Tscharner, V., McConnell, H. M. Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces. Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).
- Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. J. Vis. Exp. , (2012).
- Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers. J. Vis. Exp. , (2012).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. , (2008).
- Michalet, X., Weiss, S. Using photon statistics to boost microscopy resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J. Vis. Exp. , (2014).
- Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS). Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).
- Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses. Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).
- Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells. Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).
- Wu, J. C., et al. Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture. Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).
