Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Massespektrometrisk Approaches at studere proteiners struktur og interaktioner i lyofiliserede pulvere

doi: 10.3791/52503 Published: April 14, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Amid brint / deuterium udveksling (ssHDX-MS) og side-kæde fotolytisk mærkning (SSPL-MS) efterfulgt af massespektrometrisk analyse kan være værdifulde til at karakterisere frysetørrede formuleringer af terapeutiske proteiner. Mærkning efterfulgt af passende proteolytisk fordøjelse giver proteinstruktur og interaktioner skal kortlægges med peptid-niveau opløsning. Da proteinet strukturelle elementer er stabiliseret af et netværk af kemiske bindinger fra de vigtigste-kæder og sidekæder af aminosyrer, specifik mærkning af atomer i aminosyreresterne giver indsigt i struktur og konformation af proteinet. I modsætning til rutinemæssige metoder, der anvendes til at studere proteiner i frysetørrede faste stoffer (f.eks FTIR), ssHDX-MS og SSPL-MS give kvantitative og site-specifikke oplysninger. Omfanget af deuterium inkorporering og kinetiske parametre kan relateres til hurtigt og langsomt udveksle amid pools (N hurtigt, N langsom) og direkte afspejler de degree proteinfoldning og struktur i lyofiliserede formuleringer. Stabil fotolytisk mærkning ikke undergår back-udveksling, en fordel over ssHDX-MS. Her giver vi detaljerede protokoller for både ssHDX-MS og SSPL-MS, ved hjælp af myoglobin (Mb) som model protein i frysetørrede formuleringer, der indeholder enten trehalose eller sorbitol.

Introduction

Protein narkotika er den hurtigst voksende sektor i den biofarmaceutiske industri og tilbyde lovende nye behandlinger for tidligere komplicerede sygdomme, herunder hormonelle forstyrrelser, kræft og autoimmune sygdomme 1. I 2012 det globale bioterapeutiske marked nåede 138 milliarder dollar, og forventes at nå 179 milliarder dollaren i år 2018 2. Proteiner er større og mere skrøbelig end konventionelle småmolekylelægemidler og så er mere modtagelige for mange typer af nedbrydning 3. For at sikre tilstrækkelig holdbarhed og stabilitet, er proteinlægemidler ofte formuleret som frysetørret (dvs. frysetørret) faste pulvere. Dog kan en protein stadig undergå nedbrydning i fast form, især hvis dens native struktur ikke bevares under lyofiliseringsprocessen 4,5. Sikre, at strukturen er blevet bibeholdt kun er muligt, hvis der er analysemetoder, kan sonde protein konformation i fast tilstand med sufficient opløsning.

NMR-spektroskopi 6 og røntgenkrystallografi 7 er de almindeligt anvendte højopløselige metoder til at vurdere proteinstruktur i opløsning, og krystallinske faste stoffer 8. På grund af karakteren af hjælpestoffer og de ​​forarbejdningsmetoder, der anvendes, frysetørrede formuleringer protein er normalt amorfe snarere end krystallinsk 9. Den manglende homogenitet og mikroskopisk orden gør de ovennævnte teknikker upraktisk for proteiner i amorfe faste stoffer. Fourier transformation infrarød spektroskopi (FTIR) 10, Raman spektroskopi 11 og nær infrarød spektroskopi (NIR) 12 regelmæssigt er blevet anvendt af den biofarmaceutiske industri at sammenligne sekundær proteinstruktur i lyofiliserede pulvere til det native opløsning-state struktur. Men disse metoder er lav opløsning og kan kun give oplysninger om de globale ændringer i sekundær struktur. Solid-state strukturel karakterisering ved hjælp af FTIRhar vist enten svag 13,14 eller dårlig 15 korrelation med langtidsopbevaring stabilitet. Disse begrænsninger fremhæver behovet for egnede metoder højopløselige at identificere protein strukturelle forstyrrelser i solid-state.

Kemisk mærkning kombineret med proteolyse og massespektrometrisk analyse har vist sig som en stærk tilgang til overvågning proteinstruktur og molekylære interaktioner i vandig opløsning. I farmaceutisk udvikling, har HDX-MS blevet anvendt til epitopkortlægning i antigen-antistof-interaktioner 16,17, til kort receptor-interaktioner 18, at overvåge virkningerne af post-translationelle modifikationer på konformationen af proteinlægemidler 19 og sammenligne batch-til-batch variation i udviklingen af biosimilars 20. Tilsvarende har fotoaktiverbare ligander blevet anvendt til at identificere lægemiddelvirkninger og at bestemme bindingsaffinitet og specificitet af lægemiddel-receptor-vekselvirkninger 21,22. Til eXtend anvendelsen af ​​disse metoder til frysetørrede formuleringer, har vores gruppe udviklet solid-state brint deuterium udveksling massespektrometri (ssHDX-MS) og solid-state fotolytisk mærkning massespektrometri (SSPL-MS) til at studere protein konformationer og hjælpestoffer interaktioner i frysetørrede prøver med høj opløsning.

I både ssHDX-MS og SSPL-MS proteinet mærkes under ideelle reaktionsbetingelser i lyofiliserede faststoffer og prøverne blev derefter rekonstitueret og analyseres ved massespektrometri med eller uden proteolytisk fordøjelse. ssHDX-MS giver oplysninger om primære kæde udsættelse for deuterium dampe, mens SSPL-MS giver oplysninger om miljøet i sidekæder (figur 1). De to metoder kan derfor giver supplerende oplysninger om protein konformation i fast tilstand. Her giver vi en generel protokol for at studere proteiner i frysetørrede faste stoffer ved hjælp ssHDX-MS og SSPL-MS (figur 2), ved hjælp af Mb somen model protein. Vi viser evnen af ​​de to metoder til at skelne forskelle i formuleringer med to forskellige excipienser.

Figur 1
Figur 1:. SsHDX og SSPL foranstaltning proteinstruktur i lyofiliserede faststoffer gennem forskellige mærkning mekanismer (A) i HDX, rygraden amide hydrogener udveksling med deuterium som en funktion af protein struktur og D2O tilgængelighed. I solid-state, hastigheden og omfanget af deuterium udveksling afhænge af niveauet af D 2 O sorption, protein mobilitet (udfoldning og genfoldning hændelser), og arten af hjælpestofferne til stede i den faste matrix. (B) I PL, UV-bestråling ved 365 nm initierer dannelsen af et reaktivt carben mellemprodukt fra diazirine funktionelle gruppe pLeu og indsættes ikke-specifikt i nogen XH obligation (X = enhver atom), eller added over en C = C binding i dens umiddelbare nærhed. I fast tilstand, hastigheden og omfanget af mærkning afhænge af den lokale koncentration af mærkningsmiddel, bestrålingstid, protein struktur og arten af ​​excipienser til stede i den faste matrix. Paneler A og B viser den maksimale teoretiske mærkning, som kan opstå på rygraden og sidekæder henholdsvis protein.

Figur 2
Figur 2: Skematisk viser solid-state HDX-MS (A) og PL-MS (B) for protein i lyofiliseret formulering.

Protocol

1. Forberedelse af prøver og Lyofilisering

  1. Dialysere den nødvendige mængde Mb stamopløsning mod en passende buffer og filtreres gennem et 0,22 um sterilfilter.
  2. Forbered den nødvendige mængde excipienser og foto-leucin (L-2-amino-4,4-azi-pentansyre; pLeu) stamopløsninger i egnet puffer. Filter stamopløsninger gennem et 0,22 um sterilt filter.
  3. Fremstille formuleringer som vist i tabel 1 under anvendelse af stamopløsninger af protein, excipienser, pLeu og puffer.
  4. Filter prøver gennem et 0,22 um sterilt filter for at fjerne eventuelle partikler, der er dannet i trin 1.3. Fyld prøverne separat som 0,2 ml i 2 ml hætteglas. Brug hætteglas, der er transparent for UV (365 nm) lys for at aktivere pLeu i SSPL-MS studier.
  5. Load hætteglas i en lyofiliseringsapparat og indlede frysetørring ved at designe en passende frysetørring cyklus.
    1. Her fryse prøverne ved -40 ° C, efterfulgtaf primær tørring under vakuum (70 mTorr) ved -35 ° C i 12 timer og sekundær tørring ved 25 ° C i 12 timer. Andre lyofiliseringsmetoder cykler og tørring metoder (fx spraytørring), kan også anvendes.
  6. Efterfylde hætteglas indeholdende frysetørrede prøver med nitrogen uden reduktion.
Formuleringer Sammensætning (mg / ml) før lyofilisering
Mb Trehalose Sorbitol pLeu c Kalium, phosphat, pH 7,4
MBT a 1.7 3.4 - - 0.4
MBS a 1.7 - 3.4 - 0.4
MBT + pLeu B 1.7 3.4 - 14.3 x 10 -3 til 1,43 0.4
MBS + pLeu B 1.7 - 3.4 14.3 x 10 -3 til 1,43 0.4

Tabel 1:... Sammensætning af frysetørrede Mb formuleringerne A Formuleringer anvendt til ssHDX-MS undersøgelse B Formuleringer anvendt til SSPL-MS undersøgelse c L-2-amino-4,4-azipentanoic syre eller foto-leucin (pLeu). pLeu ved fem forskellige koncentrationer (14,3 x 10 -3 til 1,43 mg / ml) svarende til 1x, 10x, 20x, 50x og 100x molært overskud i forhold til Mb blev co-lyofiliseret med MBT og MBS formuleringer.

2. ssHDX-MS for intakt protein

  1. Tilføj en mættende mængde (~ 440 g) K 2 CO 3 til 200 ml D2O previously er placeret i det nedre kammer af en ekssikkator. Forsegl ekssikkator lufttæt og lad det ækvilibrere ved 5 ° C, indtil en stabil relativ fugtighed (RH) på ~ 43% er nået. Andre RH-værdier af interesse kan opnås ved at vælge forskellige mættede saltopløsninger 23,24.
  2. Indled ssHDX reaktioner ved at placere reducerede hætteglas indeholdende den frysetørrede protein i det øvre rum i ekssikkator. Forsegl ekssikkator lufttæt og inkuberes ved 5 ° C for at tillade HDX at forekomme (figur 2A).
  3. Saml ssHDX prøver på forskellige tidspunkter i tre eksemplarer. For Mb formuleringer, indsamle prøver på ni tidspunkter 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 og 144 time.
  4. Cap hætteglassene umiddelbart efter tilbagetrækning fra ekssikkator og slukke reaktionerne ved flash indefrysning hætteglassene i flydende nitrogen. Opbevar hætteglas ved -80 ° C indtil massespektrometrisk analyse.
  5. Analysere prøver ved hjælp af en passende høj opløsning væskekromatografi-mass SpectromEtry (LC-MS) metode. Design eller købe en egnet nedkølet LC-system for at minimere back-udveksling under analyse prøve. Brug opsætningen af kolonnen køleanlæg og LC-MS metoden tidligere rapporteret 25.
    BEMÆRK: Da satsen for amid proton udveksling afhænger pH og temperatur, kan deuteroner indarbejdet i proteinet udveksle med hydrogen til stede i den mobile fase ("back udveksling"), forårsager et tab af information. Selv om en sur pH (pH 2,5) af stoppuffer og HPLC opløsningsmidler kan minimere back-udveksling i vid udstrækning at reducere temperaturen (≤0 ° C) ved hjælp af en egnet kolonne kølesystem kan yderligere at beskytte proteinet fra back-udveksling .
  6. Tilslut prøve loop og protein fælde til ventilen, som automatisk styrer afsaltning og eluering proces. Kalibrer massespektrometer ved at injicere en TOF lav koncentration tuning mix i massespektrometret i m / z række 200-3,200. Den immobiliseredepepsin kolonne og analytisk kolonne er ikke påkrævet for intakt protein analyse.
  7. Indstil temperaturen i køle- systemet ≤0 ° C og vente for systemet at opnå en stabil driftstemperatur på ~ 0 ° C.
  8. Hurtigt overføre prøver fra -80 ° C i flydende nitrogen for massespektrometrisk analyse. Ved hjælp af pincet forsigtigt trække hvert hætteglas fra flydende nitrogen og rekonstituere prøven ved tilsætning af et specifikt volumen iskold stoppuffer indeholdende 0,2% myresyre (FA) (pH 2,5) og 5% methanol i vand til hætteglasset.
  9. Programmere en egnet HPLC og massespektrometri metode ved hjælp af kontrol software. For Mb formuleringer desalt prøve indeholdende 20 pmol Mb i proteinet fælde i 1,7 minutter med 5% acetonitril, 95% vand og 0,1% myresyre (FA), og der elueres med en gradient øges til 80% acetonitril, 20% vand og 0,1 % FA i 3,3 min. Saml massespektre over m / z interval 200-3,200.
  10. At bestemme massen af ​​intaktprotein, indsamle oplysninger om en ikke-deutererede proteinprøve (dvs. protein, som ikke udsættes for ssHDX) i vandig opløsning ved anvendelse af fremgangsmåden i trin 2.9.
  11. Få masser af deuterede og deutererede prøver ved deconvoluting de rå spektre ved hjælp af data analyse software. Her indstilles masseinterval til 15,000-18,000 Da massen beslutning til 1,0 Da, og den maksimale højde til 90% til at beregne massen af ​​Mb.
  12. Beregn antallet af deuteroner indarbejdet i det intakte protein (her Mb) ved at trække massen af ​​ikke-deutererede protein fra massen af ​​deutereret protein ved hver udveksling tidspunkt.
  13. Beregn procent deuterium optagelse i forhold til det teoretiske maksimum ved hjælp af den følgende ligning (ligning 1)
    Ligning 1
    hvor det samlede antal udskiftelige amider = samlet antal aminosyrer - antal prolinrester - 2 ("2" regnskab for N-terminale aminogruppe og amid brint der undergår hurtig back-udveksling).
  14. Monter ssHDX kinetiske data ved hjælp af en egnet eksponentiel ligning. En bieksponentiel ligning (ligning 2) er normalt den enkleste, der giver en rimelig tilnærmelse til ssHDX data. I denne undersøgelse, for MBT og MBS, passer til dataene til en bieksponentiel model, der tildeler deuteroner til "hurtig" og "langsom" udveksle pools.
    Ligning 2
    hvor N hurtig og N langsom er antallet af udskiftelige amider i "hurtig" og "langsom" udveksling pools henholdsvis og K hurtig og k langsom er første ordens hastighedskonstanter forbundet med de to puljer.

3. ssHDX-MS for protein ved peptidniveauet

  1. Udfør ssHDX ved at følge trin 2.1 til 2.8, med følgende ændringer i trin 2.6. Tilslut den immobiliserede pepsin collonne og analytisk kolonne til ventilen som tidligere rapporteret 25 og erstatte protein fælde forbundet med ventilen med et peptid fælde. Kalibrer massespektrometer ved at indstille masse-til-ladningsforhold i intervallet fra 100 til 1.700.
    Bemærk: Under rekonstituering (trin 2.8), kan et reducerende middel og denatureringsmiddel indgå i stoppuffer at lette pepsinfordøjelse af proteiner med disulfidbindinger (fx monoklonale antistoffer).
  2. Program en passende HPLC og massespektrometri metode ved hjælp af kontrol software. For Mb formuleringer fordøje prøver indeholdende 20 pmol Mb online med 0,1% FA, fælde og afsalte peptider til 1,7 min med 10% acetonitril, 90% vand og 0,1% FA i et peptid fælde. Elueres fragmenterne på analytisk kolonne med en gradient stigning til 60% acetonitril, 40% vand og 0,1% FA i 4,0 min. Anskaf massespektre over m / z interval 100-1,700.
  3. Identificere de peptiske fragmenter ved MS / MS-analyse af endeuterede proteinprøve. Brug massespektrometri software til at sammenligne eksperimentelle masser af peptid fragmentioner til den forudsagte masser af peptidfragmenter i en brugerdefineret database. Indstil en masse cut-off punkt (f.eks 10 ppm) for at identificere masserne med lav fejl. For peptider matchede udarbejde en liste bestående af (i) peptidsekvens, (ii) opladningstilstand, og (iii) retentionstid.
  4. Brug listen frembragt i trin 3.3 at kortlægge og bestemme det gennemsnitlige antal deuteroner inkorporeret for hver pepsin fordøje fragment. Dette kan opnås ved at anvende egnede HDX-MS dataanalyse software 24.
  5. For at beregne procent deuterium optagelse og til at passe ssHDX kinetiske data for hver af de peptiske fragmenter Følg trin 2.13 og 2.14. I denne undersøgelse HDX kinetiske data for hver af seks ikke-redundant pepsin fordøje fragmenter fra MBT og MBS formuleringer blev monteret på en bieksponentiel association model (ligning 2).

4. SSPL-MS for intakt ProTEIN

  1. Til at begynde fotolytiske mærkningsreaktionen, første kontakt på UV tværbinderen og lade lamperne til at varme op i 5 min. Sørg for, at UV-kilden er udstyret med lamper af bølgelængde 365 nm for at aktivere diazirine gruppe pLeu.
    ADVARSEL: Åbn aldrig døren til UV tværbinderen når lygterne er tændt. Protect øjne og hud mod udsættelse for UV-lys, hvis kilde ikke er omsluttet af en UV-beskyttende glasdør.
  2. Sluk for UV tværbinder før du åbner døren. Når lamperne slukkes, Tag hætten af hætteglas indeholdende den lyofiliserede formulering og placere dem inden i UV tværbindingsmiddel kammer som vist i figur 2B. Bestråle prøverne med UV-lys i 40 min.
  3. Udfør kontrolforsøg ved at følge trin 4.1 til 4.3 for (i) prøver, frysetørret uden pLeu og (ii) prøver frysetørret med pLeu rekonstitueret i vand.
  4. Cap og opbevares hætteglassene ved -20 ° C indtil massespektrometrisk analyse.
  5. Reconstitute de faste prøver ved at tilsætte en passende mængde af massespektrometri kvalitet destilleret vand for at bringe koncentrationen til 2 uM.
  6. Til at begynde analyse prøve Følg trin 2.6 og 2.9.
    BEMÆRK: Da back-udveksling er ikke et problem med kovalent mærkning, går SSPL-MS ikke kræver en speciel nedkølet LC system.
  7. For at bestemme den native masse af protein, indsamle oplysninger om en proteinprøve, der ikke er underkastet SSPL ved at følge trin 2.9. Få masser af umærkede og mærkede prøver ved deconvoluting den rå spektre som forklaret i trin 2.11.
  8. Beregn antallet af pLeu iblandes efter følgende formel:
    Ligning 3
    hvor M L er massen af mærket protein, M N er massen af nativt protein og 115 er den gennemsnitlige masse (Da) tilsat til native protein efter enkelt pLeu inkorporering. Bemærk, at mærkningen reaktion sker med the tab af N2 (28 Da). Den monoisotopisk masse pLeu er 143,07.
  9. Procenterne udregnes af protein befolkninger med forskellige antal etiketter ved hjælp tophøjder fra de ekstraherede ion kromatogrammer.
    Ligning 4
    hvor "i" betegner det antal etiketter, PH i betegner tophøjden for mærket protein L I og PH u betegner tophøjden af det umærkede protein som observeret ved massespektrometri.

5. SSPL-MS for Protein på peptidniveauet

  1. Udfør SSPL ved at følge trin 4.1 til 4.4.
  2. For peptid niveau analyse rekonstruere faste prøver i ammoniumbicarbonat-puffer (100 mM, pH 8,0).
  3. Efter rekonstituering blandes det mærkede protein opløsning med trypsin ved 10: 1 molforhold af protein til trypsin og inkuberes ved 60 ° C i 16 timer.
  4. Stands reaktionen ved tilsætning af 0,1% FAi vand til prøven til opnåelse af slutkoncentration på 2 uM protein.
  5. Tilslut prøvesløjfe, peptid fælde og analytisk søjle til ventilen er forbundet med HPLC-systemet.
  6. Programmere en egnet HPLC og massespektrometri metode ved hjælp af kontrol software. For Mb formuleringer injicere 20 pmol af det fordøjede protein i prøven løkken, og afsalte peptiderne i et peptid fælde i 1,5 min med 5% acetonitril, 95% vand og 0,1% FA, efterfulgt af en eluering i den analytiske søjle med gradient stige til 55% acetonitril, 45% vand og 0,1% FA i 22 min. Saml massespektre over m / z interval 100-1,700.
  7. Forbered en teoretisk masse liste for peptid-pLeu adducter hjælp af en online værktøj som ExPASy 26 med antal pLeu tidligere beregnet ud fra det intakte protein analyse. Medtag mindst 4 savnet spaltninger. Bemærk, at mærkningen reaktion forekommer med tab af N2. Derfor er massen af ​​peptid-pLeu adduct = masse af umærket prøveptic peptid + n (masse pLeu) - n (masse af N 2), hvor "n" er antallet af pLeu indarbejdet.
    BEMÆRK: Hvis massen analyse af intakt protein viste op til tre mærkede populationer af protein, overveje op til tre mulige pLeu etiketter pr peptid. For et peptid med masse på 1000 Da, ville den teoretiske masse af peptid-pLeu addukt med 1 pLeu inkorporering være 1.000 + 1 (143) - 1 (28) = 1.115 Da. Tilsvarende de teoretiske masser af peptid-pLeu addukter med 2 pLeu 3 pLeu osv ville være 1.230 Da, 1.345 Da, etc., henholdsvis.
  8. Brug massen analyse software til at matche den teoretiske masse liste frembragt i trin 5.7 med masserne observeret eksperimentelt. Indstil en masse cut-off punkt (f.eks 50 ppm) for at identificere masserne med lav fejl.
  9. For peptider matches, bestemme det faktiske antal pLeu indarbejdet ved hjælp af formlen under trin 4.8 (ligning 3), hvor M L og M N er masserne af mærketog native peptid hhv.

Representative Results

Her har ssHDX-MS og SSPL-MS blevet anvendt til at undersøge virkningen af ​​excipienser på kropsbygning og faststof-interaktioner af frysetørrede Mb formationer. Koncentrationerne af protein og hjælpestoffer, der anvendes i denne undersøgelse er givet i tabel 1. Repræsentative resultater fra ssHDX-MS og SSPL-MS analyse af lyofiliserede Mb opnået ved at følge ovennævnte protokoller præsenteres.

Deuterium optagelse på intakt protein niveau

ssHDX-MS er i stand til at skelne mellem Mb formuleringer på intakt niveau. Den deconvoluted massespektre af intakte Mb efter 144 timer i ssHDX fra formulering MBS viste større deuterium optagelse end formulering MBT (figur 3A). På et gennemsnit, MBS viste 46% større deuterium optagelse end MBT (tabel 2).

Figur 3 Figur 3: ssHDX-MS for intakte Mb: (A) Deconvoluted masse spektre af deutererede intakte Mb fra formuleringer MBT (fuldt optrukket linie) og MBS (stiplet linje) efter 144 timer i ssHDX. Den deconvoluted massespektret af deuterede intakte Mb er også vist (punkteret linje). (B) ssHDX kinetik for intakte Mb i formuleringer MBT (fuldt optrukket linie) og MBS (stiplet linje). Tidsforløbet for ssHDX blev tilpasset til en ligning for to fase eksponentiel forening hjælp Graph Pad Prism software version 5 (n = 3, ± SD).

Deutereringen kinetik for intakt MBS og MBT er ens på tidlige tidspunkter (1-4 h), men MBS viste øget deuterium udveksling med stigning i tid (8-144 timer) (figur 3B). Dette antyder at det er vigtigt at udvælge længere tidspunkter for ssHDX ved lavere RH og temperaturforhold. Ligeledes kan D2O sorption og diffusionsproces påvirke hastigheden af ssHDX på et tidligt tidspunkt point'er. Vores tidligere undersøgelser har vist, at fugtsorption i ssHDX er komplet i en periode på timer, og har minimal bidrag til at udveksle kinetik over denne tid. Den fundne hyppighed og omfang af udvekslingen, er derfor ikke blot foranstaltninger af D2O adsorption 27,28. De små fejl barer i figur 3B, indikerer standardafvigelser fra tre uafhængige ssHDX-MS prøver viser, at forsøget er meget reproducerbar.

Deuterium Optagelse (%) B N hurtig c k hurtigt c N langsom c k langsom c
MBT a 15,9 ± 0,5 13,1 (0,8) 0,43 (0,03) 11,0 (0,9) 0.019 (0,001)
MBS a 23,2 ± 0,5 15,4 (0,7) 0,49 (0,04) 19,2 (0,6) 0,024 (0,002)
% Ændring d 46% 18% 14% 75% 26%

Tabel 2:. Kvantitative mål for deuterium optagelse i ssHDX studier af Mb formuleringer en Se tabel 1 for sammensætning B Procent deuterium optagelse i forhold til teoretiske maksimum af intakte Mb efter 144 timer af HDX ved 5 ° C, 43% RH (n = 3. , middelværdi ± SD). c Parametre bestemt ved lineær regression af ssHDX-MS kinetiske data. Tidsforløb af deuterium gengæld for intakt Mb blev monteret på en bieksponentiel forening model (Eqn. 2). Værdier i parentes er standardafvigelser for regressionsparametrene. D Den procentvise ændring i målingerne var calculated som 100 x [(værdi fra MBS - værdi fra MBT) / (værdi fra MBT)].

Regressionsparametrene (N hurtigt, N langsom, k hurtig og k langsom) for deuterium uptake kinetik for MBT og MBS er givet i tabel 2. Selvom N hurtige og N langsomme værdier er større for MBS end MBT, forskelle i N langsom værdierne var højere end forskelle i N hurtige værdier. Konkret N hurtige værdi er kun 18% større i MBS end i MBT, mens N langsom værdi er 75% større i MBS end i MBT. Dette antyder, at de mindre N langsomme værdier i MBT kan skyldes den højere retention af Mb struktur eller beskyttelse af amidgrupper af excipienser, som er udsat for D2O i MBS. Men de detaljerede mekanismer ikke klart forstået. De hastighedskonstanter (K hurtig og K langsom) for begge formuleringer er meget ens.

Deuterium optagelse på peptidet niveau

Efter pepsinfordøjelse, blev identificeret i alt 52 peptider. Seks ikke-redundante fragmenter svarende til 100% af Mb sekvens blev anvendt til analysen rapporteret her. Yderligere oplysninger kan fås ved hjælp af overlappende fragmenter, som rapporteret af vores gruppe tidligere 24. Den procentvise deuterium optagelse for hvert peptid blev beregnet, og resultaterne fra 144 HR prøver afbildet (figur 4A). HDX kinetik for de seks peptiske fragmenter viste bieksponentiel adfærd (figur 4B), i overensstemmelse med subpopulationer af amide hydrogener undergår "hurtig" og "langsom" udveksling.

Figur 4
Figur 4: ssHDX-MS for Mb på peptidet niveau: (A) Procent deuterium optagelse for 6 ikke-Redundant peptiske fragmenter fra Mb i formuleringer MBT (grå) og MBS (hvid) efter 144 timer i HDX. (B) ssHDX kinetik for seks ikke-redundante peptiske fragmenter fra Mb i formuleringer MBT (optrukket linje) og MBS (stiplet linie). Tidsforløbet for ssHDX blev tilpasset til en ligning for to fase eksponentiel forening hjælp Graph Pad Prism software version 5 (n = 3, ± SD).

Regression parametre for de redundante peptider er præsenteret i figur 5. Som de monterede hastighedskonstanterne for peptidfragmenter er ikke gennemsnittet hastighedskonstanten for individuelle amider, de observerede hastighedskonstanter for peptiske fragmenter kan ikke lineært relateret til dem for det intakte protein. N hurtige værdier for de fleste af de peptiske fragmenter (undtagen fragment 56-69) i formuleringer MBS var lidt højere end i MBT (figur 5A). Tilsvarende k hurtige værdier viste generelt lille forskel mellem formulations og i forskellige områder af Mb molekyle (figur 5B). Men N langsomme og k langsomme værdier for MBS er signifikant større i alle fragmenter end for MBT (figur 5C og 5D). Den betydelige stigning i N langsom og k langsom til MBS kan afspejle større mobilitet af amidgrupper i "langsom" udveksle pools.

Figur 5
Figur 5: ssHDX kinetiske parametre for Mb peptiske peptider: N hurtigt (A), k hurtigt (B), N langsom (C) og k langsom (D) opnåede værdier fra lineær regression af ssHDX-MS kinetiske data for seks ikke-redundante peptiske peptider fra Mb i formuleringer MBT (grå) og MBS ( hvid) (n = 3, ± SE). </ P>

Fotolytisk mærkning på intakt protein niveau

Mb bestrålet i nærvær af 20x overskud pLeu dannet flere MB-pLeu addukter, som påvist ved LC-MS (figur 6A). Den deconvoluted spektre for MBT bestrålet i 40 minutter med 20x pLeu viste op til 3 etiketter med tilsætning af 115, 230 og 345 Da til massen af ​​umærkede Mb. MBS bestrålet på samme måde med 20x pLeu viste mindre pLeu optagelse på den intakte niveau, med op til 2 mærkede befolkninger detekteret af LC-MS.

Figur 6
Figur 6: SSPL-MS for intakte Mb: (A) Deconvoluted massespektre for MBT (optrukket linje) og MBS (stiplet linie) mærket med 20x overskud (5% w / w) pLeu. Deconvoluted massespektret af native Mb (Mb lyofiliseret og bestrålet i fravær af pLeu) er vist som den stiplede linje. U (B) SSPL-MS kinetik for intakt Mb i formuleringer MBT (lukkede cirkler) og MBS (åbne cirkler) som en funktion af pLeu koncentration. Alle prøver blev bestrålet i 40 minutter. Fejlbjælker er i symbolerne. (C) SSPL-MS kinetik for intakt Mb i formuleringer MBT (lukkede cirkler) og MBS (åbne cirkler) lyofiliseret og bestrålet i nærværelse af 100x overskud pLeu (20,7% vægt / vægt) som en funktion af bestrålingstid. Fejlbjælker er i symbolerne.

I kinetiske undersøgelser, procenten af mærket protein steg eksponentielt for både MBT og MBS med stigende bestrålingstid (figur 6B). MBS viste mindre pLeu optagelse end MBT på hver bestrålingstid. Begge formuleringer viste sig at nå et plateau ved 40 min. Således kan en kinetisk undersøgelse være os eful at bestemme varigheden af ​​bestråling er nødvendig for at opnå fuldstændig pLeu aktivering. Mærkning kinetik blev også undersøgt som en funktion af pLeu fusion (figur 6C). Procenten af ​​mærket protein steg med pLeu koncentration for både MBT og MBS. Men på 20,7% w / w pLeu, MBT viste et fald i pLeu optagelse. Dette kan være på grund af udelukkelsen af ​​pLeu fra overfladen af ​​proteinet ved høj pLeu koncentration. Derfor bør en undersøgelse med varierende koncentration af pLeu udføres for at vælge den relevante pLeu koncentration, der giver mulighed for tilstrækkelig mærkning på tværs af protein overflade uden overflade udstødelse. I denne undersøgelse blev 20x overskud pLeu udvalgt til yderligere undersøgelser peptid-niveau.

Den samlede faldt mærkning observeret for MBS tyder dårlig sidekæde tilgængelighed til matrix, der indeholder pLeu. Dette er konsistent med en konformationsændring i nærværelse af sorbitol, der resulterer i reduceret mærkning.

indhold "> Fotolytisk mærkning på peptidet niveau

Baseret på det intakte protein mærkning studier blev 20x overskydende pLeu valgt at sammenligne MBT og MBS på peptidet niveau. Mærkede prøver blev spaltet med trypsin og analyseret ved LC-MS. I alt 40 peptider svarende til 100% af Mb sekvens blev påvist for MBT og MBS prøver. I nogle tilfælde kan tryptisk fordøjelse giver begrænset proteinsekvens dækning, hvis Lys og / eller Arg-rester er stærkt mærket. For at forbedre sekvens dækning, kan en blanding af trypsin og chymotrypsin anvendes til at fordøje det mærkede protein.

Figur 7
Figur 7: SSPL-MS for Mb på peptid niveau: tegneserie repræsentation af Mb mærket med 20x overskud pLeu (5% w / w) i nærvær af trehalose (A) og sorbitol (B). Det mærkede protein blev fordøjet med trypsin og mærkede peptider blev kortlagt på krystalstrukturen af ​​Mb (PDB ID 1WLA). De mærkede og umærkede regioner er farvet magenta og grøn hhv.

SSPL-MS med trypsin fordøjelse giver kvalitative oplysninger om peptiderne at blive stemplet. I betragtning af de forskellige mærkede populationer på intakt plan promiskuøs mekanisme pLeu mærkning og forskelle i ionisering effektivitet af mærkede og umærkede peptider, er det vanskeligt at opnå kvantitative målinger for SSPL-MS efter fordøjelse. Imidlertid kan kvalitativ information stadig give indsigt i protein konformationelle ændringer på peptidet plan. I denne undersøgelse både MBT og MBS formuleringer viste pLeu optagelse over det meste af proteinet overflade. Sammenlignet med MBs, peptidfragmenter 32-42, 134-139 og 146-153 fra MBT viste pLeu mærkning (figur 7). Dette antyder, at sidekæderne af disse aminosyrer er udsat for pLeu som helixerne i disse regions er intakte i MBT matrix. I modsætning hertil beskyttelse mod pLeu mærkning MBS matrix er i overensstemmelse med strukturelle perturbationer i disse regioner.

Samlet set resultaterne fra ssHDX-MS og SSPL-MS tyder på, at de metoder, kan give supplerende oplysninger i høj opløsning peptid-niveau om rygraden (ssHDX-MS) og side-kæde (SSPL-MS) eksponering og hjælpestoffer effekter i frysetørrede formuleringer protein .

Discussion

Flere undersøgelser har antydet, at det lokale miljø i frysetørrede prøver påvirker proteinnedbrydning 5,29,30. Men om et direkte forhold mellem proteinstruktur og stabilitet i fast tilstand har ikke været muligt på grund af mangel på høj opløsning analysemetoder. Anvendelsen af ​​de eksisterende høje metoder opløsning såsom HDX og PL til frysetørrede pulvere kræver en ændring af opløsning protokoller og omhyggelig data fortolkning. HDX-MS og PL-MS er blevet successivt vedtaget at overvåge protein konformationer i solid-state. Resultaterne præsenteret her og andre steder 27,28,31-33 har demonstreret evnen af disse metoder til at overvåge protein konformation med høj opløsning i fast miljø. Selvom de kritiske trin i dataanalyse ikke varierer fra mærkning i opløsning 34-36, er vigtige overvejelser i løbet forsøgsopstilling og data fortolkning nødvendig for solid-state kemical mærkning.

Udvælgelse af mærkningsreagenset skal være baseret på størrelse og mekanisme for mærkning. Den lille størrelse af deuterium tillader peptidskelettet at probes let, mens den relativt større størrelse af pLeu begrænser mærkning sidekæderne. Både ssHDX og SSPL viser ingen præference for en aminosyre, således at mærkningen kun afhænger rygrad og sidekæde-eksponering til matrixen. For effektivt at undersøge protein konformationer i solid-state, skal de eksterne faktorer, der påvirker mærkningsprocessen styres omhyggeligt. Det samlede beløb og den rumlige fordeling af mærkning middel i lyofiliserede faststoffer er forskellig fra vandige opløsninger.

I ssHDX, kan mængden af D2O i den faste matrix påvirke hastigheden af protein udfoldning (eller delvis udfoldning), genfoldning og deuterium udveksling. Dette er ikke tilfældet med opløsning HDX, hvor proteinet prøven normalt fortyndes med en rigelig mængde af D 2 O.Omhyggelig screening af virkningerne af hydrering på ssHDX sats kan informere udvælgelsen af ​​ideelle RH. For at styre hastigheden af fugtsorption og undgå kollaps af pulveret i formuleringer, der indeholder hygroskopiske hjælpestoffer (f.eks saccharose og trehalose), kan ssHDX udføres under nedkølede forhold (2-8 ° C). Vores tidligere undersøgelse om hydrering effekter viste øget hastigheden og omfanget af udvekslingen med øget fugtindhold, som forventet. I store dele af vores arbejde, en mellemliggende RH på 43% ved 5 ° C har vist sig at være ideel til at skelne mellem formuleringer i en rimelig frist 24. Reaktionen udføres sædvanligvis indtil et plateau er nået. Dette sikrer, at fugtsorption og diffusion i det faste stof ikke kontrollerer HDX sats. Brugen af små faste stikprøvestørrelser med præ-frysetørring volumen på ≤2 ml også med til at sikre, at D2O damp sorption er væsentlige fuldstændig tidligt i udvekslingen periode. Selvom ssHDX-MS giverkvantitative oplysninger om konformation af protein i solid-state, er der visse forhold, hvor fortolkning af data kan ikke udelukkende baseret på ssHDX undersøgelsen alene. Det er muligt, at den mindskede deuterium optagelse observeret i en prøve (sammenlignet med kontrol) kan skyldes den større tilbageholdelse af proteinstruktur eller betydelig mængde af proteinaggregater til stede i prøven. I så fald fortolkning af ssHDX data kræver resultater fra andre supplerende metoder. Topforbredning i deutereret massespektre blev observeret for flere Mb formuleringer 27,28. Dette kan skyldes forskellige faktorer, som tilstedeværelsen af delvist udfoldet protein befolkning, rumlig uensartethed i prøven, eller de rumlige gradienter i D2O koncentration. Imidlertid blev disse faktorer ikke skelnes i ssHDX-MS og kræver yderligere undersøgelse.

Som SSPL-MS er relativt nyt i forhold til andre metoder, løbende læring absine applikationer og begrænsninger er påkrævet. I SSPL er foto-cross-linker frysetørret med proteinet. Den mangel på fugt begrænser mobiliteten af ​​komponenter inden den faste matrix, og den delvise strukturelle afslapning, der kan forekomme med fugtsorption i ssHDX er ikke et fænomen i SSPL. Dette begrænser mærkning SSPL til umiddelbar nærhed af foto-cross-linker. Men i modsætning HDX-MS, MS / MS-analyse af det kovalent mærkede protein kan give rester niveau strukturel information. Da SSPL mærkning er kovalent og irreversibel, ryg udveksling ikke forekommer, og prøver kan fremstilles og analyseres uden bekymring for tab af etiket. For at lette diffusion af mærkning middel og forbedre mærkningen effektivitet i fast matrix, kan SSPL udføres med stigende% RH. pLeu optagelse kan også forbedres ved at øge koncentrationen af ​​fotoreaktive middel. Det molære forhold af protein til pLeu kan varieres som ønsket. I almindelighed er en 100x molært overskud af pLeu til proTEIN vil sikre tilstrækkelig mærkning. Imidlertid kan høje pLeu koncentration resultere i tab af protein tertiær struktur i den faste matrix. Derfor Udover mærkning kinetik og formulering sammensætning, udvælgelse af pLeu koncentration skal også være baseret på at bevare protein strukturelle integritet. Som pLeu ikke-selektivt etiketter XH (hvor X = C, N, O) gruppe, er det muligt, at hjælpestoffer med lignende mærkning sites kan i høj grad påvirke niveauet af protein mærkning. Indgrebet over hjælpestoffer i tilgængeligheden af ​​pLeu for protein mærkning er endnu ikke karakteriseret. Det er kendt, at carben genereret fra diazirine aktivering ikke er rest-specifikke, men en undersøgelse rapporterer bias mod Asp og Glu 36. Selv om det er godt at lære ca. rest-specifikke interaktioner, peptid-niveau information er også nyttige og kan anvendes til at designe excipienser til at blokere områder med høj matrix eksponering i fast tilstand. SSPL-MS indeholder detaljerede kvalitative oplysninger, menkvantitative data skal indhentes og robuste målinger skal udvikles til at analysere formulering forskelle på tværs af en bred vifte af frysetørrede systemer.

Anvendelsen af ​​en rest-specifik etiket kombineret med MS / MS-analyse kan yderligere øge beslutning til aminosyre plan. Mærkningsreagenser såsom 2,3-butandion at mærke Arg, kan N-hydroxysuccinimid derivater for Lys og N -alkylmaleimide derivater for Cys bruges til præcist at kortlægge molekylære interaktioner i lyofiliseret pulver. Men disse reagenser er pH-afhængig, og reaktionerne kan ikke være så velkontrolleret som fotolytisk mærkning i solid-state. En alternativ fremgangsmåde er at inkorporere foto-tværbinder i proteinsekvensen med brugen af ​​auxotrofe cellelinjer, steddirigeret mutagenese eller sidekæde derivatisering.

Vores tidligere ssHDX-MS og SSPL-MS undersøgelser har vist, at mærkning af protein afhænger af arten og mængden af ​​hjælpestofferbrugt 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS af Mb co-frysetørret med guanidinhydrochlorid (Gdn.HCl) viste større deuterium optagelse end Mb co-frysetørret med lav molekylær vægt sukkerarter 32. I en separat SSPL-MS undersøgelse Mb co-frysetørret med Gdn.HCl viste større beskyttelse fra fotolytisk mærkning end Mb med saccharose 33. Endvidere er kvantitative målinger fra ssHDX-MS er højt korreleret med stabiliteten af protein under langvarig lagring 28. Disse undersøgelser tyder på, at ssHDX eller SSPL protein afspejler omfanget af strukturelle tilbageholdelse af proteinet i lyofiliseret pulver. Vi mener, at tilbageholdelsen af ​​sekundær struktur i frysetørrede pulvere giver gunstigt miljø for sidekæde mærkning med pLeu og beskyttelse af amid brint fra deuterium udveksling. Brug detaljeret sammenligning af de informative indhold fra disse metoder dog skal udføres i fremtiden. Selv om oprettelse af anvendeligheden af ​​ssHDX-MS og SSPL-MSsom en formulering screeningsværktøj i sidste ende vil kræve, at den anvendes på mange proteiner, resultater fra vores seneste undersøgelser understøtter den bredere anvendelse. Med yderligere udvikling, er disse metoder forventes at være almindeligt anvendelige til karakterisering solid-state proteinformuleringer i den biofarmaceutiske industri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equine myoglobin Sigma-Aldrich M0630-5G
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma Aldrich #T9531
D-Sorbitol Sigma Aldrich #240850
L-Photo-leucine Thermo Scientific #22610
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich #P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich #P3786
Deuterium Oxide Cambridge Isotope Laboratories #DLM-4-PK Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilized pepsin Applied Biosystems #2-3132-00
Trypsin Promega #V511A Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used
Water, Optima LC/MS grade Fisher Chemical #7732-18-5
Acetonitrile Sigma-Aldrich #34998
Formic acid Thermo Scientific #28905
ESI-TOF Calibrant Agilent Technologies #G1969-85000 Highly flammable liquid
Protein microtrap Michrom Bioresources TR1/25108/03
Peptide microtrap Michrom Bioresources TR1/25109/02
Analytical column Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18
Freeze dryer VirTis AdVantage Plus
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps Stratagene Corp. Stratalinker 2400
HPLC Agilent Technologies 1200 series LC Refrigerated LC system for HDX-MS
ESI-qTOF MS Agilent Technologies 6520 qTOF
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) Sierra Analytics http://www.massspec.com/HDExaminer.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawrence, S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nat. Biotechnol. 25, (4), 380-382 (2007).
  2. Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. BCC Research. BIO021D (2013).
  3. Lai, M. C., Topp, E. M. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. J. Pharm. Sci. 88, (5), 489-500 (1999).
  4. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharm. Res. 14, (8), 969-975 (1997).
  5. Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).
  6. Wüthrich, K. Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 265, (36), 22059-22062 (1990).
  7. Ilari, A., Savino, C. Protein structure determination by x-ray crystallography. Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).
  8. Brunger, A. T. X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics. Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).
  9. Yu, L. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Adv Drug. Deliv. Rev. 48, (1), 27-42 (2001).
  10. Manning, M. C. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability. Expert. Rev. Proteomics. 2, (5), 731-743 (2005).
  11. Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies. J. Pharm. Sci. 100, (7), 2871-2875 (2011).
  12. Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy. J. Pharm. Sci. 94, (9), 2030-2038 (2005).
  13. Pikal, M. J., et al. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J. Pharm. Sci. 97, (12), 5106-5121 (2008).
  14. Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility. J. Pharm. Sci. 98, (9), 3145-3166 (2009).
  15. Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 65, (1), 1-9 (2007).
  16. Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein. Sci. 11, (6), 1300-1308 (2002).
  17. Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23, (5), 639-647 (2009).
  18. Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery. Chem. Soc. Rev. 41, (11), 4335-4355 (2012).
  19. Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteomics. 9, (8), 1716-1728 (2010).
  20. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100, (6), 2071-2086 (2011).
  21. Dorman, G., Prestwich, G. D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends. Biotechnol. 18, (2), 64-77 (2000).
  22. Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 3, (4), 399-408 (2006).
  23. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A, (1), 8 (1977).
  24. Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping. Mol. Pharm. 9, (4), 718-726 (2012).
  25. Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22, (8), 1472-1476 (2011).
  26. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic. Acids. Res. 31, (13), 3784-3788 (2003).
  27. Sophocleous, A. M., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics. Mol. Pharm. 9, (4), 727-733 (2012).
  28. Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS). Mol. Pharm. 11, (6), 1869-1879 (2014).
  29. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, (1-2), 1-60 (2000).
  30. Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying. J. Pharm. Sci. 88, (12), 1354-1361 (1999).
  31. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Anal. Biochem. 366, (1), 18-28 (2007).
  32. Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys. J. 95, (12), 5951-5961 (2008).
  33. Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders. Mol. Pharm. 10, (12), 4629-4639 (2013).
  34. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).
  35. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach. Anal. Chem. 81, (19), 7892-7899 (2009).
  36. Jumper, C. C., Schriemer, D. C. Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis. Anal. Chem. 83, (8), 2913-2920 (2011).
  37. Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Pharm. Res. 25, (2), 259-267 (2008).
  38. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids. Biotechnol. Bioeng. 97, (6), 1650-1653 (2007).
Massespektrometrisk Approaches at studere proteiners struktur og interaktioner i lyofiliserede pulvere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).More

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter