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Chemistry

बड़े पैमाने पर spectrometric Lyophilized पाउडर में प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रयास

doi: 10.3791/52503 Published: April 14, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण द्वारा पीछा एमाइड / ड्यूटेरियम एक्सचेंज (ssHDX एमएस) और पक्ष-श्रृंखला photolytic लेबलिंग (SSPL एमएस) प्रोटीन चिकित्सा विज्ञान की lyophilized योगों निस्र्पक के लिए मूल्यवान हो सकता है। उपयुक्त प्रोटियोलिटिक पाचन द्वारा पीछा लेबल प्रोटीन संरचना और बातचीत पेप्टाइड स्तर के संकल्प के साथ मैप किया जा करने के लिए अनुमति देता है। प्रोटीन के बाद संरचनात्मक तत्वों मुख्य-चेन और अमीनो एसिड, अमीनो एसिड के अवशेष में परमाणुओं के विशिष्ट लेबलिंग प्रोटीन की संरचना और रचना में अंतर्दृष्टि प्रदान के पक्ष जंजीरों से रासायनिक बांड के एक नेटवर्क के द्वारा स्थिर रहे हैं। Lyophilized ठोस (जैसे, एफटीआईआर), ssHDX-एमएस और SSPL एमएस मात्रात्मक और साइट विशेष जानकारी उपलब्ध कराने में प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया दिनचर्या विधियों के विपरीत। ड्यूटेरियम समावेश और गतिज मापदंडों की हद तक तेजी से और धीरे धीरे एमाइड पूल का आदान प्रदान करने के लिए संबंधित हो सकता है (एन तेजी, एन धीमी गति) और सीधे डिग्री को दर्शाता हैlyophilized योगों में प्रोटीन तह और संरचना के REE। स्थिर photolytic लेबलिंग बैक-विनिमय, ssHDX एमएस पर एक फायदा नहीं गुजरना पड़ता। यहाँ, हम Trehalose या सोर्बिटोल या तो युक्त lyophilized योगों में एक मॉडल के प्रोटीन के रूप में मायोग्लोबिन (एमबी) का उपयोग कर, ssHDX-एमएस और SSPL एमएस दोनों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Introduction

प्रोटीन दवाओं बायोफर्मासिटिकल उद्योग के सबसे तेजी से बढ़ते क्षेत्र के हैं और हार्मोन संबंधी विकार, कैंसर और स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों एक सहित पहले से असभ्य रोगों, के लिए होनहार नए उपचार प्रदान करते हैं। 2012 में, वैश्विक biotherapeutics बाजार 138,000,000,000 $ पहुंच गया और वर्ष से $ 179,000,000,000 तक पहुंचने की उम्मीद है 2018 दो। प्रोटीन बड़ा और पारंपरिक छोटे अणु दवाओं से ज्यादा कमजोर हैं और इसलिए गिरावट तीन के कई प्रकार के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। (यानी, फ्रीज सूखे) ठोस पाउडर lyophilized के रूप में पर्याप्त शैल्फ जीवन और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटीन दवाओं अक्सर तैयार कर रहे हैं। हालांकि, एक प्रोटीन अभी भी अपने मूल संरचना lyophilization प्रक्रिया 4,5 के दौरान संरक्षित नहीं है, खासकर अगर ठोस राज्य में गिरावट से गुजरना कर सकते हैं। कि संरचना बनाए रखा गया है आश्वस्त sufficien के साथ ठोस राज्य में प्रोटीन रचना जांच कर सकते हैं कि विश्लेषणात्मक तरीके हैं केवल यदि संभव हैटी संकल्प।

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी 6 और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 7 समाधान और क्रिस्टलीय ठोस 8 में प्रोटीन संरचना का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल उच्च संकल्प तरीके हैं। क्योंकि excipients और इस्तेमाल प्रसंस्करण विधियों की प्रकृति के कारण, lyophilized प्रोटीन योगों आमतौर पर अनाकार के बजाय 9 क्रिस्टलीय हैं। एकरूपता और सूक्ष्म आदेश की कमी अनाकार ठोस पदार्थों में प्रोटीन के लिए ऊपर वर्णित तकनीकों अव्यावहारिक बना देता है। फूरियर अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (FTIR) 10 बदलना, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी 11 और निकट अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (NIR से) 12 नियमित रूप से देशी समाधान राज्य संरचना की है कि lyophilized पाउडर में प्रोटीन माध्यमिक संरचना की तुलना करने के बायोफर्मासिटिकल उद्योग द्वारा इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों कम संकल्प कर रहे हैं और केवल माध्यमिक संरचना में वैश्विक परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। एफटीआईआर का उपयोग कर ठोस राज्य संरचनात्मक लक्षण वर्णनलंबी अवधि के भंडारण स्थिरता के साथ कमजोर 13,14 या गरीब 15 सहसंबंध या तो दिखाया गया है। इन सीमाओं उपयुक्त उच्च संकल्प के तरीकों ठोस राज्य में प्रोटीन संरचनात्मक perturbations की पहचान करने के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला।

प्रोटियोलिसिस और जन Spectrometric विश्लेषण के साथ युग्मित रासायनिक लेबलिंग जलीय घोल में प्रोटीन की संरचना और आणविक बातचीत की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभरा है। दवा के विकास में, इस HDX एमएस प्रोटीन दवाओं 19 की रचना पर बाद translational संशोधनों के प्रभाव पर नजर रखने के लिए, रिसेप्टर दवा बातचीत 18 मैप करने के लिए, और तुलना के लिए, प्रतिजन एंटीबॉडी बातचीत 16,17 में मिलान मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है biosimilars 20 के विकास में बैच करने वाली बैच विभिन्नता। इसी तरह, photoactivatable ligands के दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए और बंधन आत्मीयता और नशीली दवाओं के रिसेप्टर बातचीत 21,22 की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ई करने के लिएXtend lyophilized योगों के लिए इन तरीकों के आवेदन, हमारे समूह विकसित की है राज्य के ठोस हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ssHDX एमएस) और ठोस राज्य photolytic लेबलिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (SSPL एमएस) lyophilized नमूनों में प्रोटीन रचना और excipient बातचीत का अध्ययन करने के लिए उच्च संकल्प के साथ।

SsHDX-एमएस और SSPL एमएस दोनों में, प्रोटीन lyophilized ठोस में आदर्श प्रतिक्रिया की शर्तों के तहत लेबल है, और नमूने तो पुनर्गठन और के साथ या प्रोटियोलिटिक पाचन बिना मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। SSPL एमएस पक्ष श्रृंखला के वातावरण के बारे में जानकारी (चित्रा 1) प्रदान करता है, जबकि ssHDX एमएस, ड्यूटेरियम वाष्प को मुख्य श्रृंखला के लिए जोखिम के बारे में जानकारी प्रदान करता है। दो तरीकों इस प्रकार ठोस राज्य में प्रोटीन रचना के बारे में पूरक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। यहाँ, हम के रूप में एमबी, (चित्रा 2) ssHDX-एमएस और SSPL एमएस का उपयोग कर lyophilized ठोस पदार्थों में प्रोटीन का अध्ययन कर प्रयोग करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंएक मॉडल प्रोटीन। हम दो अलग अलग excipients साथ योगों में मतभेद भेद करने के लिए दो तरीकों की क्षमता दिखाते हैं।

चित्र 1
चित्रा 1:। विभिन्न लेबलिंग तंत्र के माध्यम से lyophilized ठोस में ssHDX और SSPL उपाय प्रोटीन संरचना (ए) HDX में, रीढ़ की हड्डी एमाइड एक प्रोटीन संरचना के समारोह और डी 2 हे पहुँच के रूप में ड्यूटेरियम के साथ विनिमय hydrogens। ठोस राज्य में, दर और ड्यूटेरियम विनिमय की हद डी 2 हे sorption, प्रोटीन गतिशीलता (खुलासा और घटनाओं refolding) और ठोस मैट्रिक्स में मौजूद excipients की प्रकृति के स्तर पर निर्भर करते हैं। PLeu की diazirine कार्यात्मक समूह से मध्यवर्ती एक प्रतिक्रियाशील carbene के गठन शुरू करता है और किसी भी xh के बंधन (एक्स किसी भी परमाणु =), या विज्ञापन में गैर-विशेष रूप से डाला जाता है एनएम pl में (बी), 365 पर यूवी विकिरणइसके तत्काल आसपास के क्षेत्र में एक सी = सी बांड भर ded। ठोस राज्य में, दर और लेबलिंग की हद तक स्थानीय लेबलिंग एजेंट की एकाग्रता, विकिरण समय, प्रोटीन संरचना और ठोस मैट्रिक्स में मौजूद excipients की प्रकृति पर निर्भर करते हैं। पैनलों ए और बी प्रोटीन में क्रमश: रीढ़ की हड्डी और पक्ष-चेन पर हो सकता है कि अधिक से अधिक सैद्धांतिक लेबलिंग दिखा।

चित्र 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध दिखा ठोस राज्य इस HDX एमएस (ए) और lyophilized तैयार करने में प्रोटीन के लिए पी एल-एम एस (बी)।

Protocol

1. नमूना तैयार करने और lyophilization

  1. 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से एक उपयुक्त बफर और फिल्टर के खिलाफ एमबी शेयर समाधान के लिए आवश्यक मात्रा dialyze।
  2. (; PLeu एल-2-अमीनो-4,4-एशिया-pentanoic एसिड) उपयुक्त बफर में शेयर समाधान excipients और फोटो leucine की अपेक्षित मात्रा तैयार करें। 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से शेयर समाधान फ़िल्टर।
  3. प्रोटीन, excipients, pLeu, और बफर का जायजा समाधान का उपयोग कर तालिका 1 में दिखाया गया है योगों तैयार करें।
  4. 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से फिल्टर नमूने कदम 1.3 पर गठित किसी भी कणों को दूर करने के लिए। 2 मिलीलीटर कांच की शीशियों में 0.2 मिलीलीटर के रूप में अलग से नमूने भरें। SSPL एमएस पढ़ाई में pLeu को सक्रिय करने के क्रम में यूवी (365 एनएम) प्रकाश के लिए पारदर्शी हैं कि कांच की शीशियों का प्रयोग करें।
  5. एक lyophilizer में लोड शीशियों और एक उचित lyophilization चक्र डिजाइन द्वारा lyophilization आरंभ करें।
    1. यहाँ, -40 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज पीछा12 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटा और माध्यमिक सुखाने के लिए -35 डिग्री सेल्सियस पर निर्वात (70 mTorr) के तहत प्राथमिक सुखाने के द्वारा। Lyophilization चक्र और सुखाने के तरीकों अन्य (जैसे, स्प्रे सुखाने) का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. कैपिंग पहले नाइट्रोजन के साथ lyophilized नमूने युक्त शीशियों backfill।
योगों रचना (मिलीग्राम / एमएल) lyophilization करने से पहले
एमबी Trehalose Sorbitol pLeu पोटेशियम, फास्फेट, 7.4 पीएच
एमबीटी एक 1.7 3.4 - - 0.4
एमबीएस एक 1.7 - 3.4 - 0.4
एमबीटी + pLeu बी 1.7 3.4 - 14.3 एक्स 10 -3 के लिए 1.43 0.4
एमबीएस + pLeu बी 1.7 - 3.4 14.3 एक्स 10 -3 के लिए 1.43 0.4

तालिका 1:।।। Lyophilized एमबी योगों की संरचना ssHDX एमएस अध्ययन के लिए इस्तेमाल एक योगों SSPL एमएस अध्ययन के लिए इस्तेमाल बी योगों सी एल-2-अमीनो-4,4-azipentanoic एसिड या फोटो-leucine (pLeu)। pLeu 1x करने के लिए इसी पाँच अलग अलग सांद्रता (14.3 x 10 -3 1.43 मिलीग्राम / एमएल) में, एमबी करने के लिए 10x, 20x, 50x और 100x दाढ़ अतिरिक्त रिश्तेदार एमबीटी और एमबीएस योगों के साथ सह-lyophilized थे।

बरकरार प्रोटीन के लिए 2. ssHDX एमएस

  1. कश्मीर 2 सीओ डी 2 हे previousl की 3-200 मिलीलीटर की एक saturating राशि (~ 440 ग्राम) जोड़ेंY एक desiccator के निचले डिब्बे में रख दिया गया। हवा तंग desiccator सील और यह 43% तक पहुँच जाता है ~ के एक स्थिर सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) तक 5 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने की अनुमति देते हैं। ब्याज के अन्य आरएच मूल्यों अलग संतृप्त नमक समाधान 23,24 का चयन करके प्राप्त किया जा सकता है।
  2. Desiccator के ऊपरी डिब्बे में lyophilized प्रोटीन युक्त uncapped शीशियों रखकर ssHDX प्रतिक्रियाओं आरंभ। Desiccator हवा तंग सील और HDX (2A चित्रा) उत्पन्न करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. तीन प्रतियों में विभिन्न समय पर ssHDX नमूने एकत्र। एमबी योगों के लिए, नौ समय अंक 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 और 144 घंटे पर नमूने एकत्र।
  4. तुरंत desiccator से वापस लेने के बाद शीशियों कैप और तरल नाइट्रोजन में शीशियों ठंड फ्लैश द्वारा प्रतिक्रियाओं बुझा लेते हैं। बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शीशियों।
  5. एक उपयुक्त उच्च संकल्प तरल क्रोमैटोग्राफी जन spectrom का उपयोग करते हुए नमूनों का विश्लेषणetry (नियंत्रण रेखा एमएस) विधि। डिजाइन या नमूना विश्लेषण के दौरान पीठ के आदान-प्रदान को कम से कम करने के लिए एक उपयुक्त प्रशीतित नियंत्रण रेखा प्रणाली की खरीद। स्तंभ प्रशीतन इकाई की स्थापना का उपयोग करें और नियंत्रण रेखा एमएस विधि पहले से 25 की सूचना दी।
    नोट: एमाइड प्रोटॉन विनिमय की दर पीएच और तापमान पर निर्भर करता है, प्रोटीन में शामिल deuterons, मोबाइल चरण में हाइड्रोजन वर्तमान ("वापस एक्सचेंज") के साथ विनिमय जानकारी का एक नुकसान हो सकता है। बुझाना बफर और HPLC सॉल्वैंट्स का एक अम्लीय पीएच (पीएच 2.5) के तापमान को कम करने, एक बड़ी हद तक वापस मुद्रा कम कर सकते हैं (हालांकि ≤0 डिग्री सेल्सियस) आगे पीछे-विनिमय से प्रोटीन की रक्षा कर सकते हैं एक उपयुक्त स्तंभ प्रशीतन प्रणाली के माध्यम से ।
  6. स्वचालित रूप से desalting और क्षालन प्रक्रिया को नियंत्रित करता है कि वाल्व के लिए नमूना पाश और प्रोटीन के जाल से कनेक्ट करें। 200-3,200 की मी / z श्रेणी में मास स्पेक्ट्रोमीटर में एक TOF कम एकाग्रता ट्यूनिंग मिश्रण इंजेक्शन द्वारा मास स्पेक्ट्रोमीटर जांचना। स्थिरपेप्सिन स्तंभ और विश्लेषणात्मक स्तंभ बरकरार प्रोटीन विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं।
  7. डिग्री सेल्सियस ≤0 और ~ 0 डिग्री सेल्सियस के एक स्थिर ऑपरेटिंग तापमान तक पहुँचने के लिए सिस्टम के लिए प्रतीक्षा करने के लिए प्रशीतित प्रणाली में तापमान सेट करें।
  8. जल्दी से बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में डिग्री सेल्सियस -80 से नमूने हस्तांतरण। संदंश का प्रयोग, ध्यान से तरल नाइट्रोजन से प्रत्येक शीशी को वापस लेने और शीशी करने के लिए पानी में 0.2% चींटी एसिड (एफए) (पीएच 2.5) और 5% मेथनॉल युक्त बर्फ के ठंडे बुझाना बफर की एक विशिष्ट मात्रा जोड़कर नमूना पुनर्गठित।
  9. एक उपयुक्त एचपीएलसी और नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि कार्यक्रम। एमबी योगों के लिए एक ढाल का उपयोग कर 5% acetonitrile, 95% पानी और 0.1% चींटी एसिड (एफए), और Elute के साथ 1.7 मिनट के लिए प्रोटीन के जाल में 20 pmol एमबी युक्त फीका बनाना नमूना 80% acetonitrile, 20% पानी और 0.1 की वृद्धि हुई 3.3 मिनट में% एफए। मी / z रेंज 200-3,200 से अधिक जन स्पेक्ट्रा लीजिए।
  10. अक्षत के द्रव्यमान का निर्धारण करने के लिएप्रोटीन, कदम 2.9 की विधि का उपयोग जलीय घोल में एक undeuterated प्रोटीन नमूना (नहीं ssHDX के अधीन है, यानी प्रोटीन) के लिए डेटा प्राप्त।
  11. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कच्चे स्पेक्ट्रा deconvoluting द्वारा undeuterated और deuterated नमूनों की जनता प्राप्त करते हैं। इधर, 15,000-18,000 दा, 1.0 दा को सामूहिक संकल्प, और एमबी के द्रव्यमान की गणना के लिए 90% करने के लिए चोटी की ऊंचाई के लिए बड़े पैमाने पर सीमा निर्धारित किया है।
  12. प्रत्येक मुद्रा समय बिंदु पर deuterated प्रोटीन के द्रव्यमान से undeuterated प्रोटीन की बड़े पैमाने पर घटाकर बरकरार प्रोटीन (यहाँ, एमबी) में शामिल किया deuterons की संख्या की गणना।
  13. निम्न समीकरण का उपयोग सैद्धांतिक अधिकतम प्रतिशत ड्यूटेरियम तेज रिश्तेदार की गणना (समीकरण 1)
    1 समीकरण
    विनिमेय amides = अमीनो एसिड की कुल संख्या का जहां कुल संख्या - प्रोलाइन अवशेषों की संख्या - एन के लिए 2 ("2" खातोंतेजी से बैक-विनिमय से गुजरना है कि टर्मिनल अमीनो समूह और एमाइड)।
  14. एक उपयुक्त घातीय समीकरण का उपयोग ssHDX गतिज डेटा फिट। एक biexponential समीकरण (2 समीकरण) आमतौर पर ssHDX डेटा के लिए एक उचित फिट प्रदान करता है कि सरल है। इस अध्ययन में, एमबीटी और एमबीएस के लिए, "तेजी" और "" धीमी ताल का आदान प्रदान करने के लिए deuterons प्रदान करती है जो एक biexponential मॉडल के लिए डेटा फिट बैठते हैं।
    2 समीकरण
    जहां एन तेजी से और एन धीमी गति में विनिमेय amides की संख्या रहे हैं "तेजी" और क्रमशः, पूल का आदान प्रदान "" धीमी है, और तेजी से कश्मीर और धीमी गति से कश्मीर दो पूल के साथ जुड़े पहले के आदेश दर स्थिरांक हैं।

पेप्टाइड स्तर पर प्रोटीन के लिए 3. ssHDX एमएस

  1. कदम 2.6 में निम्नलिखित संशोधनों के साथ, कदम 2.1-2.8 पालन करके ssHDX प्रदर्शन करते हैं। स्थिर पेप्सिन कर्नल कनेक्टवाल्व को umn और विश्लेषणात्मक स्तंभ में पहले से 25 की सूचना दी और एक पेप्टाइड जाल के साथ वाल्व से जुड़ा प्रोटीन जाल की जगह के रूप में। 100 से 1700 से लेकर अनुपात चार्ज करने के लिए बड़े पैमाने पर की स्थापना द्वारा मास स्पेक्ट्रोमीटर जांचना।
    नोट: पुनर्गठन कदम (2.8 कदम) के दौरान, एक एजेंट को कम करने और denaturing एजेंट डाइसल्फ़ाइड बांड (जैसे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) के साथ प्रोटीन की पेप्सिन पाचन की सुविधा के लिए बुझाना बफर में शामिल किया जा सकता है।
  2. एक उपयुक्त एचपीएलसी और नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि कार्यक्रम। एमबी योगों के लिए, एक पेप्टाइड जाल में 1.7 10% acetonitrile के साथ मिनट, 90% पानी और 0.1% एफए के लिए 0.1% एफए, जाल और फीका बनाना पेप्टाइड्स के साथ ऑनलाइन 20 pmol एमबी युक्त नमूनों को पचाने। 4.0 मिनट में एक 60% acetonitrile को ढाल वृद्धि हुई है, 40% पानी और 0.1% एफए के साथ विश्लेषणात्मक स्तंभ पर टुकड़े elute। मी / z रेंज 100-1,700 से अधिक जन स्पेक्ट्रा मोल।
  3. एक के एमएस / एमएस विश्लेषण से पेप्टिक टुकड़े को पहचानेंundeuterated प्रोटीन नमूना। एक कस्टम डेटाबेस में पेप्टाइड टुकड़े की भविष्यवाणी की आम जनता के लिए पेप्टाइड टुकड़ा आयनों की प्रयोगात्मक जनता तुलना करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। कम त्रुटि के साथ जनता की पहचान करने के लिए एक बड़े पैमाने पर कट ऑफ प्वाइंट (जैसे 10 पीपीएम) निर्धारित करें। पेप्टाइड्स मिलान कर लिए, (मैं) पेप्टाइड अनुक्रम (ii) राज्य के प्रभारी, और (iii) प्रतिधारण समय के शामिल एक सूची तैयार करते हैं।
  4. टुकड़ा पचाने प्रत्येक पेप्सिन के लिए शामिल deuterons की औसत संख्या नक्शा और निर्धारित करने के लिए कदम 3.3 में उत्पन्न सूची का उपयोग करें। यह उपयुक्त HDX एमएस डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर 24 को रोजगार से प्राप्त किया जा सकता है।
  5. प्रतिशत ड्यूटेरियम तेज गणना करने के लिए और पेप्टिक टुकड़े से प्रत्येक के लिए ssHDX गतिज डेटा फिट करने के लिए, कदम 2.13 और 2.14 का पालन करें। एमबीटी और एमबीएस योगों एक biexponential एसोसिएशन मॉडल (2 समीकरण) के लिए फिट थे से इस अध्ययन में, छह गैर बेमानी पेप्सिन से प्रत्येक के लिए HDX गतिज डेटा टुकड़े को पचाने।

बरकरार प्रो के लिए 4. SSPL एमएसTein

  1. यूवी crosslinker पर photolytic लेबलिंग प्रतिक्रिया, पहले स्विच शुरू और दीपक 5 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए। यूवी स्रोत pLeu की diazirine समूह सक्रिय करने के लिए तरंग दैर्ध्य 365 एनएम का दीपक के साथ सुसज्जित है सुनिश्चित करें।
    चेतावनी: दीपक पर कर रहे हैं जब यूवी crosslinker का दरवाजा खुला है कभी नहीं। स्रोत एक यूवी सुरक्षात्मक कांच के दरवाजे से संलग्न नहीं है, तो पराबैंगनी प्रकाश में निवेश से आंखों और त्वचा को सुरक्षित रखें।
  2. दरवाजा खोलने से पहले यूवी crosslinker बंद कर दें। दीपक बंद कर दिया है एक बार, lyophilized सूत्रीकरण युक्त शीशियों खुलना और चित्रा 2B में दिखाया गया है यूवी crosslinker कक्ष के अंदर उन्हें जगह है। 40 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ नमूने चमकाना।
  3. PLeu और (ii) pLeu साथ lyophilized नमूनों में पुनर्गठित पानी के बिना lyophilized (i) के नमूने के लिए 4.3 कदम 4.1 का पालन करते हुए नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन।
  4. कैप बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों की दुकान और।
  5. Reconstit2 माइक्रोन के लिए एकाग्रता लाने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड आसुत जल का एक उपयुक्त मात्रा जोड़कर ठोस नमूने ute।
  6. नमूना विश्लेषण शुरू करने के लिए, कदम 2.6 और 2.9 का पालन करें।
    नोट: बैक-विनिमय सहसंयोजक लेबलिंग के साथ एक मुद्दा नहीं है, इसलिए SSPL एमएस एक विशेष प्रशीतित नियंत्रण रेखा प्रणाली की आवश्यकता नहीं है।
  7. प्रोटीन के देशी जन निर्धारित करने के लिए, कदम 2.9 पालन करके SSPL के अधीन नहीं किया गया है कि एक प्रोटीन नमूना के लिए डेटा प्राप्त। कदम 2.11 बारे में विस्तार में कच्चे स्पेक्ट्रा deconvoluting द्वारा लेबल हटाया गया और लेबल के नमूनों की जनता प्राप्त करते हैं।
  8. निम्न सूत्र का उपयोग शामिल किया pLeu की संख्या की गणना:
    3 समीकरण
    एम एल लेबल प्रोटीन की बड़े पैमाने पर है जहां, एम एन देशी प्रोटीन की बड़े पैमाने पर है और 115 (डीए) एकल pLeu समावेश निम्नलिखित देशी प्रोटीन में जोड़ा औसत द्रव्यमान है। लेबलिंग प्रतिक्रिया वें के साथ होता है कि नोटएन 2 के ई नुकसान (28 डीए)। pLeu की monoisotopic बड़े पैमाने पर 143.07 है।
  9. निकाले आयन chromatograms से शिखर ऊंचाइयों का उपयोग कर लेबल के विभिन्न संख्या के साथ प्रोटीन की आबादी के प्रतिशत की गणना।
    समीकरण 4
    "मैं" लेबल की संख्या जहां अर्थ, पीएच मैं मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मनाया के रूप में लेबल प्रोटीन एल मैं और पीएच के लिए पीक ऊंचाई यू के लेबल हटाया गया प्रोटीन की चोटी ऊंचाई अर्थ अर्थ।

पेप्टाइड स्तर पर प्रोटीन के लिए 5. SSPL एमएस

  1. चरणों 4.1-4.4 पालन करके SSPL प्रदर्शन करते हैं।
  2. पेप्टाइड स्तर विश्लेषण के लिए, अमोनियम बिकारबोनिट बफर (100 मिमी, 8.0 पीएच) में ठोस नमूने पुनर्गठित।
  3. पुनर्गठन के बाद, 10 पर trypsin के साथ लेबल प्रोटीन समाधान मिश्रण: ट्रिप्सिन के लिए प्रोटीन की एक दाढ़ अनुपात और 16 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. एफए 0.1% जोड़कर प्रतिक्रिया बुझानानमूने के लिए पानी में 2 माइक्रोन प्रोटीन को अंतिम एकाग्रता उपज के लिए।
  5. HPLC प्रणाली से जुड़ा हुआ वाल्व के लिए नमूना पाश, पेप्टाइड जाल और विश्लेषणात्मक स्तंभ कनेक्ट करें।
  6. एक उपयुक्त एचपीएलसी और नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि कार्यक्रम। एमबी योगों के लिए, ढाल के साथ विश्लेषणात्मक कॉलम में एक क्षालन द्वारा पीछा किया, 5% acetonitrile, 95% पानी और 0.1% एफए के साथ 1.5 मिनट के लिए एक पेप्टाइड जाल में पेप्टाइड्स नमूना पाश में पच प्रोटीन की 20 pmol इंजेक्षन, और फीका बनाना 22 मिनट में 55% acetonitrile, 45% पानी और 0.1% एफए के लिए वृद्धि हुई है। मी / z रेंज 100-1,700 से अधिक जन स्पेक्ट्रा लीजिए।
  7. ऐसे में पहले से बरकरार प्रोटीन विश्लेषण से गणना की pLeu की संख्या के साथ ExPASy 26 के रूप में एक ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर adducts पेप्टाइड-pLeu के लिए एक सैद्धांतिक बड़े पैमाने पर सूची तैयार करें। कम से कम 4 चोली याद किया शामिल करें। लेबलिंग प्रतिक्रिया एन 2 के नुकसान के साथ होता है कि ध्यान दें। लेबल हटाया गया कोशिश की इसलिए, पेप्टाइड-pLeu अभिवर्तन के द्रव्यमान = द्रव्यमानPTIC पेप्टाइड + N (pLeu की बड़े पैमाने पर) - एन "एन" निगमित pLeu की संख्या है, (एन 2 की बड़े पैमाने पर)।
    नोट: बरकरार प्रोटीन की बड़े पैमाने पर विश्लेषण प्रोटीन के तीन लेबल वाली आबादी को दिखाया, तो पेप्टाइड प्रति तीन संभावित pLeu लेबल अप करने पर विचार करें। 1 (28) = 1115 दा - 1000 दा की जन के साथ एक पेप्टाइड के लिए, एक pLeu समावेश के साथ पेप्टाइड-pLeu अभिवर्तन के सैद्धांतिक बड़े पैमाने पर 1000 + 1 (143) होगा। इसी तरह, पेप्टाइड-pLeu की सैद्धांतिक जनता क्रमशः, आदि के 1230 दा, 1345 दा होगा, आदि दो pLeu, 3 pLeu, साथ adducts।
  8. प्रयोगात्मक मनाया जनता के साथ कदम 5.7 में उत्पन्न सैद्धांतिक बड़े पैमाने पर सूची से मिलान करने के लिए बड़े पैमाने पर विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। कम त्रुटि के साथ जनता की पहचान करने के लिए एक बड़े पैमाने पर कट ऑफ बिंदु (उदाहरण के लिए, 50 पीपीएम) निर्धारित करें।
  9. पेप्टाइड्स मिलान कर लिए, pLeu की वास्तविक संख्या एम एल और एम एन से लेबल की जनता कर रहे हैं, जहां कदम 4.8 (3 समीकरण), के तहत सूत्र का उपयोग शामिल कर का निर्धारणक्रमशः और देशी पेप्टाइड,।

Representative Results

इधर, ssHDX-एमएस और SSPL एमएस lyophilized एमबी संरचनाओं की रचना और ठोस राज्य बातचीत पर excipients के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रोटीन और इस अध्ययन में इस्तेमाल excipients की सांद्रता तालिका 1 में दिया जाता है। इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं निम्नलिखित द्वारा प्राप्त lyophilized एमबी की ssHDX-एमएस और SSPL एमएस विश्लेषण से प्रतिनिधि परिणाम है।

बरकरार प्रोटीन के स्तर पर ड्यूटेरियम तेज

ssHDX एमएस बरकरार स्तर पर एमबी योगों के बीच अंतर करने में सक्षम है। सूत्रीकरण एमबीएस से ssHDX की 144 घंटा निम्नलिखित बरकरार एमबी की deconvoluted जन स्पेक्ट्रा सूत्रीकरण एमबीटी (चित्रा 3 ए) से अधिक ड्यूटेरियम तेज दिखाया। औसतन, एमबीएस एमबीटी (तालिका 2) की तुलना में 46% अधिक से अधिक ड्यूटेरियम तेज दिखाया।

चित्र तीन चित्रा 3: ssHDX एमएस बरकरार MB के लिए: योगों से deuterated बरकरार एमबी की (ए) Deconvoluted जन स्पेक्ट्रा एमबीटी (ठोस लाइन) और एमबीएस (धराशायी लाइन) ssHDX की 144 घंटा बाद। undeuterated बरकरार एमबी की deconvoluted जन स्पेक्ट्रम भी (बिंदीदार रेखा) में दिखाया गया है। (बी) के योगों में बरकरार MB के लिए ssHDX कैनेटीक्स एमबीटी (ठोस लाइन) और एमबीएस (धराशायी लाइन)। ssHDX के समय के पाठ्यक्रम (एसडी ±, एन = 3) ग्राफ़ पैड चश्मे सॉफ्टवेयर संस्करण 5 का उपयोग करते हुए दो चरण घातीय एसोसिएशन के लिए एक समीकरण के लिए लगाया गया था।

बरकरार एमबीएस और एमबीटी के लिए deuteration कैनेटीक्स जल्दी समय अंक (1-4 घंटा) में समान हैं, लेकिन एमबीएस समय (8-144 घंटा) (3B चित्रा) में वृद्धि के साथ ड्यूटेरियम विनिमय वृद्धि हुई दिखाया। यह कम आरएच और तापमान की स्थिति में ssHDX के लिए लंबे समय के अंक चयन के महत्व का पता चलता है। इसके अलावा, डी 2 हे sorption और प्रसार की प्रक्रिया के प्रारंभिक समय पीओ पर ssHDX की दर को प्रभावित कर सकताints। हमारे पिछले अध्ययनों ssHDX में नमी sorption घंटे की अवधि में पूरा हो गया है, और इस समय परे कैनेटीक्स का आदान-प्रदान करने के लिए कम से कम योगदान दिया है कि पता चला है। मनाया दर और विनिमय की हद तक इसलिए बस डी 2 हे adsorbtion 27,28 के उपाय नहीं कर रहे हैं। तीन स्वतंत्र ssHDX एमएस नमूनों से मानक विचलन का संकेत 3B चित्रा में छोटी सी गलती सलाखों, प्रयोग अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि दिखा।

ड्यूटेरियम तेज (%) बी एन तेजी से तेज कश्मीर एन धीमी सी धीमी सी कश्मीर
एमबीटी एक 15.9 ± 0.5 13.1 (0.8) 0.43 (0.03) 11.0 (0.9) 0।019 (0.001)
एमबीएस एक 23.2 ± 0.5 15.4 (0.7) 0.49 (0.04) 19.2 (0.6) 0.024 (0.002)
% परिवर्तन 46% 18% 14% 75% 26%

तालिका 2:। एमबी योगों के ssHDX अध्ययन में ड्यूटेरियम तेज की मात्रात्मक उपायों रचना के लिए 1 टेबल देखें एक सैद्धांतिक अधिकतम करने के लिए बी प्रतिशत ड्यूटेरियम तेज रिश्तेदार बरकरार एमबी से HDX के 144 घंटे के बाद 5 डिग्री सेल्सियस, 43% आरएच (एन = 3 पर। , ssHDX एमएस गतिज डेटा के nonlinear प्रतिगमन द्वारा निर्धारित मतलब ± एसडी)। सी पैरामीटर। बरकरार MB के लिए ड्यूटेरियम विनिमय के समय के पाठ्यक्रम एक biexponential एसोसिएशन मॉडल (Eqn। 2) करने के लिए लगाया गया था। कोष्ठक में मूल्यों। प्रतिगमन मापदंडों के मानक त्रुटियाँ हैं मापन में प्रतिशत परिवर्तन calcul थे पैदा 100 एक्स के रूप में [(एमबीएस से मूल्य - एमबीटी से मूल्य) / (एमबीटी से मूल्य)]।

एमबीटी और एमबीएस के लिए ड्यूटेरियम तेज कैनेटीक्स के लिए प्रतिगमन मापदंडों (एन तेजी, एन, धीमी गति से तेज कश्मीर और धीमी गति से कश्मीर) 2 टेबल में दिए गए हैं। एन तेजी से और एन धीमी मूल्यों एमबीटी से एमबीएस, एन धीमी गति में अंतर के लिए बड़े होते हैं हालांकि मूल्यों एन तेजी मूल्यों में मतभेद की तुलना में अधिक थे। एन धीमी मूल्य एमबीटी की तुलना में एमबीएस में 75% अधिक है, जबकि विशेष रूप से, एन तेजी से मूल्य, एमबीटी की तुलना में एमबीएस में केवल 18% अधिक है। इस एमबीटी में छोटे एन धीमी मूल्यों की वजह से एमबीएस में डी ओ 2 को उजागर कर रहे हैं कि excipients द्वारा एमबी संरचना या एमाइड समूहों के संरक्षण के उच्च अवधारण करने के लिए हो सकता है कि पता चलता है। हालांकि, विस्तृत तंत्र स्पष्ट रूप से समझ नहीं रहे हैं। दोनों योगों के लिए दर स्थिरांक (तेजी से कश्मीर और धीमी गति से कश्मीर) बहुत समान हैं।

पेप्टाइड स्तर पर ड्यूटेरियम तेज

पेप्सिन पाचन के बाद, 52 पेप्टाइड्स की कुल पहचान की गई। एमबी अनुक्रम की 100% करने के लिए इसी छह गैर-बेमानी टुकड़े यहां बताया विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया। पहले से 24 हमारे समूह द्वारा रिपोर्ट के रूप में अतिरिक्त जानकारी, अतिव्यापी टुकड़े का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक पेप्टाइड के लिए प्रतिशत ड्यूटेरियम तेज गणना की और 144 घंटा नमूनों से परिणाम (चित्रा -4 ए) साजिश रची गई थी। छह पेप्टिक टुकड़े के लिए इस HDX कैनेटीक्स "" धीमी "तेजी" और विनिमय के दौर से गुजर एमाइड hydrogens की उप-जनसंख्या के साथ संगत biexponential व्यवहार (4B चित्रा), दिखाया।

चित्रा 4
चित्रा 4: पेप्टाइड स्तर पर MB के लिए ssHDX एमएस: 6 गैर redu के लिए (ए) प्रतिशत ड्यूटेरियम तेजयोगों में एमबी से ndant पेप्टिक टुकड़े (ग्रे) एमबीटी और एमबीएस (सफेद) HDX के 144 घंटे के बाद। योगों में एमबी से छह गैर बेमानी पेप्टिक टुकड़े के लिए (बी) ssHDX कैनेटीक्स एमबीटी (ठोस लाइन) और एमबीएस (धराशायी लाइन)। ssHDX के समय के पाठ्यक्रम (एसडी ±, एन = 3) ग्राफ़ पैड चश्मे सॉफ्टवेयर संस्करण 5 का उपयोग करते हुए दो चरण घातीय एसोसिएशन के लिए एक समीकरण के लिए लगाया गया था।

Nonredundant पेप्टाइड्स के लिए प्रतिगमन मापदंडों चित्रा 5 में प्रस्तुत कर रहे हैं। पेप्टाइड टुकड़े के लिए फिट दर स्थिरांक व्यक्ति amides के लिए औसत दर स्थिर नहीं हो रहे हैं, पेप्टिक टुकड़े के लिए मनाया दर स्थिरांक रैखिक बरकरार प्रोटीन के लिए उन लोगों से संबंधित नहीं किया जा सकता। योगों एमबीएस में (टुकड़ा 56-69 छोड़कर) पेप्टिक टुकड़े से ज्यादातर के लिए एन तेजी मूल्यों एमबीटी (चित्रा 5A) में उन लोगों की तुलना में थोड़ा अधिक थे। इसी तरह, कश्मीर तेजी मूल्यों आम तौर पर formulatio के बीच थोड़ा अंतर से पता चलाएमबी अणु (चित्रा 5 ब) के विभिन्न क्षेत्रों में और एन एस। हालांकि, एमबीएस के लिए एन धीमी और कश्मीर धीमी मूल्यों एमबीटी (चित्रा 5C और 5D) के लिए अधिक से सभी टुकड़ों में काफी अधिक हैं। एमबीएस के लिए धीमी गति से एन धीमी और कश्मीर में काफी वृद्धि हुई है "" धीमी आदान प्रदान पूल में एमाइड समूहों में से अधिक से अधिक गतिशीलता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं।

चित्रा 5
चित्रा 5: MB पेप्टिक पेप्टाइड्स के लिए ssHDX गतिज पैरामीटर: एन तेजी (ए), एमबीटी (ग्रे) और एमबीएस (एन धीमी गति से (सी), तेजी से (बी) कश्मीर और योगों में एमबी से छह गैर बेमानी पेप्टिक पेप्टाइड्स के लिए ssHDX एमएस गतिज डेटा के nonlinear प्रतिगमन से प्राप्त धीमी गति से (डी) मूल्यों कश्मीर सफेद) (एन = 3, ± एसई)। </ P>

बरकरार प्रोटीन के स्तर पर Photolytic लेबलिंग

नियंत्रण रेखा एमएस (चित्रा 6A) द्वारा पता लगाया के रूप में एमबी, कई MB-pLeu adducts गठन 20x अतिरिक्त pLeu की उपस्थिति में विकिरणित। 20x pLeu लेबल हटाया गया एमबी की बड़े पैमाने पर करने के लिए 115, 230 और 345 दा के अलावा के साथ तीन लेबल के लिए आए थे साथ एमबीटी के लिए deconvoluted स्पेक्ट्रा 40 मिनट के लिए किरणित। 20x के साथ इसी तरह किरणित एमबीएस pLeu नियंत्रण रेखा-एमएस के द्वारा पता करने के लिए 2 से लेबल आबादी के साथ बरकरार स्तर पर कम pLeu तेज, दिखाया।

चित्रा 6
चित्रा 6: SSPL एमएस बरकरार MB के लिए: एमबीटी (ठोस लाइन) और 20x अतिरिक्त के साथ लेबल एमबीएस (धराशायी लाइन) के लिए (ए) Deconvoluted जन स्पेक्ट्रा pLeu (डब्ल्यू 5% / डब्ल्यू)। देशी एमबी (एमबी lyophilized और pLeu के अभाव में किरणित) की Deconvoluted जन स्पेक्ट्रम बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है। यू (बी) SSPL एमएस कैनेटीक्स एमबीटी (बंद हलकों) और pLeu एकाग्रता के एक समारोह के रूप में एमबीएस (खुला हलकों)। सभी नमूनों में 40 मिनट के लिए किरणित रहे थे। त्रुटि सलाखों के प्रतीकों के भीतर हैं। (सी) योगों में बरकरार MB के लिए SSPL एमएस कैनेटीक्स एमबीटी (बंद हलकों) और विकिरण समय के एक समारोह के रूप में एमबीएस (खुला हलकों) (डब्ल्यू / 20.7% डब्ल्यू) lyophilized और 100x अतिरिक्त pLeu की उपस्थिति में विकिरणित। त्रुटि सलाखों के प्रतीकों के भीतर हैं।

गतिज अध्ययन में, लेबल प्रोटीन का प्रतिशत बढ़ रही विकिरण समय (चित्रा 6B) के साथ एमबीटी और एमबीएस दोनों के लिए तेजी से वृद्धि हुई है। एमबीएस हर विकिरण समय में एमबीटी से भी कम pLeu तेज दिखाया। दोनों योगों 40 मिनट पर एक पठार तक पहुँचने के लिए दिखाई दिया। इस प्रकार, एक गतिज अध्ययन हमें हो सकता है eful पूरा pLeu सक्रियण प्राप्त करने की आवश्यकता विकिरण की अवधि निर्धारित करने के लिए। लेबल कैनेटीक्स भी pLeu एकाग्रता के एक समारोह (चित्रा 6C) के रूप में अध्ययन किया गया। लेबल प्रोटीन का प्रतिशत एमबीटी और एमबीएस दोनों के लिए pLeu एकाग्रता के साथ वृद्धि हुई है। हालांकि, pLeu डब्ल्यू / डब्ल्यू 20.7% पर, एमबीटी pLeu तेज में कमी देखी गई। इस वजह से उच्च pLeu एकाग्रता में प्रोटीन की सतह से pLeu का बहिष्कार करने के लिए हो सकता है। इसलिए, pLeu की एकाग्रता बदलती के साथ एक अध्ययन सतह अपवर्जन के बिना प्रोटीन सतह भर में पर्याप्त लेबलिंग के लिए अनुमति देता है कि उपयुक्त pLeu एकाग्रता का चयन करने के लिए किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, 20x अतिरिक्त pLeu आगे पेप्टाइड स्तर के अध्ययन के लिए चुना गया था।

समग्र एमबीएस के लिए मनाया लेबलिंग pLeu युक्त मैट्रिक्स को गरीब पक्ष श्रृंखला एक्सेसिबिलिटी पता चलता है की कमी हुई। यह कम लेबलिंग में यह परिणाम है कि सोर्बिटोल की उपस्थिति में एक गठनात्मक परिवर्तन के साथ संगत है।

सामग्री "> पेप्टाइड स्तर पर Photolytic लेबलिंग

बरकरार प्रोटीन लेबलिंग के अध्ययन के आधार पर, 20x अतिरिक्त pLeu पेप्टाइड स्तर पर एमबीटी और एमबीएस तुलना करने के लिए चुना गया था। लेबल किए गए नमूनों trypsin के साथ पचा और नियंत्रण रेखा-एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया। एमबी अनुक्रम की 100% करने के लिए इसी 40 पेप्टाइड्स की कुल एमबीटी और एमबीएस नमूने के लिए पाया गया। लिस और / या Arg अवशेषों भारी चिह्नित कर रहे हैं अगर कुछ मामलों में, tryptic पाचन सीमित प्रोटीन अनुक्रम कवरेज प्रदान कर सकता है। अनुक्रम कवरेज में सुधार करने के लिए, trypsin और काइमोट्रिप्सिन का एक मिश्रण लेबल प्रोटीन को पचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 7
चित्रा 7: MB के लिए SSPL एमएस पेप्टाइड स्तर पर: MB के कार्टून प्रतिनिधित्व Trehalose (ए) और सोर्बिटोल (बी) की उपस्थिति में 20x अतिरिक्त pLeu (/ डब्ल्यू डब्ल्यू 5%) के साथ लेबल। लेबल प्रोटीन trypsi के साथ पचा किया गया थाएन और लेबल पेप्टाइड्स एमबी की क्रिस्टल संरचना (PDB आईडी 1WLA) पर मैप किया गया। लेबल और लेबल हटाया गया क्षेत्रों क्रमशः, Magenta और हरे रंग के होते हैं।

ट्रिप्सिन पाचन के साथ SSPL एमएस पेप्टाइड्स चिह्नित किया जा रहा बारे में गुणात्मक जानकारी प्रदान करता है। बरकरार स्तर पर अलग से लेबल आबादी को देखते हुए, pLeu लेबलिंग और लेबल और लेबल हटाया गया पेप्टाइड्स के आयनीकरण क्षमता में अंतर के अनेक तंत्र, यह पाचन के बाद SSPL-एमएस के लिए मात्रात्मक मेट्रिक्स को प्राप्त करना कठिन है। हालांकि, गुणात्मक जानकारी अभी भी पेप्टाइड स्तर पर प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इस अध्ययन में, एमबीटी और एमबीएस दोनों योगों प्रोटीन सतह के सबसे भर में pLeu तेज दिखाया। एमबीएस की तुलना में, पेप्टाइड टुकड़े 32-42, 134-139 और एमबीटी से 146-153 pLeu लेबलिंग (चित्रा 7) दिखाया। यह इन अमीनो एसिड के पक्ष जंजीरों इन regio में helices के रूप में, pLeu को उजागर कर रहे हैं कि पता चलता हैएनएस एमबीटी मैट्रिक्स में बरकरार हैं। इसके विपरीत, एमबीएस मैट्रिक्स में pLeu लेबलिंग से सुरक्षा के लिए इन क्षेत्रों में संरचनात्मक perturbations के साथ संगत है।

कुल मिलाकर, ssHDX-एमएस और SSPL एमएस से परिणाम तरीकों को रीढ़ की हड्डी (ssHDX एमएस) और पक्ष-श्रृंखला (SSPL एमएस) lyophilized प्रोटीन योगों में जोखिम और excipient प्रभाव के बारे में पूरक उच्च संकल्प पेप्टाइड स्तर की जानकारी प्रदान कर सकते हैं सुझाव है कि ।

Discussion

कई अध्ययनों से lyophilized नमूनों में स्थानीय पर्यावरण प्रोटीन गिरावट 5,29,30 को प्रभावित करता है कि सुझाव दिया है। हालांकि, ठोस अवस्था में प्रोटीन की संरचना और स्थिरता के बीच सीधा संबंध स्थापित करने की वजह से उच्च संकल्प विश्लेषणात्मक तरीकों की कमी के कारण संभव नहीं किया गया है। lyophilized पाउडर करने के लिए इस तरह के HDX और पी एल के रूप में मौजूदा उच्च संकल्प के तरीकों के आवेदन समाधान प्रोटोकॉल और सावधान डेटा व्याख्या के संशोधन की आवश्यकता है। इस HDX एमएस और पी एल-एमएस क्रमिक ठोस राज्य में प्रोटीन रचना की निगरानी के लिए अपनाया गया है। परिणाम यहां प्रस्तुत किया है और कहीं और 27,28,31-33 ठोस वातावरण में उच्च संकल्प के साथ प्रोटीन रचना की निगरानी करने के लिए इन तरीकों की क्षमता का प्रदर्शन किया है। डेटा विश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम समाधान 34-36 में लेबलिंग से भिन्न नहीं है हालांकि, प्रयोगात्मक सेटअप और डेटा व्याख्या के दौरान महत्वपूर्ण विचार ठोस राज्य chemi के लिए आवश्यक हैंसीएएल लेबलिंग।

लेबलिंग अभिकर्मक के चुनाव में आकार और लेबलिंग की व्यवस्था पर आधारित होना चाहिए। ड्यूटेरियम के छोटे आकार pLeu के अपेक्षाकृत बड़े आकार के पक्ष-श्रृंखला के लिए लेबलिंग की सीमा जबकि पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी है, आसानी से जांच की जा करने के लिए अनुमति देता है। कि लेबलिंग केवल मैट्रिक्स के लिए रीढ़ की हड्डी और पक्ष-श्रृंखला जोखिम पर निर्भर करता है इसलिए ssHDX और SSPL दोनों, किसी भी अमीनो एसिड के लिए कोई वरीयता दिखा। प्रभावी रूप से ठोस राज्य में प्रोटीन रचना की जांच करने के लिए, लेबलिंग प्रक्रिया को प्रभावित करने वाले बाहरी कारकों को ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए। कुल राशि और lyophilized ठोस में लेबलिंग एजेंट के स्थानिक वितरण जलीय समाधान से अलग है।

SsHDX में, ठोस मैट्रिक्स में डी 2 हे की राशि खुलासा प्रोटीन की दर (या आंशिक खुलासा), refolding, और ड्यूटेरियम विनिमय प्रभावित कर सकता है। इस प्रोटीन नमूना सामान्य रूप से डी 2 ओ की पर्याप्त मात्रा के साथ पतला है, जिसमें समाधान HDX, साथ ऐसा नहीं हैSsHDX दर पर जलयोजन के प्रभाव से सावधान स्क्रीनिंग आदर्श आरएच शर्तों के चयन के बारे में सूचित कर सकते हैं। नमी sorption की दर को नियंत्रित करने और हीड्रोस्कोपिक excipients (जैसे sucrose और Trehalose) युक्त योगों में पाउडर के पतन से बचने के लिए, ssHDX प्रशीतित शर्तों के तहत बाहर किया जा सकता है (2-8 डिग्री सेल्सियस)। उम्मीद के रूप में जलयोजन प्रभाव पर हमारे पिछले अध्ययन, नमी की मात्रा में वृद्धि के साथ विनिमय की दर और किस हद तक वृद्धि हुई है दिखाया। हमारे काम, 5 डिग्री सेल्सियस पर 43% की एक मध्यवर्ती आरएच की ज्यादा में एक उचित समय 24 में योगों भेद करने के लिए आदर्श साबित हो गया है। एक पठार तक पहुँच जाता है जब तक प्रतिक्रिया आमतौर पर किया जाता है। यह ठोस में नमी sorption और प्रसार HDX दर पर नियंत्रण नहीं है कि यह सुनिश्चित करता है। ≤2 मिलीलीटर की पूर्व lyophilization मात्रा के साथ छोटे ठोस नमूना आकार का उपयोग भी है कि डी ओ 2 वाष्प sorption जल्दी विनिमय अवधि में अनिवार्य रूप से पूरा हो गया है सुनिश्चित करने के लिए मदद करता है। हालांकि ssHDX एमएस प्रदान करता हैठोस राज्य में प्रोटीन की रचना पर मात्रात्मक जानकारी, डेटा की व्याख्या पूरी तरह से अकेले ssHDX अध्ययन के आधार पर नहीं किया जा सकता है, जहां कुछ शर्तें हैं। यह कमी आई ड्यूटेरियम तेज होने के कारण प्रोटीन संरचना के उच्च प्रतिधारण या नमूने में मौजूद प्रोटीन समुच्चय के महत्वपूर्ण राशि के लिए किया जा सकता है (नियंत्रण की तुलना में) एक नमूने में मनाया कि संभव है। ऐसे मामले में, ssHDX डेटा की व्याख्या अन्य पूरक के तरीकों से परिणाम की आवश्यकता है। Deuterated जन स्पेक्ट्रा में पीक विस्तार कई एमबी योगों 27,28 के लिए मनाया गया। यह डी 2 हे एकाग्रता में नमूने में आंशिक रूप से सामने आया प्रोटीन आबादी, स्थानिक विविधता की उपस्थिति, या स्थानिक ढ़ाल जैसे विभिन्न कारकों की वजह से हो सकता है। हालांकि, इन कारकों ssHDX-एमएस में प्रतिष्ठित किया है और आगे जांच की जरूरत नहीं कर रहे थे।

SSPL एमएस अपेक्षाकृत नया है के रूप में अन्य तरीकों, लगातार सीखने एबी जब की तुलनाउसके आवेदन और सीमाओं से बाहर की आवश्यकता है। SSPL में, तस्वीर-पार linker प्रोटीन के साथ lyophilized है। नमी की कमी ठोस मैट्रिक्स के भीतर घटकों की गतिशीलता को सीमित करता है, और ssHDX में नमी sorption के साथ हो सकता है कि आंशिक संरचनात्मक छूट SSPL में एक घटना नहीं है। यह फोटो-पार linker के तत्काल आसपास के क्षेत्र के लिए SSPL में लेबलिंग की सीमा। हालांकि, इस HDX एमएस, छाछ-स्तर संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं covalently लेबल प्रोटीन की एमएस / एमएस विश्लेषण के विपरीत है। SSPL लेबलिंग सहसंयोजक और अपरिवर्तनीय है, वापस विनिमय उत्पन्न नहीं होती और नमूने तैयार है और लेबल के नुकसान के लिए चिंता के बिना विश्लेषण किया जा सकता है। लेबलिंग एजेंट के प्रसार को सुविधाजनक बनाने और ठोस मैट्रिक्स में लेबलिंग दक्षता में सुधार करने के लिए, SSPL बढ़ रही% आरएच के साथ किया जा सकता है। pLeu तेज भी photoreactive एजेंट की एकाग्रता में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है। के रूप में वांछित pLeu के लिए प्रोटीन की दाढ़ अनुपात अलग किया जा सकता है। सामान्य में, समर्थक pLeu की एक 100x दाढ़ अतिरिक्तTein पर्याप्त लेबलिंग सुनिश्चित करेगा। बहरहाल, उच्च pLeu एकाग्रता ठोस मैट्रिक्स में प्रोटीन तृतीयक संरचना की हानि हो सकती है। इसलिए, लेबलिंग कैनेटीक्स और निर्माण रचना के अलावा, pLeu एकाग्रता का चयन भी प्रोटीन संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के आधार पर किया जाना चाहिए। PLeu nonselectively xh के लेबल के रूप में समूह, यह संभव है (एक्स = सी, एन, ओ जहां) इसी तरह की लेबलिंग साइटों के साथ excipients बहुत प्रोटीन लेबलिंग के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं। प्रोटीन लेबलिंग के लिए pLeu की उपलब्धता में excipients के हस्तक्षेप अभी तक लक्षण वर्णन किया जा रहा है। यह diazirine सक्रियण से उत्पन्न carbene छाछ-विशिष्ट नहीं है कि जाना जाता है, लेकिन एक अध्ययन एएसपी और ग्लू 36 की ओर पूर्वाग्रह की रिपोर्ट। यह अवशेषों विशिष्ट बातचीत के बारे में जानने के लिए अच्छा है, पेप्टाइड स्तर की जानकारी भी उपयोगी है और ठोस राज्य में उच्च मैट्रिक्स जोखिम के साथ क्षेत्रों को ब्लॉक करने के excipients डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। SSPL एमएस हालांकि, विस्तृत गुणात्मक जानकारी प्रदान करता हैमात्रात्मक डेटा प्राप्त करने की आवश्यकता है और मजबूत मेट्रिक्स lyophilized प्रणालियों की एक किस्म भर में तैयार अंतर का विश्लेषण करने के लिए विकसित करने की आवश्यकता है।

एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ संयुक्त एक अवशेषों विशिष्ट लेबल के उपयोग के आगे एमिनो एसिड के स्तर को संकल्प में वृद्धि कर सकते हैं। ऐसे 2,3-butanedione के रूप में लेबल अभिकर्मकों Arg, Cys के लिए लिस और एन -alkylmaleimide डेरिवेटिव के लिए एन -hydroxysuccinimide डेरिवेटिव ठीक lyophilized पाउडर में आणविक बातचीत नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता लेबल करने के लिए। हालांकि इन अभिकर्मकों पीएच-निर्भर कर रहे हैं और प्रतिक्रियाओं के रूप में ठोस राज्य में photolytic लेबलिंग के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण auxotrophic सेल लाइनों, साइट निर्देशित उत्परिवर्तजनन या पक्ष श्रृंखला derivatization के उपयोग के साथ प्रोटीन अनुक्रम में फोटो-पार linker शामिल करने के लिए है।

हमारे पिछले ssHDX-एमएस और SSPL एमएस पढ़ाई प्रोटीन की लेबलिंग excipients की प्रकृति और मात्रा पर निर्भर करता है कि पता चला है24,27,28,31-33,37,38 इस्तेमाल किया। एमबी कम आणविक वजन 32 शर्करा के साथ-lyophilized सह से एमबी की ssHDX एमएस guanidine हाइड्रोक्लोराइड (Gdn.HCl) के साथ-lyophilized सह अधिक से अधिक ड्यूटेरियम तेज दिखाया। Gdn.HCl सूक्रोज के साथ 33 एमबी से photolytic लेबलिंग से अधिक से अधिक सुरक्षा से पता चला है के साथ एक अलग SSPL एमएस अध्ययन में, MB-lyophilized सह। इसके अलावा, ssHDX एमएस से मात्रात्मक माप अत्यधिक लंबी अवधि के भंडारण 28 के दौरान प्रोटीन की स्थिरता के साथ सहसंबद्ध किया गया है। इन अध्ययनों से प्रोटीन की ssHDX या SSPL lyophilized पाउडर में प्रोटीन की संरचनात्मक प्रतिधारण की हद को दर्शाता है कि सलाह देते हैं। हम lyophilized पाउडर में माध्यमिक संरचना की अवधारण के पक्ष श्रृंखला pLeu साथ लेबलिंग और ड्यूटेरियम मुद्रा से एमाइड के संरक्षण के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करता है कि विश्वास करते हैं। हालांकि, इन तरीकों से सूचनात्मक सामग्री की विस्तृत तुलना भविष्य में प्रदर्शन करने की जरूरत है। SsHDX-एमएस और SSPL-एमएस की उपयोगिता की स्थापना हालांकिएक सूत्रीकरण स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में कई प्रोटीन के लिए लागू किया है कि अंततः की आवश्यकता होगी, हमारे हाल के अध्ययनों से परिणाम अपने व्यापक गोद लेने का समर्थन करता है। आगे के विकास के साथ, इन तरीकों बायोफर्मासिटिकल उद्योग में ठोस राज्य प्रोटीन योगों निस्र्पक के लिए व्यापक रूप से उपयोगी होने की उम्मीद कर रहे हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equine myoglobin Sigma-Aldrich M0630-5G
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma Aldrich #T9531
D-Sorbitol Sigma Aldrich #240850
L-Photo-leucine Thermo Scientific #22610
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich #P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich #P3786
Deuterium Oxide Cambridge Isotope Laboratories #DLM-4-PK Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilized pepsin Applied Biosystems #2-3132-00
Trypsin Promega #V511A Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used
Water, Optima LC/MS grade Fisher Chemical #7732-18-5
Acetonitrile Sigma-Aldrich #34998
Formic acid Thermo Scientific #28905
ESI-TOF Calibrant Agilent Technologies #G1969-85000 Highly flammable liquid
Protein microtrap Michrom Bioresources TR1/25108/03
Peptide microtrap Michrom Bioresources TR1/25109/02
Analytical column Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18
Freeze dryer VirTis AdVantage Plus
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps Stratagene Corp. Stratalinker 2400
HPLC Agilent Technologies 1200 series LC Refrigerated LC system for HDX-MS
ESI-qTOF MS Agilent Technologies 6520 qTOF
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) Sierra Analytics http://www.massspec.com/HDExaminer.html

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References

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बड़े पैमाने पर spectrometric Lyophilized पाउडर में प्रोटीन संरचना और बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रयास
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Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).More

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).

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