Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Massespektrometrisk Approaches å studere Proteinstruktur og interaksjoner i Lyofiliserte Pulver

doi: 10.3791/52503 Published: April 14, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Amid hydrogen / deuterium-utveksling (ssHDX-MS) og sidekjede fotolytisk merking (SSPL-MS), etterfulgt av massespektrometrisk analyse kan være verdifulle for karakterisering av lyofiliserte preparater av protein-terapeutika. Merking etterfulgt av egnet proteolytisk nedbrytning gjør at proteinstruktur og interaksjoner som skal kartlegges med peptid-nivå oppløsning. Siden proteinstrukturelementene er stabilisert ved hjelp av et nettverk av kjemiske bindinger fra sidekjeder av aminosyrer, spesifikk merking av atomer i aminosyrerestene gir innsikt i strukturen og konformasjon av proteinet hovedkjeder og. I motsetning til rutinemessige metoder som brukes for å studere proteiner i frysetørkede faste stoffer (f.eks FTIR), ssHDX-MS og SSPL-MS gi kvantitative og stedsspesifikke informasjon. Omfanget av deuterium inkorporering og kinetiske parametre kan være relatert til hurtig og langsomt utveksling amid bassenger (N raskt, N sakte) og reflekterer de grader direkteree av proteinfolding og struktur i frysetørkede formuleringer. Stabil fotolytisk merking gjennomgår ikke back-utveksling, en fordel over ssHDX-MS. Her gir vi detaljerte protokoller for både ssHDX-MS og SSPL-MS, ved hjelp av myoglobin (Mb) som modell protein i frysetørkede formuleringer som inneholder enten trehalose eller sorbitol.

Introduction

Protein narkotika er den raskest voksende delen av biofarmasøytiske industrien og har lovende nye behandlinger for hittil har vært vanskelige sykdommer, inkludert hormonelle lidelser, kreft og autoimmune sykdommer 1. I 2012 nådde den globale biotherapeutics markedet $ 138 000 000 000, og er forventet å nå $ 179 000 000 000 innen år 2018 2. Proteiner er større og mer skjør enn konvensjonelle små molekyl narkotika og så er mer utsatt for mange typer nedbrytning tre. For å sikre tilstrekkelig holdbarhet og stabilitet, er protein-medikamenter ofte formulert som lyofiliserte (dvs, fryse-tørket) faste pulvere. Imidlertid kan et protein fremdeles gjennomgår nedbrytning i fast tilstand, spesielt hvis den opprinnelige struktur ikke er bevart under lyofiliseringsprosessen 4,5. Sikre at strukturen er beholdt er mulig bare hvis det er analytiske metoder som kan detektere protein konformasjon i solid-state med sufficient oppløsning.

NMR-spektroskopi 6 og røntgenkrystallografi 7 er de som vanligvis brukes med høy oppløsning metoder for å vurdere proteinstruktur i oppløsning og krystallinske faststoffer 8. På grunn av innholdet av hjelpestoffer og bearbeidingsmetoder som benyttes, frysetørkede protein formuleringer er vanligvis amorfe snarere enn krystallinsk 9. Mangelen på homogenitet og mikroskopisk rekkefølge gjør de ovennevnte teknikker upraktisk for proteiner i amorfe, faste stoffer. Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) 10, Raman-spektroskopi 11 og nær infrarød spektroskopi (NIR) 12 er regelmessig brukt av biofarmasøytiske industrien for å sammenligne protein sekundærstruktur i lyofiliserte pulvere som i den native løsningstilstand struktur. Men disse metodene er lav oppløsning og kan bare gi informasjon om globale endringer i sekundærstruktur. Solid-state strukturell karakterisering ved hjelp av FTIRhar vist enten svak 13,14 eller dårlig 15 korrelasjon med langtidslagringsstabilitet. Disse begrensningene aktualiserer behovet for egnede høyoppløselige metoder for å identifisere protein strukturelle forstyrrelser i solid-state.

Kjemisk merking kombinert med proteolyse og massespektrometrisk analyse har dukket opp som en kraftig tilnærming til overvåking proteinstruktur og molekylære interaksjoner i vandig løsning. I farmasøytisk utvikling, har HDX-MS blitt brukt for epitopkartlegging i antigen-antistoff interaksjoner 16,17, for å kartlegge reseptor-interaksjoner 18, for å overvåke effekten av post-translasjonelle modifikasjoner på konformasjon av protein narkotika 19, og for å sammenligne batch-til-batch variasjon i utviklingen biosimilars 20. Tilsvarende har photoactivatable ligander blitt brukt for å identifisere medikament mål og å bestemme bindingsaffinitet og spesifisitet av medikament-reseptor interaksjoner 21,22. Til eXtend anvendelsen av disse metodene til frysetørkede formuleringer, har vår gruppe utviklet solid-state hydrogen deuterium utveksling massespektrometri (ssHDX-MS) og solid-state fotolytisk merking massespektrometri (SSPL-MS) for å studere protein conformations og eksipienspartikler interaksjoner i frysetørkede prøver med høy oppløsning.

I begge ssHDX-MS og SSPL-MS, blir protein merket under ideelle reaksjonsbetingelser i lyofiliserte faste stoffer, og prøvene blir deretter rekonstituert og analysert ved massespektrometri med eller uten proteolytisk fordøyelse. ssHDX-MS gir informasjon om hovedkjeden eksponering for deuterium damp, mens SSPL-MS gir informasjon om miljøet av sidekjeder (figur 1). De to metodene kan dermed gi utfyllende informasjon om protein konformasjon i solid-state. Her gir vi en generell protokoll for å studere proteiner i frysetørkede faste stoffer ved hjelp ssHDX-MS og SSPL-MS (figur 2), ved hjelp av Mb somen modell protein. Vi viser evnen av de to fremgangsmåter for å skille forskjeller i formuleringene med to forskjellige hjelpestoffer.

Figur 1
Fig. 1: ssHDX og SSPL måle proteinstrukturen i lyofiliserte faste stoffer gjennom forskjellige merkingsmekanismer (A) I HDX, hydrogenatomer i ryggraden amid utveksling med deuterium som en funksjon av proteinstruktur og D 2 O tilgjengelighet. I fast tilstand, hastighet og grad av deuterium-utveksling avhenge av nivået av D 2 O sorpsjon, protein mobilitet (utfolding og refolding hendelser) og arten av hjelpestoffene er til stede i den faste matriks. (B) I PL, UV-bestråling ved 365 nm initierer dannelse av et reaktivt mellomprodukt karben fra diazirine funksjonell gruppe pLeu og settes inn ikke-spesifikt inn i en hvilken som helst XH bindingen (X = en hvilken som helst atom), eller added tvers av en C = C-binding i dens umiddelbare nærhet. I fast tilstand, hastigheten og graden av merking avhenge av den lokale konsentrasjonen av merkemiddel, bestrålingstiden, proteinstruktur og arten av hjelpestoffene er til stede i den faste matriks. Panelene A og B viser den maksimale teoretiske merking som kan oppstå på ryggraden, og sidekjeder i henholdsvis protein.

Figur 2
Figur 2: Skjematisk viser solid-state HDX-MS (A) og PL-MS (B) for protein i lyofilisert formulering.

Protocol

1. Prøvepreparering og Lyofilisering

  1. Dialyser den nødvendige volum av Mb stamløsning mot en egnet buffer, og filteret gjennom et 0,22 um sterilfilter.
  2. Klargjør det nødvendige volumet av hjelpestoffer og foto-leucin (L-2-amino-4,4-azi-pentansyre; pLeu) stamløsninger i egnet buffer. Filtrere lager løsninger gjennom et 0,22 mikrometer sterilt filter.
  3. Fremstille formuleringer som vist i tabell 1 ved hjelp av stamløsninger med protein, hjelpestoffer, pLeu, og buffer.
  4. Filterprøver gjennom et 0,22 um sterilfilter for å fjerne eventuelle partikler som dannes i trinn 1.3. Fyll prøvene separat som 0,2 ml til 2 ml hetteglass. Bruke glassflasker som er gjennomsiktig for UV (365 nm) lys for å aktivere pLeu i SSPL-MS-studier.
  5. Lasthetteglassene i en lyofiliseringsanordning og initiere frysetørking ved å utforme en hensiktsmessig lyofiliseringssyklusen.
    1. Her fryse prøvene ved -40 ° C, etterfulgtved primær tørking under vakuum (70 mTorr) ved -35 ° C i 12 timer og sekundær tørking ved 25 ° C i 12 timer. Andre lyofilisering sykluser og tørkemetoder (for eksempel spraytørking) kan også anvendes.
  6. Fylle hetteglass som inneholder frysetørkede prøver med nitrogen før tildekking.
Formuleringer Sammensetning (mg / ml) forut for lyofilisering
Mb Trehalose Sorbitol pLeu c Kalium, fosfat, pH 7.4
MBT en 1.7 3.4 - - 0.4
MBs en 1.7 - 3.4 - 0.4
MBT + pLeu b 1.7 3.4 - 14.3 x 10 -3 til 1,43 0.4
MBS + pLeu b 1.7 - 3.4 14.3 x 10 -3 til 1,43 0.4

Tabell 1:... Sammensetning av lyofiliserte formuleringer Mb en Formuleringer anvendt for ssHDX-MS-undersøkelsen b Formuleringer anvendt for SSPL-MS-undersøkelsen c L-2-amino-4,4-azipentanoic syre eller foto-leucin (pLeu). pLeu på fem ulike konsentrasjoner (14.3 x 10 -3 til 1,43 mg / ml) tilsvarer 1x, 10x, 20x, 50x og 100x molar overskudd i forhold til Mb ble co-frysetørket med MBT og MBS formuleringer.

2. ssHDX-MS for Intakt Protein

  1. Legg en mett beløp (~ 440 g) av K 2 CO 3-200 ml D 2 O previously er lagt inn i det nedre kammeret av en eksikator. Tett eksikkator lufttett og la det oppnå ved 5 ° C til en stabil relativ luftfuktighet (RH) fra ~ 43% er nådd. Andre RH verdier av interesse kan oppnås ved å velge forskjellige mettede saltløsninger 23,24.
  2. Initiere ssHDX reaksjoner ved å plassere uavdekkede ampuller inneholdende den lyofiliserte protein i det øvre kammeret i eksikator. Forsegl eksikator luft-tett og inkuberes ved 5 ° C for å tillate HDX å oppstå (figur 2A).
  3. Samle ssHDX prøver på ulike tider i tre eksemplarer. For Mb formuleringer, samle inn prøver på ni tidspunkter 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 og 144 hr.
  4. Cap flaskene umiddelbart etter uttak fra eksikkatoren og slukke reaksjonene etter flash frysing hetteglassene i flytende nitrogen. Oppbevar ampuller ved -80 ° C inntil massespektrometrisk analyse.
  5. Analysere prøver ved hjelp av en egnet høyoppløselig væskekromatografi-masse SpectromEtry (LC-MS) metoden. Design eller kjøpe en egnet kjøle LC system for å minimere tilbake-utveksling under prøveanalysen. Bruk oppsett av kolonnen kjøleaggregatet og LC-MS metode tidligere rapportert 25.
    MERK: Siden frekvensen av amid-proton bytte avhenger av pH og temperatur, kan deuteroner inkorporert i protein utveksle med hydrogen til stede i den mobile fase ("back exchange"), som forårsaker et tap av informasjon. Selv om en sur pH-verdi (pH 2,5) for kjølebuffer og HPLC-oppløsningsmidler kan minimalisere tilbake-utveksling i stor grad, å redusere temperaturen (≤0 ° C) ved hjelp av en egnet kolonne kjølesystemet kan videre beskytte proteinet fra back-utveksling .
  6. Koble prøvesløyfen og protein felle til ventilen som automatisk styrer avsalting og eluering prosessen. Kalibrer massespektrometer ved å injisere en TOF lav konsentrasjon innstiller blandingen i massespektrometret i m / z rekke 200-3,200. Den immobilisertpepsin kolonne og analytisk kolonne er ikke nødvendige for intakt proteinanalyse.
  7. Sett temperaturen i kjølesystemet for å ≤0 ° C og vente på at systemet skal nå en stabil driftstemperatur på ~ 0 ° C.
  8. Raskt overføre prøvene fra -80 ° C i flytende nitrogen for massespektrometrisk analyse. Ved hjelp av pinsett, nøye trekke hver ampulle fra flytende nitrogen og rekonstituere prøven ved tilsetning av en bestemt volum av iskald stoppbuffer inneholdende 0,2% maursyre (FA) (pH 2,5) og 5% metanol i vann til ampullen.
  9. Programmere en passende HPLC og massespektrometri metode med styreprogramvaren. For Mb formuleringer, avsalte prøve inneholdende 20 pmol Mb i protein felle i 1,7 minutter med 5% acetonitril, 95% vann og 0,1% maursyre (FA), og elueres ved anvendelse av en gradient økt til 80% acetonitril, 20% vann og 0,1 % FA i 3.3 min. Samle massespektra over m / z utvalg 200-3,200.
  10. For å bestemme massen av intaktprotein, innhente data for en undeuterated proteinprøve (dvs. protein ikke er utsatt for ssHDX) i vandig løsning ved anvendelse av metoden ifølge trinn 2.9.
  11. Få massene av undeuterated og deutererte prøver ved deconvoluting rå spektra bruker dataanalyse programvare. Her angir massespekter til 15.000-18.000 Da, masseoppløsning til 1,0 Da, og topphøyden til 90% for å beregne massen av Mb.
  12. Beregne antall deuteroner innlemmet i det intakte protein (her, Mb) ved å trekke massen av undeuterated protein fra massen av deuterert protein ved hver sentral tidspunkt.
  13. Beregne prosent deuterium opptak i forhold til det teoretiske maksimum ved hjelp av den følgende ligning (ligning 1)
    Ligning 1
    hvor totalt antall utskiftbare amider = totalt antall aminosyrer - antall prolinresidier - 2 ("to" kontoer for N-terminal aminogruppe og amid hydrogen som gjennomgår en rask back-utveksling).
  14. Monter ssHDX kinetiske data ved hjelp av en egnet eksponentiell likning. En bieksponentielt ligning (ligning 2) er vanligvis den enkleste som gir en rimelig tilpasning til ssHDX data. I denne studien, for MBT og MBs, passe dataene til en bieksponentielt modell som tildeler deuteroner til "rask" og "treg" utveksle bassenger.
    Ligning 2
    der N rask og N treg er antall utskiftbare amider i "rask" og "treg" utveksle bassenger, henholdsvis, og k rask og k treg er de første orden hastighetskonstanter forbundet med de to bassengene.

3. ssHDX-MS for Protein på Peptide nivå

  1. Utføre ssHDX ved å følge trinn 02.01 til 02.08, med følgende modifikasjoner i trinn 2.6. Koble immobilisert pepsin colstøtten og analytisk kolonne til ventilen som rapportert tidligere 25 og erstatte det protein felle forbundet til ventilen med en peptid-felle. Kalibrer massespektrometer ved å sette massen for å lade-forhold som varierer fra 100 til 1.700.
    NB: I løpet av rekonstitusjon trinn (trinn 2.8), kan et reduksjonsmiddel og denaturerende middel bli inkludert i kjøle buffer for å lette pepsin fordøyelsen av proteiner med disulfidbindinger (for eksempel monoklonale antistoffer).
  2. Programmere en passende HPLC og massespektrometri metode med styreprogramvaren. For Mb formuleringer, fordøye prøver som inneholdt 20 pmol Mb online med 0,1% FA, felle og avsalte peptider for 1,7 min med 10% acetonitril, 90% vann og 0,1% FA i et peptid felle. Eluere fragmentene på den analytiske kolonnen med en gradient økning til 60% acetonitril, 40% vann og 0,1% FA i 4,0 min. Erverve massespektra over m / z utvalg 100-1,700.
  3. Identifiser peptisk fragmenter ved MS / MS-analyse av enundeuterated protein prøven. Bruk massespektrometri programvare for å sammenligne eksperimentelle masser av peptid fragmentioner til den anslåtte masser av peptidfragmenter i en tilpasset database. Sette en masse cut-off point (f.eks 10 ppm) for å identifisere massene med lav feil. For peptider matchet, utarbeide en liste bestående av (i) peptidsekvens, (ii) ladetilstand, og (iii) oppholdstid.
  4. Bruk listen genereres i trinn 3.3 for å kartlegge og bestemme den gjennomsnittlige antall deuteroner inkorporert for hver pepsin fordøye fragment. Dette kan oppnås ved å anvende passende HDX-MS dataanalyseprogramvare 24.
  5. For å beregne prosent deuterium opptak og å passe ssHDX kinetiske data for hver av de peptic fragmenter, følg trinn 2.13 og 2.14. I denne studien HDX kinetiske data for hver av seks ikke-redundante pepsin fordøye fragmenter fra MBT og MBS formuleringer ble montert på en bieksponentielt forening modell (ligning 2).

4. SSPL-MS for Intakt Protein

  1. For å begynne fotolytisk merking reaksjon, først slå på UV kryssbinder og la lampene til å varme opp for 5 min. Sørg for at UV-kilde er utstyrt med lamper av bølgelengde 365 nm for å aktivere diazirine gruppe pLeu.
    ADVARSEL: Du må aldri åpne døren til UV kryssbinder når lampene er på. Beskytt øynene og huden mot eksponering for UV lys om kilden ikke er omsluttet av en UV-beskyttende glass dør.
  2. Slå av UV kryss kobling før du åpner døren. Når lampene er slått av, korken flaskene inneholder lyofilisert formulering og plassere dem inne i UV kryss kobling kammeret som vist i figur 2B. Bestråle prøven med UV-lys i 40 minutter.
  3. Utføre kontrollforsøk ved å følge trinn 4,1 til 4,3 for (i) prøver lyofilisert uten pLeu og (ii) prøver lyofilisert med pLeu rekonstituert i vann.
  4. Hetten og lagre ampuller ved -20 ° C inntil massespektrometrisk analyse.
  5. ReconstitUte de faste stoffer ved å tilsette et egnet volum av massespektrometri karakter destillert vann for å bringe konsentrasjonen til 2 uM.
  6. Til å begynne prøveanalyse, følg trinn 2,6 og 2,9.
    MERK: Siden back-utveksling er ikke et problem med kovalente merking, betyr SSPL-MS krever ikke en spesiell nedkjølt LC system.
  7. For å bestemme den opprinnelige massen av protein, samle inn data for en proteinprøve som ikke er blitt underkastet SSPL ved å følge trinn 2.9. Få massene av umerkede og merkede prøver ved deconvoluting rå spektra som forklart i trinn 2.11.
  8. Beregne antall pLeu innlemmet ved hjelp av følgende formel:
    Ligning 3
    hvor L M er massen av merket protein, M er N massen av nativt protein og 115 er den gjennomsnittlige masse (Da) tilsatt til nativt protein etter enkel pLeu inkorporering. Legg merke til at merkingsreaksjonen skjer med the tap av N 2 (28 Da). Den monoisotopic masse pLeu er 143,07.
  9. Beregne prosenter av protein populasjoner med forskjellig antall etiketter med topphøyder fra de utpakkede ionekromatogrammer.
    Ligning 4
    hvor "i" betegner antall etiketter, PH i betegner topphøyden for merket protein Lj og PH u betegner topphøyden av umerket protein som observert ved hjelp av massespektrometri.

5. SSPL-MS for Protein på Peptide nivå

  1. Utføre SSPL ved å følge trinn 04.01 til 04.04.
  2. For peptid-nivå analyse, rekonstituere faste prøver i ammoniumbikarbonat buffer (100 mM, pH 8,0).
  3. Etter oppløsning, blande den merkede proteinløsning med trypsin ved 10: 1 molart forhold av protein til trypsin og inkuber ved 60 ° C i 16 timer.
  4. Stans reaksjonen ved tilsetning av 0,1% FAi vann til prøven for å gi sluttkonsentrasjon på 2 mM protein.
  5. Koble prøvesløyfen, peptid felle og analytisk kolonne til ventilen koblet til HPLC-systemet.
  6. Programmere en passende HPLC og massespektrometri metode med styreprogramvaren. For Mb formuleringer, injisere 20 pmol av spaltet protein inn i prøvesløyfen, og avsalte peptidene i en peptid-felle i 1,5 min med 5% acetonitril, 95% vann og 0,1% FA, etterfulgt av en eluering i den analytiske kolonnen med en gradient øke til 55% acetonitril, 45% vann og 0,1% FA i 22 min. Samle massespektra over m / z utvalg 100-1,700.
  7. Forberede en teoretisk masseliste for peptid-pLeu addukter bruker et nettbasert verktøy som ExPASy 26 med antall pLeu tidligere regnet fra intakt protein analyse. Ta med minst fire savnet splittelsene. Legg merke til at merkingsreaksjonen skjer med tap av N2. Derfor er massen av peptid-pLeu addukt = massen av umerket prøveptic peptid + n (masse av pLeu) - n (massen av N2), der "n" er antall pLeu innarbeidet.
    MERK: Hvis massen analyse av intakt protein viste opptil tre merkede bestander av protein, vurdere opp til tre mulige pLeu etiketter per peptid. For et peptid med masse på 1000 Da, ville den teoretiske massen av peptid-pLeu addukt med en pLeu inkorporering være 1000 + 1 (143) - 1 (28) = 1115 Da. Tilsvarende teoretiske masser av peptid-pLeu addukter med to pLeu, 3 pLeu, etc. ville være 1230 Da, 1345 Da, etc., henholdsvis.
  8. Bruk masse analyse programvare for å matche den teoretiske masseliste genereres i trinn 5.7 med massene observert eksperimentelt. Sette en masse cut-off point (f.eks 50 ppm) for å identifisere massene med lav feil.
  9. For peptider matchet, fastslå den faktiske antall pLeu innarbeidet etter formelen under trinn 4.8 (ligning 3), der M L og M N er massene av merketog native peptid, henholdsvis.

Representative Results

Her har ssHDX-MS og SSPL-MS blitt anvendt for å studere effekten av hjelpestoffer på konformasjonen og solid state interaksjoner av lyofiliserte Mb formasjoner. Konsentrasjonene av protein og hjelpestoffer som brukes i denne undersøkelsen er angitt i tabell 1. Representative resultater fra ssHDX-MS og SSPL-MS-analyse av lyofiliserte Mb som oppnås ved å følge de ovenfor angitte protokoller er presentert.

Deuterium opptak ved intakt protein nivå

ssHDX-MS er stand til å skille mellom Mb formuleringer ved intakt nivå. Den deconvoluted massespektra av intakte Mb følgende 144 hr av ssHDX fra formulering MBS viste større deuterium opptak enn formulering MBT (figur 3A). På en gjennomsnittlig, MBS viste 46% større deuterium opptak enn MBT (tabell 2).

Figur 3 Figur 3: ssHDX-MS for intakte Mb: (A) Deconvoluted massespektra av deutererte intakte Mb fra formuleringer MBT (heltrukket linje) og MBS (stiplet linje) etter 144 timer av ssHDX. Den deconvoluted massespektrummet undeuterated intakte Mb er også vist (stiplet linje). (B) ssHDX kinetikk for intakte Mb i formuleringer MBT (heltrukket linje) og MBS (stiplet linje). Tidsforløpet for ssHDX ble montert på en ligning for to fase eksponensiell forening ved hjelp Graf Pad Prism programvare versjon 5 (n = 3, ± SD).

De deutrering kinetikk for intakte MBS og MBT ligner på tidlige tidspunkter (1-4 time), men MBS viste økt deuterium utveksling med økning i tid (8-144 timer) (figur 3B). Dette antyder viktigheten av å velge lengre tidspunkter for ssHDX ved lavere relativ fuktighet og temperaturforhold. Dessuten kan D-2-O-sorpsjon og spredning prosessen påvirker hastigheten av ssHDX på et tidlig tidspunkt points. Våre tidligere undersøkelser har vist at fuktighet sorpsjon i ssHDX er fullført i løpet av noen timer, og har minimalt bidrag til å utveksle kinetikk utover dette tidspunkt. Den observerte hastighet og grad av utveksling er derfor ikke bare målinger av D 2 O adsorpsjon 27,28. De små feilfelt i figur 3B, som indikerer standardavvik fra tre uavhengige ssHDX-MS prøver, viser at forsøket er meget reproduserbar.

Deuterium Opptak (%) b N rask c k rask c N treg c k treg c
MBT en 15.9 ± 0.5 13.1 (0.8) 0,43 (0,03) 11.0 (0.9) 0.019 (0,001)
MBs en 23.2 ± 0.5 15.4 (0.7) 0,49 (0,04) 19.2 (0.6) 0,024 (0,002)
% Endring d 46% 18% 14% 75% 26%

Tabell 2:. Kvantitative tiltak av deuterium opptak i ssHDX studier av Mb formuleringer en Se tabell 1 for komposisjon b Percent deuterium opptak i forhold til teoretisk maksimum av intakte Mb etter 144 timer av HDX ved 5 ° C, 43% RH (n = 3. , gjennomsnitt ± SD). c parametrene bestemmes av ikke-lineær regresjon av ssHDX-MS-kinetiske data. Tidsforløpet av deuterium bytte for intakt Mb ble montert på en bieksponentielt forening modell (eqn. 2). Verdier i parentes er standardfeil av regresjonsparametrene. D prosent endring i målingene var calculrerte som 100 x [(verdi fra MBS - verdi fra MBT) / (verdi fra MBT)].

Regresjonsparametrene (N rask, N sakte, k rask og k sakte) for deuterium opptak kinetikk for MBT og MBS er gitt i tabell 2. Selv om N raske og N langsomme verdier er større for MBS enn MBT, forskjeller i N treg verdiene var større enn forskjellene i de N raske verdier. Spesielt er N rask verdi bare 18% større i MBs enn i MBT, mens N treg verdi er 75% større i MBs enn i MBT. Dette tyder på at de mindre N langsomme verdier i MBT kan være på grunn av høyere oppbevaring av Mb struktur eller beskyttelse av amidgrupper av hjelpestoffer som er utsatt for D 2 O i MBs. Imidlertid er de detaljerte mekanismer ikke klart forstått. De hastighetskonstanter (k rask og k treg) for begge formuleringene er svært like.

Deuterium opptak på peptid nivå

Etter pepsin fordøyelsen, ble totalt 52 peptider identifisert. Seks ikke-redundante fragmenter som tilsvarer 100% av MB-sekvensen ble brukt for analysen rapportert her. Ytterligere informasjon kan fås ved å bruke overlappende fragmenter, som rapportert av vår gruppe tidligere 24. Den prosentvise deuterium-opptak for hvert peptid ble beregnet, og resultatene fra 144 timers prøver plottet (figur 4A). HDX-kinetikk for de seks peptic fragmenter viste bieksponentielt atferd (4B), i samsvar med subpopulasjoner av amid hydrogen som gjennomgår "rask" og "treg" utveksling.

Figur 4
Figur 4: ssHDX-MS for Mb på peptidet nivå: (A) Prosent deuterium-opptak for seks ikke-redundant peptic fragmenter fra Mb i formuleringer MBT (grå) og MBS (hvit) etter 144 timer av HDX. (B) ssHDX kinetikk for seks ikke-redundante peptic fragmenter fra Mb i formuleringer MBT (heltrukket linje) og MBS (stiplet linje). Tidsforløpet for ssHDX ble montert på en ligning for to fase eksponensiell forening ved hjelp Graf Pad Prism programvare versjon 5 (n = 3, ± SD).

Regresjonsparametrene for nonredundant peptider er presentert i figur 5. Som montert hastighetskonstantene for peptidfragmenter er ikke den gjennomsnittlige hastighetskonstanten for de enkelte amider, de observerte hastighetskonstantene for peptisk fragmenter kan ikke lineært i forhold til de for det intakte protein. N raske verdier for de fleste av peptic fragmenter (unntatt fragment 56-69) i formuleringer MBS var litt større enn de i MBT (figur 5A). Tilsvarende k raske verdier generelt viste liten forskjell mellom substans,ns og i ulike regioner av Mb molekylet (Figur 5B). Men N langsomme og k langsomme verdier for MBS er betydelig større i alle bitene enn for MBT (figur 5C og 5D). Den betydelige økningen i N langsom og k treg for MBS kan reflektere større mobilitet av amidgrupper i "slow" utveksle bassenger.

Figur 5
Figur 5: ssHDX kinetiske parametere for Mb peptic peptider: N rask (A), k rask (B), N treg (C) og k sakte (D) verdier hentet fra ikke-lineær regresjon av ssHDX-MS-kinetiske data for seks ikke-redundante peptic peptider fra Mb i formuleringer MBT (grå) og MBS ( hvit) (n = 3, ± SE). </ P>

Fotolytisk merking ved intakt protein nivå

Mb bestrålt i nærvær av 20 x overskudd pLeu dannet flere MB-pLeu addukter, som detektert ved LC-MS (figur 6A). Den deconvoluted spektra for MBT bestrålt i 40 minutter med 20x pLeu møtte opp til tre etiketter med tillegg av 115, 230 og 345 Da til massen av umerkede Mb. MBS bestrålt på samme måte med 20x pLeu viste mindre pLeu opptak på den intakte nivå, med opp til to merkede populasjoner oppdaget av LC-MS.

Figur 6
Figur 6: SSPL-MS for intakte Mb: (A) Deconvoluted massespektra for MBT (heltrukket linje) og MBS (stiplet linje) som er merket med 20x overskudd (5% w / w) pLeu. Deconvoluted massespektrum av nativt Mb (Mb lyofilisert og bestråles i fravær av pLeu) er vist som stiplet linje. U (B) SSPL-MS-kinetikk for intakte Mb i formuleringer MBT (lukkede sirkler) og MBS (åpne sirkler) som en funksjon av pLeu konsentrasjon. Alle prøver ble bestrålt i 40 min. Feilfelt er innenfor symboler. (C) SSPL-MS-kinetikk for intakte Mb i formuleringer MBT (lukkede sirkler) og MBS (åpne sirkler) og lyofilisert bestrålt i nærvær av 100 ganger overskudd av pLeu (20,7% vekt / vekt) som en funksjon av bestrålingstiden. Feilfelt er innenfor symboler.

I kinetiske studier, den prosent av merket protein økt eksponentielt for både MBT og MBs med økende bestråling tid (figur 6B). MBS viste mindre pLeu opptak enn MBT på hver bestråling tid. Begge formuleringer som syntes å nå et platå ved 40 min. Dermed kan en kinetisk studie være oss eful for å bestemme varigheten av bestrålingen er nødvendig for å oppnå fullstendig pLeu aktivering. Merkingskinetikk ble også studert som en funksjon av pLeu konsentrasjon (figur 6C). Det prosent av merket protein økt med pLeu konsentrasjon for både MBT og MBs. Men på 20,7% w / w pLeu, MBT viste en nedgang i pLeu opptak. Dette kan være på grunn av utelukkelse av pLeu fra overflaten av proteinet ved høy pLeu konsentrasjon. Derfor bør en undersøkelse med varierende konsentrasjon av pLeu bli utført for å velge den riktige pLeu konsentrasjon som gir mulighet for tilstrekkelig merking over protein overflaten uten utelukkelse overflate. I denne studien ble 20x overflødig pLeu valgt for ytterligere peptid-nivå studier.

Den samlede redusert merking observert for MBS antyder dårlig side-kjeden tilgjengelighet til matrisen som inneholder pLeu. Dette er konsistent med en konformasjonsendring i nærvær av sorbitol som resulterer i redusert merking.

innhold "> photolytic merking på peptid nivå

Basert på de intakte protein merking studier ble 20x overflødig pLeu valgt å sammenligne MBT og MBs på peptid nivå. Merkede prøver ble spaltet med trypsin og analysert ved hjelp av LC-MS. Totalt 40 peptider tilsvarende 100% av Mb sekvensen ble oppdaget for MBT og MBs prøver. I noen tilfeller kan tryptisk fordøyelse gi begrenset proteinsekvens dekning hvis Lys og / eller Arg-rester er tungt merket. For å forbedre sekvens dekning, kan en blanding av trypsin og chymotrypsin brukes til å fordøye det merkede protein.

Figur 7
Figur 7: SSPL-MS for Mb hos peptid-nivå: tegneserie representasjon av Mb merket med 20x overskudd pLeu (5% w / w) i nærvær av trehalose (A) og sorbitol (B). Det merkede protein ble oppsluttet med trypsin og merket peptider ble kartlagt på krystallstrukturen av Mb (PDB ID 1WLA). De merkede og umerkede områder er farget magenta og grønt, respektive.

SSPL-MS med trypsin fordøyelse gir kvalitativ informasjon om peptider bli stemplet. Gitt de forskjellige merkede populasjoner på intakt nivå, promiskuøse mekanismen for pLeu merking og forskjeller i effektivitet ionisering av merkede og umerkede peptider, er det vanskelig å oppnå kvantitative beregninger for SSPL-MS etter fordøyelse. Imidlertid, kan den kvalitative informasjon fremdeles gi innsikt i protein konformasjonelle forandringer på peptidet nivå. I denne studien, både MBT og MBS formuleringer viste pLeu opptak over det meste av proteinet overflaten. Sammenlignet med MBs, peptidfragmenter 32-42, 134-139 og 146-153 fra MBT viste pLeu merking (figur 7). Dette tyder på at de sidekjeder av disse aminosyrene er utsatt for pLeu, da spiralene i disse regions er intakte i MBT matrise. I kontrast, er beskyttelse mot pLeu merking i MBs matrise forenlig med strukturelle forstyrrelser i disse regionene.

Samlet viser resultatene fra ssHDX-MS og SSPL-MS viser at metodene kan gi komplementære med høy oppløsning peptid-nivå informasjon om ryggraden (ssHDX-MS) og sidekjede (SSPL-MS) eksponering og bindemiddel effekter i frysetørkede proteinformuleringer .

Discussion

Flere studier har antydet at det lokale miljøet i frysetørkede prøver påvirker proteinnedbrytingen 5,29,30. Imidlertid, å etablere en direkte sammenheng mellom proteinstruktur og stabilitet i fast tilstand ikke har vært mulig på grunn av mangel på høy oppløsning analytiske metoder. Anvendelsen av eksisterende høyoppløselige metoder som HDX og PL til frysetørkede pulver krever endring av løsnings protokoller og forsiktig tolking. HDX-MS og PL-MS har blitt suksessivt vedtatt å overvåke protein conformations i solid-state. Resultatene presenteres her og andre steder 27,28,31-33 har vist evne av disse metodene for å overvåke protein konformasjon med høy oppløsning i solid miljø. Selv om de kritiske trinn i dataanalyse ikke varierer fra merking i løsning 34-36, er viktige hensyn under eksperimentelle oppsettet og data tolkning nødvendig for solid-state kjemical merking.

Valg av merkingsreagens må være basert på størrelse og mekanismen for merking. Den lille størrelsen på deuterium tillater peptidryggraden til å bli analysert lett, mens den relativt store størrelsen av pLeu begrenser merking til sidekjeder. Både ssHDX og SSPL viser ingen preferanse for en hvilken som helst aminosyre, slik at merking bare avhenger av ryggraden, og sidekjedeeksponering til matriksen. Å effektivt sondere protein conformations i solid-state, må de eksterne faktorer som påvirker merkeprosessen kontrolleres nøye. Den totale mengde og den romlige fordelingen av merkemiddel i lyofiliserte faste stoffer er forskjellig fra vandige løsninger.

I ssHDX, kan mengden av D 2 O i den faste matriks påvirke graden av protein utfolding (eller delvis utfolding), refolding og deuterium-utveksling. Dette er ikke tilfelle med løsningen HDX, hvor proteinprøven blir vanligvis fortynnet med et stort volum av D 2 O.Nøye screening av effektene av hydrering på ssHDX hastigheten kan informere utvalget av ideelle RH forhold. For å kontrollere hastigheten av fuktighet sorpsjon og unngå kollaps av pulveret i formuleringer inneholdende hygroskopiske hjelpestoffer (for eksempel sukrose og trehalose), kan ssHDX utføres under kjølebetingelser (2-8 ° C). Vår tidligere studie på hydration effekter viste økt hastighet og grad av utveksling med økning i vanninnhold, som forventet. I store deler av vårt arbeid, en mellom RH på 43% ved 5 ° C har vist seg å være ideelt å skille formuleringer i en rimelig tid 24. Reaksjonen utføres vanligvis inntil et platå blir nådd. Dette sikrer at fuktighet absorpsjon og diffusjon til solid ikke kontrollere HDX rate. Bruk av små faste utvalgsstørrelser med pre-frysetørking volum på ≤2 ml bidrar også til å sikre at D 2 O damp absorpsjon er hovedsakelig fullført tidlig i utvekslingsperioden. Selv ssHDX-MS girkvantitativ informasjon om konformasjon av protein i solid-state, er det visse forhold der tolkning av data ikke kan være helt basert på ssHDX studien alene. Det er mulig at den reduserte deuterium opptak observert i en prøve (i forhold til kontroll) kan være på grunn av den høyere retensjon av proteinstrukturen eller den betydelige mengde av proteinaggregater som er tilstede i prøven. I et slikt tilfelle, tolkning av data ssHDX trenger resultater fra andre komplementære fremgangsmåter. Peak utvidelse i deuterert massespektra ble observert for flere Mb formuleringer 27,28. Dette kan være på grunn av forskjellige faktorer, som tilstedeværelsen av delvis ufoldet protein befolkningen, romlig heterogenitet i prøven, eller de romlige gradienter i D 2 O konsentrasjon. Men disse faktorene ikke skilt i ssHDX-MS og trenger videre etterforskning.

Som SSPL-MS er relativt ny i forhold til andre metoder, kontinuerlig læring abut dens anvendelser og begrensninger er nødvendig. I SSPL, blir den fototverrbinder lyofilisert med proteinet. Mangel på fuktighet begrenser mobiliteten av komponentene i den faste matriks, og den partielle strukturelle avslapning som kan forekomme med fuktighet sorpsjon i ssHDX er ikke et fenomen i SSPL. Dette begrenser merking i SSPL til umiddelbar nærhet av foto-cross-linker. Imidlertid, i motsetning til HDX-MS, MS / MS-analyse av det kovalent merket protein kan gi restnivå strukturell informasjon. Siden SSPL merking er kovalente og irreversible, tilbake utveksling ikke oppstår og prøver kan være forberedt og analysert uten bekymring for tap av etiketten. For å lette diffusjon av merkemiddel og forbedre merking effektivitet i faststoff-matrisen, kan SSPL utføres med økende% RH. pLeu opptak kan også forbedres ved å øke konsentrasjonen av fotoreaktivt middel. Det molare forhold av protein til pLeu kan varieres etter ønske. Generelt, en 100x molar overskudd av pLeu til protein vil sikre tilstrekkelig merking. Imidlertid kan høy konsentrasjon pLeu resultere i tap av proteintertiærstruktur i den faste matriks. Derfor, i tillegg til å merke kinetikk og formuleringssammensetning, valg av pLeu konsentrasjon må også være basert på å opprettholde strukturell integritet protein. Som pLeu ikke-selektivt etiketter XH (der X = C, N, O) gruppe, er det mulig at hjelpestoffer med lignende merke nettsteder i stor grad kan påvirke nivået av protein merking. Forstyrrelser av hjelpestoffene i tilgjengeligheten av pLeu for protein merking er ennå å bli karakterisert. Det er kjent at karben genereres fra diazirine aktivering ikke er rest-spesifikk, men en undersøkelse rapporterer forspenning mot Asp og Glu 36. Selv om det er godt å lære om rest-spesifikke vekselvirkninger, er peptid-nivå informasjon også nyttig og kan brukes til å utforme hjelpestoffer for å blokkere områder med stor matrise eksponering i fast tilstand. SSPL-MS gir detaljert kvalitativ informasjon, menkvantitative data må innhentes og robuste beregninger må utvikles for å analysere formulering forskjeller på tvers av en rekke frysetørrede systemer.

Bruken av en rest-spesifikt merket kombinert med MS / MS-analyse kan ytterligere øke oppløsningen til den amino-syrenivået. Merking reagenser som 2,3-butandion å merke Arg, kan N hydroksysuccinimid derivater for Lys og N -alkylmaleimide derivater for Cys brukes til nettopp å kartlegge molekylære interaksjoner i lyofilisert pulver. Men disse reagenser er pH-avhengig, og reaksjonene kan ikke være så godt kontrollert som fotolytisk merking i fast tilstand. En alternativ fremgangsmåte er å innlemme den fototverrbinder inn i proteinsekvensen med bruk av auxotrofe cellelinjer, seterettet mutagenese, eller sidekjede derivatisering.

Våre tidligere ssHDX-MS- og SSPL-MS-undersøkelser har vist at merking av proteiner er avhengig av arten og mengden av hjelpestoffenebrukt 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS av Mb co-lyofilisert med guanidinhydroklorid (Gdn.HCl) viste større deuterium opptak enn Mb co-lyofilisert med lav molekylvekt 32 sukkerarter. I en separat SSPL-MS studie, Mb co-frysetørket med Gdn.HCl viste større beskyttelse mot fotolytisk merking enn Mb med sukrose 33. Videre har kvantitative målinger fra ssHDX-MS vært høyt korrelert med stabiliteten av protein ved langtidslagring 28. Disse studiene tyder på at ssHDX eller SSPL protein reflekterer graden av strukturell retensjon av proteinet i lyofilisert pulver. Vi tror at retensjonen av sekundærstruktur i lyofiliserte pulvere gir gunstig miljø for sidekjede merking med pLeu og beskyttelse av amid hydrogen fra deuterium-utveksling. Imidlertid må detaljert sammenligning av informativt innhold av disse metodene for å bli utført i fremtiden. Selv etablere nytten av ssHDX-MS og SSPL-MSsom en formulering screening verktøy til slutt vil kreve at det brukes på mange proteiner, resultater fra våre nyere studier støtter sin bredere adopsjon. Med videreutvikling, er disse metoder forventet å være mye nyttig for å karakterisere faststoffproteinformuleringer i det biofarmasøytiske industrien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equine myoglobin Sigma-Aldrich M0630-5G
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma Aldrich #T9531
D-Sorbitol Sigma Aldrich #240850
L-Photo-leucine Thermo Scientific #22610
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich #P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich #P3786
Deuterium Oxide Cambridge Isotope Laboratories #DLM-4-PK Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilized pepsin Applied Biosystems #2-3132-00
Trypsin Promega #V511A Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used
Water, Optima LC/MS grade Fisher Chemical #7732-18-5
Acetonitrile Sigma-Aldrich #34998
Formic acid Thermo Scientific #28905
ESI-TOF Calibrant Agilent Technologies #G1969-85000 Highly flammable liquid
Protein microtrap Michrom Bioresources TR1/25108/03
Peptide microtrap Michrom Bioresources TR1/25109/02
Analytical column Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18
Freeze dryer VirTis AdVantage Plus
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps Stratagene Corp. Stratalinker 2400
HPLC Agilent Technologies 1200 series LC Refrigerated LC system for HDX-MS
ESI-qTOF MS Agilent Technologies 6520 qTOF
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) Sierra Analytics http://www.massspec.com/HDExaminer.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawrence, S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nat. Biotechnol. 25, (4), 380-382 (2007).
  2. Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. BCC Research. BIO021D (2013).
  3. Lai, M. C., Topp, E. M. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. J. Pharm. Sci. 88, (5), 489-500 (1999).
  4. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharm. Res. 14, (8), 969-975 (1997).
  5. Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).
  6. Wüthrich, K. Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 265, (36), 22059-22062 (1990).
  7. Ilari, A., Savino, C. Protein structure determination by x-ray crystallography. Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).
  8. Brunger, A. T. X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics. Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).
  9. Yu, L. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Adv Drug. Deliv. Rev. 48, (1), 27-42 (2001).
  10. Manning, M. C. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability. Expert. Rev. Proteomics. 2, (5), 731-743 (2005).
  11. Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies. J. Pharm. Sci. 100, (7), 2871-2875 (2011).
  12. Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy. J. Pharm. Sci. 94, (9), 2030-2038 (2005).
  13. Pikal, M. J., et al. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J. Pharm. Sci. 97, (12), 5106-5121 (2008).
  14. Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility. J. Pharm. Sci. 98, (9), 3145-3166 (2009).
  15. Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 65, (1), 1-9 (2007).
  16. Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein. Sci. 11, (6), 1300-1308 (2002).
  17. Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23, (5), 639-647 (2009).
  18. Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery. Chem. Soc. Rev. 41, (11), 4335-4355 (2012).
  19. Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteomics. 9, (8), 1716-1728 (2010).
  20. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100, (6), 2071-2086 (2011).
  21. Dorman, G., Prestwich, G. D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends. Biotechnol. 18, (2), 64-77 (2000).
  22. Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 3, (4), 399-408 (2006).
  23. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A, (1), 8 (1977).
  24. Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping. Mol. Pharm. 9, (4), 718-726 (2012).
  25. Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22, (8), 1472-1476 (2011).
  26. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic. Acids. Res. 31, (13), 3784-3788 (2003).
  27. Sophocleous, A. M., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics. Mol. Pharm. 9, (4), 727-733 (2012).
  28. Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS). Mol. Pharm. 11, (6), 1869-1879 (2014).
  29. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, (1-2), 1-60 (2000).
  30. Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying. J. Pharm. Sci. 88, (12), 1354-1361 (1999).
  31. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Anal. Biochem. 366, (1), 18-28 (2007).
  32. Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys. J. 95, (12), 5951-5961 (2008).
  33. Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders. Mol. Pharm. 10, (12), 4629-4639 (2013).
  34. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).
  35. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach. Anal. Chem. 81, (19), 7892-7899 (2009).
  36. Jumper, C. C., Schriemer, D. C. Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis. Anal. Chem. 83, (8), 2913-2920 (2011).
  37. Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Pharm. Res. 25, (2), 259-267 (2008).
  38. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids. Biotechnol. Bioeng. 97, (6), 1650-1653 (2007).
Massespektrometrisk Approaches å studere Proteinstruktur og interaksjoner i Lyofiliserte Pulver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).More

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter