Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Masspektrometrisk Approaches att studera protein struktur och interaktioner i frystorkad Pulver

doi: 10.3791/52503 Published: April 14, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Amid väte / deuterium utbyte (ssHDX-MS) och sidokedjan fotolytisk märkning (SSPL-MS) följt av masspektrometrisk analys kan vara värdefullt för att karakterisera frystorkade formuleringar av proteinläkemedel. Märkning följt av lämplig proteolytisk matsmältning gör proteinstrukturen och interaktioner som ska kartläggas med peptid-nivå upplösning. Eftersom proteinet strukturella element är stabiliserade av ett nätverk av kemiska bindningar från huvudkedjor och sidokedjor av aminosyror, specifik märkning av atomer i aminosyraresterna ger insikt i strukturen och konformationen av proteinet. I motsats till rutinmetoder används för att studera proteiner i frystorkade fasta ämnen (t.ex. FTIR), ssHDX-MS och SSPL-MS ger kvantitativa och platsspecifik information. Omfattningen av deuterium inkorporering och kinetiska parametrar kan relateras till snabbt och långsamt utbyta amid pooler (N snabb, N långsam) och reflekterar direkt på degree av proteinveckning och struktur i frystorkade formuleringar. Stabil fotolytisk märkning genomgår inte back-utbyte, en fördel över ssHDX-MS. Här ger vi detaljerade protokoll för både ssHDX-MS och SSPL-MS, med hjälp av myoglobin (Mb) som modell protein i frystorkade formuleringar innehållande antingen trehalos eller sorbitol.

Introduction

Proteinläkemedel är den snabbast växande sektorn i den biofarmaceutiska industrin och erbjuder lovande nya behandlingar för tidigare svåra sjukdomar, däribland hormonella störningar, cancer och autoimmuna sjukdomar 1. År 2012, den globala proteinläkemedel marknaden nådde $ 138.000.000.000 och förväntas nå $ 179.000.000.000 fram till år 2018 2. Proteiner är större och mer ömtålig än konventionella småmolekylära läkemedel och så är mer mottagliga för många typer av nedbrytning 3. För att säkerställa en tillräcklig hållbarhet och stabilitet, är proteinläkemedel ofta formuleras som frystorkat (dvs, frystorkade) fasta pulver. Dock kan ett protein fortfarande genomgår nedbrytning i fast tillstånd, särskilt om dess naturliga struktur inte bevaras under lyofiliseringsförfarandet 4,5. Säkerställa att strukturen har behållits är genomförbart endast om det finns analysmetoder som kan sondera proteinkonforma i solid-state med sufficient upplösning.

NMR-spektroskopi 6 och röntgenkristallografi 7 är de vanligen använda högupplösta metoder för att bedöma proteinstruktur i lösning och kristallina fastämnen 8. På grund av arten av hjälpämnen och de bearbetningsmetoder som används, frystorkade proteinformuleringar är vanligtvis amorfa snarare än kristallint 9. Bristen på homogenitet och mikroskopisk ordning gör de ovan nämnda teknikerna opraktiskt för proteiner i amorfa fasta ämnen. FTIR (FTIR) 10, Ramanspektroskopi 11 och nära infraröd spektroskopi (NIR) 12 har regelbundet används av biofarmaceutiska industrin att jämföra protein sekundär struktur i frystorkade pulver med den för det nativa lösningen-statsstruktur. Men dessa metoder är låg upplösning och kan bara ge information om globala förändringar i sekundärstruktur. Solid-state strukturell karakterisering med hjälp FTIRhar visat antingen svaga 13,14 eller dålig 15 korrelation med långtidslagringsstabilitet. Dessa begränsningar belyser behovet av lämpliga högupplösta metoder för att identifiera protein strukturella störningar i fast tillstånd.

Kemisk märkning i kombination med proteolys och masspektrometrisk analys har vuxit fram som en kraftfull metod för att övervaka proteinstruktur och molekylära interaktioner i vattenlösning. I läkemedelsutveckling, har HDX-MS använts epitopkartläggning i antigen-antikroppsinteraktioner 16,17, för att kart receptor-läkemedelsinteraktioner 18, för att övervaka effekterna av posttranslationella modifieringar på konforma av proteinläkemedel 19, och att jämföra sats till sats variationer i utvecklingen biosimilars 20. Likaså har fotoaktiverbara ligander använts för att identifiera mål för läkemedel och för att bestämma bindningsaffinitet och specificitet av narkotikareceptorinteraktioner 21,22. Till eXtend tillämpningen av dessa metoder till frystorkade formuleringar, har vår grupp utvecklat solid-state väte deuterium utbyte masspektrometri (ssHDX-MS) och solid-state fotolytisk märkning masspektrometri (SSPL-MS) för att studera proteinkonformationer och excipientpartiklarna interaktioner i frystorkade prover med hög upplösning.

I både ssHDX-MS och Sspl-MS proteinet märkt under ideala reaktionsbetingelser i lyofiliserade fasta substanser, och proverna rekonstituerades därefter och analyserades genom masspektrometri med eller utan proteolytisk spjälkning. ssHDX-MS ger information om huvudkedjan exponering för deuterium ånga, medan SSPL-MS ger information om miljön i sidokedjor (Figur 1). De två metoderna därmed kan ge kompletterande information om proteinkonforma i fast tillstånd. Här ger vi en allmän protokoll för att studera proteiner i frystorkade partiklar med ssHDX-MS och SSPL-MS (Figur 2), med hjälp av Mb somen modellprotein. Vi visar förmågan hos de två metoderna för att särskilja skillnader i formuleringar med två olika excipienter.

Figur 1
Figur 1:. SsHDX och Sspl åtgärd proteinstruktur i lyofiliserade fasta substanser genom olika system för märkning (A) På HDX, väten ryggraden amid utbyte med deuterium som en funktion av proteinstruktur och D2O tillgänglighet. I fast tillstånd, hastigheten och omfattningen av deuterium utbyte beror på graden av D 2 O sorption, protein rörlighet (utspelas och återveck händelser) och arten av hjälpämnena som finns i den fasta matrisen. (B) På PL, UV-bestrålning vid 365 nm initierar bildandet av en reaktiv karben intermediär från diazirine funktionella gruppen hos pLeu och införes ospecifikt i någon XH bindning (X = vilken atom), eller added över en C = C-bindning i dess omedelbara närhet. I fast tillstånd, är hastigheten och graden av märkning beror på den lokala koncentrationen av märkningsmedlet, bestrålningstiden, proteiners struktur och typen av hjälpämnen som föreligger i den fasta matrisen. Paneler A och B visar den maximala teoretiska märkning som kan uppstå på ryggraden och sidokedjor respektive protein.

Figur 2
Figur 2: Schematisk visning solid-state HDX-MS (A) och PL-MS (B) för protein i lyofiliserad formulering.

Protocol

1. Provberedning och Frystorkning

  1. Dialysera erforderlig volym Mb stamlösning mot en lämplig buffert och filtrering genom ett 0,22 | im sterilt filter.
  2. Bered erforderlig volym hjälpämnen och foto-leucin (L-2-amino-4,4-azi-pentansyra; pLeu) förrådslösningar i lämplig buffert. Filtrera aktie lösningar genom ett 0,22 ìm sterilt filter.
  3. Förbered formuleringar såsom visas i tabell 1 med användning av stamlösningar av protein, hjälpämnen, pLeu, och buffert.
  4. Filterprov genom ett 0,22 ìm sterilt filter för att avlägsna eventuella partiklar som bildas vid steg 1.3. Fyll proverna separat som 0,2 ml i 2 ml glasflaskor. Använd glasflaskor som är transparenta för UV (365 nm) ljus för att aktivera pLeu i SSPL-MS studier.
  5. Lastflaskor i en lyofilisator och initiera frystorkning genom att utforma en lämplig lyofiliseringscykel.
    1. Här, frysa proverna vid -40 ° C, följtgenom primär torkning under vakuum (70 mTorr) vid -35 ° C under 12 h och sekundär torkning vid 25 ° C under 12 h. Andra lyofiliseringsmetoder cykler och torkningsmetoder (t.ex. spraytorkning) kan också användas.
  6. Återfyllning av flaskor innehållande frystorkade prover med kväve före begränsning.
Formuleringar Komposition (mg / ml) före lyofilisering
Mb Trehalos Sorbitol pLeu c Kalium, Fosfat, pH 7,4
MBT en 1,7 3,4 - - 0,4
Mbs en 1,7 - 3,4 - 0,4
MBT + pLeu B 1,7 3,4 - 14,3 x 10 -3 till 1,43 0,4
Mbs + pLeu B 1,7 - 3,4 14,3 x 10 -3 till 1,43 0,4

Tabell 1:... Sammansättning av lyofiliserade Mb beredningar A Formuleringar som används för ssHDX-MS Studie B Formuleringar som används för Sspl-MS studie c L-2-amino-4,4-azipentanoic syra eller foto-leucin (pLeu). pLeu vid fem olika koncentrationer (14,3 x 10 -3 till 1,43 mg / ml) som motsvarar till 1x, 10x, 20x, 50x och 100x molärt överskott relativt Mb var sam-lyofiliserades med MBT och Mbs formuleringar.

2. ssHDX-MS för intakt protein

  1. Lägg till en mättande mängd (~ 440 g) av K 2 CO 3-200 ml D2O previously placerade i det nedre utrymmet av en exsickator. Täta exsickatorn lufttät och låt det utjämna vid 5 ° C tills en stabil relativ fuktighet (RH) av ~ 43% uppnås. Andra RH-värden av intresse kan erhållas genom att välja olika mättade saltlösningar 23,24.
  2. Initiera ssHDX reaktioner genom att placera uncapped flaskor innehållande frystorkade proteinet i det övre facket i exsickator. Täta exsickatorn lufttät och inkubera vid 5 ° C för att låta HDX inträffa (Figur 2A).
  3. Samla ssHDX prover vid olika tidpunkter i tre exemplar. För Mb formuleringar, samla in prover på nio tidpunkter 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 och 144 tim.
  4. Cap flaskorna omedelbart efter dra sig ur exsickator och släcka reaktionerna efter blixt frysning ampullerna i flytande kväve. Förvara flaskor vid -80 ° C tills masspektrometrisk analys.
  5. Analysera prover med en lämplig hög upplösning vätskekromatografi-mass Spectrometry (LC-MS) -metoden. Design eller köpa en lämplig kyld LC system för att minimera back-utbyte under provanalys. Använd installations av kolonnen kylaggregat och LC-MS-metoden tidigare rapporterats 25.
    OBS: Eftersom hastigheten för amidprotonen utbyte beror på pH och temperatur, kan deuteroner införlivas i proteinet utbyta med väte närvarande i den mobila fasen ("back utbyte"), vilket orsakar en förlust av information. Fastän ett surt pH (pH 2,5) av dämpning buffert och HPLC lösningsmedel kan minimera mott-utbyte i stor utsträckning, vilket minskar temperaturen (≤0 ° C) med hjälp av en lämplig kolonn kylsystem kan ytterligare skydda proteinet från back-utbyte .
  6. Anslut provslingan och protein fälla för den ventil som automatiskt styr avsaltning och eluering processen. Kalibrera masspektrometer genom att injicera en TOF låg koncentration tuning blandning i masspektrometern i m / z-intervallet 200-3,200. Den immobiliseradepepsin kolonnen och analyskolonn krävs inte för intakt proteinanalys.
  7. Ställ in temperaturen i det kylda systemet att ≤0 ° C och vänta på systemet att uppnå en stabil driftstemperatur av ~ 0 ° C.
  8. Snabbt överföra proverna från -80 ° C i flytande kväve för masspektrometrisk analys. Använd pincett, försiktigt dra tillbaka varje flaska från flytande kväve och rekonstruera provet genom att lägga till en viss volym av iskall släcknings buffert innehållande 0,2% myrsyra (FA) (pH 2,5) och 5% metanol i vatten till flaskan.
  9. Programmera en lämplig HPLC och masspektrometri-metoden med hjälp av kontrollmjukvaran. För Mb formuleringar, avsalta prov innehållande 20 pmol Mb i protein fälla under 1,7 min med 5% acetonitril, 95% vatten och 0,1% myrsyra (FA), och elueras med användning av en gradient ökade till 80% acetonitril, 20% vatten och 0,1 % FA i 3,3 minuter. Samla masspektra över m / z intervall 200-3,200.
  10. För att bestämma massan av intaktprotein, samla in data för en undeuterated prov protein (dvs proteinet inte utsätts för ssHDX) i vattenlösning med hjälp av metoden i steg 2.9.
  11. Skaffa massorna av undeuterated och deutererade prover genom deconvoluting rå spektra med hjälp av data analysprogram. Här ställer den massområde till 15,000-18,000 Da, massupplösningen till 1,0 Da, och topphöjden till 90% för att beräkna massan av Mb.
  12. Beräkna antalet deuteroner införlivats i det intakta proteinet (här, Mb) genom att subtrahera massan av undeuterated protein från massan av deutererad protein vid varje utbyte tidpunkt.
  13. Beräkna procenten deuterium upptag i förhållande till den teoretiskt maximala med användning av följande ekvation (ekvation 1)
    Ekvation 1
    där totalt antal utbytbara amider = totala antalet aminosyror - antal prolinrester - 2 ("2" står för den N-terminal aminogrupp och amid väte som genomgår en snabb back-växel).
  14. Montera ssHDX kinetiska data med hjälp av en lämplig exponentiell ekvation. En biexponentiell ekvation (ekvation 2) är oftast den enklaste som ger en rimlig passning till ssHDX uppgifterna. I denna studie, för MBT och MBS, passar data till en biexponentiell modell som tilldelar deuteroner att "snabbt" och "slow" utbyta pooler.
    Ekvation 2
    där N snabb och N långsam är antalet utbytbara amider i "snabba" och "långsamma" utbyta pooler, respektive, och k snabba och k långsam är de första ordningens hastighetskonstanter som är förknippade med de två poolerna.

3. ssHDX-MS för protein på Peptide Nivå

  1. Utför ssHDX genom att följa stegen 2,1-2,8, med följande ändringar i steg 2.6. Anslut den immobiliserade pepsin colUMN och analytiska kolonnen till ventilen som tidigare rapporterats 25 och ersätta det protein fällan ansluten till ventilen med en peptid fälla. Kalibrera masspektrometern genom inställning av massa till laddningsförhållande som sträcker sig från 100 till 1700.
    OBS: Under rekonstitution steget (steg 2,8), kan ett reduktionsmedel och denaturerande medel ingå i släckningsbuffert för att underlätta pepsinspjälkning av proteiner med disulfidbindningar (t.ex. monoklonala antikroppar).
  2. Programmera ett lämpligt HPLC och masspektrometri-metoden med hjälp av kontrollmjukvaran. För Mb formuleringar, smälta prover innehållande 20 pmol Mb online med 0,1% FA, trap och avsalta peptider för 1,7 min med 10% acetonitril, 90% vatten och 0,1% FA i ett peptidfälla. Eluera fragmenten på den analytiska kolonnen med en gradient ökning till 60% acetonitril, 40% vatten och 0,1% FA i 4,0 minuter. Förvärva masspektra över m / z intervall 100-1,700.
  3. Identifiera de peptiska fragmenten genom MS / MS-analys av enundeuterated proteinprov. Använd mass programvara spektrometri för att jämföra experimentella massor peptidfragmentjoner till de förväntade massorna av peptidfragment i en egen databas. Ställ en mass brytpunkt (t.ex. 10 ppm) för att identifiera massorna med låg fel. För peptider matchas, förbereda en förteckning bestående av (i) peptidsekvens, (ii) laddningstillstånd, och (iii) retentionstid.
  4. Använd listan som genereras i steg 3.3 att kartlägga och fastställa den genomsnittliga antalet deuteroner ingår för varje pepsin smälta fragment. Detta kan uppnås genom användning av lämpliga HDX-MS-data analysprogram 24.
  5. För att beräkna procent deuterium upptag och att passa ssHDX kinetiska data för varje peptiska fragment, följ steg 2.13 och 2.14. I denna studie, HDX kinetiska data för var och en av sex ickeredundant pepsin smälta fragmenten från MBT och MBS formuleringar anpassades till en biexponentiell föreningsmodell (ekvation 2).

4. SSPL-MS för Intakt ProTein

  1. För att börja fotolytiska märkningsreaktionen, första brytare på UV tvärbind och låta lamporna att värma upp i 5 min. Se till UV-källan är utrustad med lampor våglängden 365 nm för att aktivera diazirine grupp pLeu.
    VARNING: Öppna aldrig dörren till UV tvärbindare när lamporna är tända. Skydda ögon och hud från exponering för UV-ljus om källan inte är omsluten av en UV-skyddande glasdörr.
  2. Stäng av UV tvärbind innan luckan öppnas. När lamporna är avstängda, fixed ampullerna innehåller frystorkade formuleringen och placera dem inuti UV tvärbindkammaren som visas i figur 2B. Bestråla proverna med UV-ljus under 40 min.
  3. Utför kontrollexperiment genom att följa steg 4.1 till 4.3 för (i) Prover lyofiliserades utan pLeu och (ii) prov lyofiliserade med pLeu rekonstituerade i vatten.
  4. Cap och förvara rören vid -20 ° C tills masspektrometrisk analys.
  5. ReconstitUte de fasta prover genom att lägga en lämplig volym av masspektrometri kvalitet destillerat vatten så att koncentrationen till 2 ^ M.
  6. Till att börja provanalys, följ steg 2.6 och 2.9.
    OBS: Eftersom back-utbyte är inte ett problem med kovalent märkning innebär SSPL-MS inte kräver en särskild kyld LC-systemet.
  7. För att bestämma den nativa massan av proteinet, samla in data för ett proteinprov som inte har utsatts för SSPL genom att följa steg 2,9. Skaffa massor av omärkta och märkta prover genom deconvoluting rå spektra som förklaras i steg 2.11.
  8. Beräkna antalet pLeu införas med hjälp av följande formel:
    Ekvation 3
    där M L är massan av märkt protein, är M N massan av nativt protein och 115 är den genomsnittliga vikten (Da) sattes till nativt protein efter enstaka pLeu inkorporering. Observera att märkningen reaktionen sker med the förlust av N2 (28 Da). Den monoisotopisk massa pLeu är 143,07.
  9. Beräkna andelen protein populationer med olika antal etiketter med topphöjder från de extraherade jon kromatogram.
    Ekvation 4
    där "i" betecknar antalet etiketter, PH i betecknar topphöjden för märkt protein L i och PH u betecknar topphöjden av omärkta proteinet som observerats av masspektrometri.

5. SSPL-MS för Protein vid peptidnivå

  1. Utför SSPL genom att följa stegen 4.1 och 4.4.
  2. För peptidnivå analys, rekonstruera fasta prover i ammoniumbikarbonatbuffert (100 mM, pH 8,0).
  3. Efter beredning, blanda det märkta proteinlösningen med trypsin vid 10: 1 molärt förhållande av protein till trypsin och inkubera vid 60 ° C under 16 h.
  4. Släck reaktionen genom att tillsätta 0,1% FAi vatten till provet för att ge slutlig koncentration till 2 uM protein.
  5. Anslut provslingan, peptid fälla och analytisk kolonn till ventilen kopplad till HPLC-systemet.
  6. Programmera en lämplig HPLC och masspektrometri-metoden med hjälp av kontrollmjukvaran. För Mb formuleringar, injicera 20 pmol av den digererade proteinet in i provslingan, och avsalta peptiderna i ett peptid fälla för 1,5 min med 5% acetonitril, 95% vatten och 0,1% FA, följt av en eluering i den analytiska kolonnen med en gradient öka till 55% acetonitril, 45% vatten och 0,1% FA i 22 min. Samla masspektra över m / z intervall 100-1,700.
  7. Förbered en teoretisk masslista för peptid-pLeu addukter använder ett online-verktyg som ExPASy 26 med antalet pLeu tidigare beräknade från den intakta proteinanalys. Inkludera minst 4 missade klyftor. Notera att märkningsreaktionen sker med förlusten av N2. Därför massan av peptid-pLeu addukt = massan av omärkt försökptic peptid + n (massa pLeu) - n (massa N2), där "n" är antalet pLeu införlivas.
    OBS: Om massanalys av intakt protein visade upp till tre märkta populationer av protein, överväga upp till tre möjliga pLeu etiketter per peptid. För en peptid med massa av 1000 Da, skulle den teoretiska massan av peptid-pLeu addukt med en pLeu inkorporering vara 1000 + 1 (143) - 1 (28) = 1115 Da. Likaså de teoretiska massorna av peptid-pLeu addukter med 2 pLeu, 3 pLeu, etc. skulle vara 1.230 Da, 1345 Da, etc., respektive.
  8. Använd mass programvara analys för att matcha den teoretiska massan lista genereras i steg 5.7 med massorna observerade experimentellt. Ställ en mass cut-off (t.ex. 50 ppm) för att identifiera massorna med låg fel.
  9. För peptider matchas, bestämma det faktiska antalet pLeu införlivas med användning av formeln i steg 4,8 (ekvation 3), där M L och M N är massorna av märktoch nativa peptiden, respektive.

Representative Results

Här, ssHDX-MS och SSPL-MS har använts för att studera effekten av hjälpämnen på konforma och solid-state interaktioner av frystorkade Mb formationer. Koncentrationerna av protein och hjälpämnen som används i denna studie ges i tabell 1. Representativa resultat från ssHDX-MS och Sspl-MS-analys av lyofiliserade Mb som erhålls genom att följa ovanstående protokoll presenteras.

Deuterium upptagning vid intakt proteinnivå

ssHDX-MS kan skilja mellan Mb formuleringar på intakt nivå. Den deconvoluted masspektra för intakta Mb följande 144 h av ssHDX från formulerings MBS visade större deuterium upptag än formulering MBT (figur 3A). I genomsnitt, MBS visade 46% högre deuterium upptag än MBT (tabell 2).

Figur 3 Figur 3: ssHDX-MS för intakta Mb: (A) deconvoluted masspektra av deutererade intakta Mb från formuleringar MBT (heldragen linje) och MBS (streckad linje) efter 144 timmar i ssHDX. Den deconvoluted mass spektrum av undeuterated intakta Mb visas också (streckad linje). (B) ssHDX kinetik för intakta Mb i formuleringar MBT (heldragen linje) och MBS (streckad linje). Tidsförloppet av ssHDX anpassades till en ekvation för två fas exponentiell sammanslutning använder Graph Pad Prism version 5 (n = 3, ± SD).

De deuterering kinetik för intakta MBS och MBT liknar vid tidiga tidpunkter (1-4 tim), men MBS visade ökad deuterium utbyte med ökad tid (8-144 tim) (Figur 3B). Detta antyder vikten av att välja längre tidspunkter för ssHDX vid lägre RH och temperaturförhållanden. Dessutom kan D2O sorption och diffusionsprocess påverka hastigheten av ssHDX vid tidig tid points. Våra tidigare studier har visat att fukt sorption i ssHDX är komplett i en period av timmar, och har minimal bidrag att utbyta kinetik efter denna tid. Den observerade hastigheten och omfattningen av utbytet är därför inte bara åtgärder för D 2 O adsorption 27,28. De små felstaplar i figur 3B, vilket tyder på standardavvikelser från tre oberoende ssHDX-MS prover, visar att försöket är mycket reproducerbar.

Deuterium Upptag (%) b N snabb c k snabb c N långsam c k långsam c
MBT en 15,9 ± 0,5 13,1 (0,8) 0,43 (0,03) 11,0 (0,9) 0.019 (0,001)
Mbs en 23,2 ± 0,5 15,4 (0,7) 0,49 (0,04) 19,2 (0,6) 0,024 (0,002)
% Förändring d 46% 18% 14% 75% 26%

Tabell 2:. Kvantitativa mått på deuterium upptag i ssHDX studier av Mb formuleringar en Se Tabell 1 för sammansättning b Procent deuterium upptag relativt teoretiskt maximala av intakta Mb efter 144 timmar av HDX vid 5 ° C, 43% RH (n = 3. , medelvärde ± SD). c Parametrar som bestäms av icke-linjär regression av ssHDX-MS kinetiska data. Tid under deuterium utbyte mot intakt Mb var utrustad med en biexponentiell föreningsmodell (ekvation. 2). Värden inom parentes är standardfel av regressionsparametrarna. Ð procent förändring i mätningarna var calculrerad som 100 x [(värde från MBS - värde från MBT) / (värde från MBT)].

Regressionsparametrarna (N snabbt, N långsam, k snabbt och k långsam) för deuterium upptags kinetik för MBT och MBS ges i tabell 2. Även om N snabba och N långsamma värden är större för MBS än MBT, skillnader i N långsam värdena var större än skillnaderna i de N snabba värderingar. Specifikt är den N snabb värdet endast 18% större i MBS än i MBT, medan den N långsam värdet är 75% större i MBS än i MBT. Detta tyder på att de mindre N långsamma värden i MBT kan bero på den högre retention av Mb struktur eller skydd av amidgrupperna av hjälpämnen som är utsatta för D 2 O i MB. Men de detaljerade mekanismerna inte klart. Hastighetskonstant (K snabbt och k långsam) för båda formuleringarna är mycket lika.

Deuterium upptag på peptidnivå

Efter pepsindigestion ades totalt 52 peptider identifieras. Sex icke-redundanta fragment motsvarande 100% av den Mb sekvensen användes för analysen redovisas här. Ytterligare information kan erhållas genom att använda överlappande fragment, som rapporterats av vår grupp tidigare 24. Procenten deuterium upptaget för varje peptid beräknades och resultaten från 144 hr prover plottades (figur 4A). HDX kinetik för de sex peptiska fragmenten visade biexponentiell beteende (Figur 4B), i överensstämmelse med subpopulationer av amid väten genomgår "snabbt" och "långsam" utbyte.

Figur 4
Figur 4: ssHDX-MS för Mb på peptidnivå: (A) Procent deuterium upptag för sex icke-redundant peptiska fragment från Mb i formuleringar MBT (grå) och MBS (vit) efter 144 timmar i HDX. (B) ssHDX kinetik för sex icke-redundanta peptiska fragmenten från Mb i formuleringar MBT (heldragen linje) och MBS (streckad linje). Tidsförloppet av ssHDX anpassades till en ekvation för två fas exponentiell sammanslutning använder Graph Pad Prism version 5 (n = 3, ± SD).

Regressionsparametrar för de nonredundant peptiderna presenteras i figur 5. Som de inpassade hastighetskonstanterna för peptidfragment inte är den genomsnittliga hastighetskonstanten för enskilda amider, de observerade hastighetskonstanterna för peptiska fragmenten kan inte vara linjärt relaterad till de för det intakta proteinet. De N snabba värden för de flesta av de peptiska fragmenten (utom fragment 56-69) i formuleringar MBS var något större än de i MBT (Figur 5A). Likaså de k snabba värdena visade generellt liten skillnad mellan formulations och i olika regioner i Mb-molekylen (figur 5B). Men de N långsamma och k långsamma värden för MBS är betydligt större i alla fragment än för MBT (Figur 5C och 5D). Den stora ökningen i N långsamt och k långsam för MBS kan återspegla ökad rörlighet för amidgrupperna i "slow" utbyta pooler.

Figur 5
Figur 5: ssHDX kinetiska parametrar för Mb peptiska peptider: N snabbt (A), k snabb (B), N långsam (C) och k långsam (D) värden som erhållits från icke-linjär regression av ssHDX-MS kinetiska data för sex icke-redundanta peptiska peptider från Mb i formuleringar MBT (grå) och MBS ( vit) (n = 3, ± SE). </ P>

Fotolytisk märkning på intakt proteinnivå

Mb bestrålas i närvaro av 20x överskott pLeu bildade multipla MB-pLeu addukter, såsom detekteras genom LC-MS (figur 6A). Den deconvoluted spektra för MBT bestrålas under 40 min med 20x pLeu visade upp till 3 etiketter med tillägg av 115, 230 och 345 Da till massan av omärkta Mb. Mbs bestrålas på liknande sätt med 20x pLeu uppvisade mindre pLeu upptagning vid den intakta nivå, med upp till två märkta populationer detekterade av LC-MS.

Figur 6
Figur 6: Sspl-MS för intakta Mb: (A) deconvoluted masspektra för MBT (heldragen linje) och MBS (streckad linje) märkta med 20x överskott (5% vikt / vikt) pLeu. Deconvoluted masspektrum av nativt Mb (Mb lyofiliseras och bestrålas i frånvaro av pLeu) visas som den streckade linjen. U (B) Sspl-MS kinetik för intakta Mb i formuleringar MBT (fyllda cirklar) och MBS (ofyllda cirklar) som en funktion av pLeu koncentration. Alla prover bestrålades under 40 min. Felstaplar är inom symbolerna. (C) Sspl-MS kinetik för intakta Mb i formuleringar MBT (fyllda cirklar) och MBS (ofyllda cirklar) lyofiliseras och bestrålas i närvaro av 100x överskott pLeu (20,7% vikt / vikt) som en funktion av bestrålningstid. Felstaplar är inom symbolerna.

I kinetiska studier, ökade procent märkta proteinet exponentiellt för både MBT och MBS med ökande bestrålningstid (figur 6B). Mbs visade mindre pLeu upptag än MBT vid varje bestrålningstid. Båda formuleringarna verkade nå en platå vid 40 min. Således kan en kinetisk studie vara oss eful att bestämma längden på bestrålning som behövs för att få fullständig pLeu aktivering. Märkning kinetik studerades också som en funktion av pLeu koncentration (figur 6C). Den procent av märkt protein ökade med pLeu koncentration för både MBT och MBS. Emellertid, vid 20,7% vikt / vikt pLeu, MBT visade en minskning i pLeu upptag. Detta kan bero på uteslutning av pLeu från ytan av proteinet vid höga pLeu koncentration. Därför bör utföras en studie med varierande koncentration av pLeu att välja lämpligt pLeu koncentration som möjliggör tillräcklig märkning över proteinytan utan ytan utanförskap. I denna studie var 20x överskott pLeu ut för vidare studier peptid-nivå.

Den totala minskade märkning observerats för MBS antyder dålig sidokedja tillgänglighet till matrisen innehåller pLeu. Detta stämmer överens med en konformationsförändring i närvaro av sorbitol som resulterar i minskad märkning.

innehåll "> fotolytisk märkning på peptidnivå

Baserat på de intakta proteinmärkningsstudier 20x överskott pLeu valt att jämföra MBT och MBS på peptidnivå. Märkta prover digererades med trypsin och analyserades genom LC-MS. Totalt 40 peptider motsvarande 100% av den Mb sekvensen detekterades för MBT och Mbs prover. I vissa fall kan tryptisk matsmältning ger begränsad proteinsekvenstäckning om Lys och / eller Arg-rester är kraftigt märkta. För att förbättra sekvenstäckning, kan en blandning av trypsin och kymotrypsin användas för att smälta det märkta proteinet.

Figur 7
Figur 7: Sspl-MS för Mb på peptidnivå: tecknad representation av Mb märkt med 20x överskott pLeu (5% vikt / vikt) i närvaro av trehalos (A) och sorbitol (B). Det märkta proteinet klövs med trypsin och märkta peptider kartlades vidare till kristallstruktur Mb (PDB ID 1WLA). De märkta och omärkta regioner är färgade magenta och grönt, respektive.

SSPL-MS med trypsin matsmältning ger kvalitativ information om peptiderna blir märkta. Med tanke på de olika märkta populationer vid intakta nivå, är det den promiskuösa mekanismen för pLeu märkning och skillnader i jonisering effektivitet på märkta och omärkta peptider svårt att få kvantitativa mätetal för SSPL-MS efter matsmältningen. Emellertid kan kvalitativ information fortfarande ge insikt i proteinkonformationsförändringar på peptidnivå. I denna studie, både MBT och MBS formuleringar visade pLeu upptag i större delen av proteinytan. Vid jämförelse med MB, peptidfragment 32-42, 134-139 och 146-153 från MBT visade pLeu märkning (Figur 7). Detta tyder på att sidokedjorna hos dessa aminosyror exponeras för pLeu, såsom spiralerna i dessa regions är intakta i MBT matrisen. Däremot är skydd mot pLeu märkning i MBS matrisen förenlig med strukturella störningar i dessa regioner.

Sammantaget visar resultaten från ssHDX-MS och SSPL-MS tyder på att metoderna kan ge kompletterande information högupplösta peptid-nivå om ryggraden (ssHDX-MS) och sidokedja (SSPL-MS) exponering och hjälpämneseffekter i frystorkade proteinformuleringar .

Discussion

Flera studier har antytt att den lokala miljön i frystorkade prover påverkar proteinnedbrytning 5,29,30. Att fastställa ett direkt samband mellan proteinstruktur och stabilitet i det fasta tillståndet har inte varit möjligt på grund av bristen på högupplösta analysmetoder. Tillämpningen av befintliga högupplösta metoder såsom HDX och PL till frystorkade pulver kräver modifiering av lösnings protokoll och noggrann tolkning av data. HDX-MS och PL-MS har successivt antagit att övervaka proteinkonformationer i fast tillstånd. Resultaten som presenteras här och på andra håll 27,28,31-33 ha visat förmåga av dessa metoder för att övervaka proteinkonforma med hög upplösning i den fasta miljön. Även de kritiska stegen i dataanalys inte varierar från märkning i lösning 34-36, är viktiga överväganden under experimentuppställning och tolkning av data som krävs för halvledar mekanocal märkning.

Val av märkningsreagens måste baseras på storlek och mekanismen för märkning. Den lilla storleken på deuterium tillåter peptid ryggraden som ska sonderas lätt, medan den relativt större storlek pLeu begränsar märkning till sidokedjorna. Både ssHDX och Sspl visar ingen preferens för någon aminosyra, så att märkningen endast beroende ryggrad och sidokedja exponering till matrisen. För att effektivt söka proteinkonformationer i solid-state, måste de externa faktorer som påverkar märkningsprocessen kontrolleras noggrant. Det totala beloppet och den geografiska fördelningen av märkningsmedel i frystorkade fasta skiljer sig från vattenlösningar.

I ssHDX, kan mängden D 2 O i den fasta matrisen påverkar graden av protein utspelas (eller partiell utspelas), återveck och deuterium utbyte. Detta är inte fallet med lösning HDX, i vilken proteinprovet normalt utspädes med en riklig volym av D 2 O.Noggrann genomgång av effekterna av hydrering på ssHDX hastigheten kan informera urval av ideala RH villkor. För att kontrollera hastigheten för fukt sorption och undvika kollaps av pulvret i formuleringar innehållande hygroskopiska konstituenser (t.ex. sackaros och trehalos), kan ssHDX utföras under kylda betingelser (2-8 ° C). Vår tidigare studie om hydrering effekter visade ökad hastighet och omfattning utbyte med ökad fukthalt, som förväntat. I mycket av vårt arbete, en mellan RH på 43% vid 5 ° C har visat sig vara idealisk för att skilja formuleringar i rimlig tid 24. Reaktionen utförs vanligtvis tills en platå uppnåtts. Detta säkerställer att fukt sorption och diffusion i den fasta inte styra HDX hastigheten. Användningen av små storlekar fasta prov med pre-frystorkning volym ≤2 ml bidrar också till att säkerställa att D 2 O ånga sorption är i huvudsak klar tidigt i utbytesperioden. Även ssHDX-MS gerkvantitativ information om konforma av protein i solid-state, det finns vissa förutsättningar där tolkning av data inte kan helt baserat på ssHDX studien ensam. Det är möjligt att den minskade deuterium upptag observerades i ett prov (jämfört med kontroll) kan bero på den högre retention av proteinstruktur eller den betydande mängden av proteinaggregat som finns i provet. I ett sådant fall, tolkning av ssHDX data kräver resultat från andra kompletterande metoder. Toppbreddning i deutererad masspektra observerades för flera Mb formuleringar 27,28. Detta kan bero på olika faktorer som närvaron av partiellt utvikta proteinpopulationen, rumslig heterogenitet i provet, eller de spatiala gradienterna i D 2 O koncentration. Men dessa faktorer inte särskiljas i ssHDX-MS och behöver utredas ytterligare.

Som SSPL-MS är relativt ny i jämförelse med andra metoder, kontinuerligt lärande absina tillämpningar och begränsningar krävs. I SSPL är fototvärbindningsfrystorkas med proteinet. Bristen på fukt begränsar rörligheten av komponenter inom den fasta matrisen, och den partiella strukturella avkoppling som kan förekomma med fukt sorption i ssHDX är inte ett fenomen i SSPL. Detta begränsar märkning i SSPL till omedelbar närhet av den fototvärbindaren. Men till skillnad från HDX-MS, MS / MS-analys av den kovalent märkta proteinet kan ge rester-nivå strukturell information. Eftersom SSPL märkning är kovalent och irreversibel, tillbaka utbytet inte inträffar och prover kan förberedas och analyseras utan oro för förlust av etiketten. För att underlätta spridning av märkningsmedel och förbättra märkningen effektiviteten i fast-matrisen, kan SSPL utföras med ökande% RH. pLeu upptag kan också förbättras genom att öka koncentrationen av fotoreaktiva medel. Det molära förhållandet av protein till pLeu kan varieras såsom önskas. I allmänhet, en 100x molärt överskott av pLeu till proTein kommer att säkerställa tillräcklig märkning. Dock får höga pLeu koncentration resultera i förlust av Tertiärstruktur i den fasta matrisen. Därför Förutom märknings kinetik och formulering sammansättning, val av pLeu koncentrationen måste också grundas på att bibehålla protein strukturell integritet. Som pLeu etiketter nonselectively XH (där X = C, N, O) grupp, är det möjligt att hjälpämnen med liknande märkning platser kan kraftigt påverka nivån på proteinmärkning. Störningen av hjälpämnen i tillgången på pLeu för proteinmärkning ännu präglas. Det är känt att karben genereras från diazirine aktivering inte rest specifik, men en studie redovisar inriktning mot Asp och Glu 36. Även om det är bra att lära sig om restspecifika interaktioner, är peptid-nivå informationen även användbar och kan användas för att utforma hjälpämnen för att blockera regioner med hög matris exponering i fast tillstånd. SSPL-MS ger detaljerad kvalitativ information, menkvantitativa data måste erhållas och robusta mått behöver utvecklas för att analysera formuleringsskillnader inom en rad frystorkade system.

Användningen av en återstod specifik etikett kombinerat med MS / MS-analys kan ytterligare förbättra upplösningen till amino-syranivå. Märkningsreagens såsom 2,3-butandion att märka Arg, N-hydroxisuccinimid-derivat för Lys och N -alkylmaleimide derivat för Cys kan användas för att exakt kartlägga molekylära interaktioner i lyofiliserat pulver. Men dessa reagenser pH-beroende och reaktionerna kanske inte är så välkontrollerad som fotolytisk märkning i fast tillstånd. Ett alternativt tillvägagångssätt är att införliva den fototvärbindningsmedel in i proteinsekvensen med användning av auxotrofa cellinjer, ställesriktad mutagenes eller sidokedja derivatisering.

Våra tidigare ssHDX-MS och SSPL-MS studier har visat att märkningen av protein beror på typen och mängden av hjälpämnenanvänds 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS i Mb samarfrystorkas med guanidinhydroklorid (Gdn.HCl) visade större deuterium upptag än Mb samarfrystorkat med låg molekylvikt sockerarter 32. I en separat SSPL-MS studie Mb samarfrystorkas med Gdn.HCl visade större skydd mot fotolytisk märkning än Mb med sackaros 33. Vidare kvantitativa mätningar från ssHDX-MS har starkt korrelerade med stabiliteten hos proteinet vid långtidslagring 28. Dessa studier tyder på att ssHDX eller SSPL protein återspeglar omfattningen av strukturell retention av proteinet i lyofiliserat pulver. Vi tror att bibehållandet av sekundär struktur i frystorkade pulver ger gynnsamma förutsättningar för sidokedja märkning med pLeu och skydd av amid väte från deuterium utbyte. Emellertid behöver detaljerad jämförelse av informativt innehåll från dessa metoder för att utföras i framtiden. Även upprättandet nyttan av ssHDX-MS och SSPL-MSsom en formulering screeningmetod i slutändan kommer att kräva att den tillämpas på många proteiner, resultat från våra nya studier stöder dess bredare införande. Med ytterligare utveckling, är dessa metoder förväntas vara allmänt användbar för att karakterisera halvledarproteinformuleringar i den biofarmaceutiska industrin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equine myoglobin Sigma-Aldrich M0630-5G
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma Aldrich #T9531
D-Sorbitol Sigma Aldrich #240850
L-Photo-leucine Thermo Scientific #22610
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich #P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich #P3786
Deuterium Oxide Cambridge Isotope Laboratories #DLM-4-PK Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilized pepsin Applied Biosystems #2-3132-00
Trypsin Promega #V511A Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used
Water, Optima LC/MS grade Fisher Chemical #7732-18-5
Acetonitrile Sigma-Aldrich #34998
Formic acid Thermo Scientific #28905
ESI-TOF Calibrant Agilent Technologies #G1969-85000 Highly flammable liquid
Protein microtrap Michrom Bioresources TR1/25108/03
Peptide microtrap Michrom Bioresources TR1/25109/02
Analytical column Agilent Technologies Zorbax 300SB-C18
Freeze dryer VirTis AdVantage Plus
Stratalinker equipped with five 365 nm lamps Stratagene Corp. Stratalinker 2400
HPLC Agilent Technologies 1200 series LC Refrigerated LC system for HDX-MS
ESI-qTOF MS Agilent Technologies 6520 qTOF
HDExaminer (HDX-MS data analysis software) Sierra Analytics http://www.massspec.com/HDExaminer.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lawrence, S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nat. Biotechnol. 25, (4), 380-382 (2007).
  2. Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. BCC Research. BIO021D (2013).
  3. Lai, M. C., Topp, E. M. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. J. Pharm. Sci. 88, (5), 489-500 (1999).
  4. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharm. Res. 14, (8), 969-975 (1997).
  5. Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).
  6. Wüthrich, K. Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 265, (36), 22059-22062 (1990).
  7. Ilari, A., Savino, C. Protein structure determination by x-ray crystallography. Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).
  8. Brunger, A. T. X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics. Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).
  9. Yu, L. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Adv Drug. Deliv. Rev. 48, (1), 27-42 (2001).
  10. Manning, M. C. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability. Expert. Rev. Proteomics. 2, (5), 731-743 (2005).
  11. Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies. J. Pharm. Sci. 100, (7), 2871-2875 (2011).
  12. Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy. J. Pharm. Sci. 94, (9), 2030-2038 (2005).
  13. Pikal, M. J., et al. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J. Pharm. Sci. 97, (12), 5106-5121 (2008).
  14. Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility. J. Pharm. Sci. 98, (9), 3145-3166 (2009).
  15. Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 65, (1), 1-9 (2007).
  16. Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein. Sci. 11, (6), 1300-1308 (2002).
  17. Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23, (5), 639-647 (2009).
  18. Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery. Chem. Soc. Rev. 41, (11), 4335-4355 (2012).
  19. Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteomics. 9, (8), 1716-1728 (2010).
  20. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100, (6), 2071-2086 (2011).
  21. Dorman, G., Prestwich, G. D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends. Biotechnol. 18, (2), 64-77 (2000).
  22. Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 3, (4), 399-408 (2006).
  23. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A, (1), 8 (1977).
  24. Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping. Mol. Pharm. 9, (4), 718-726 (2012).
  25. Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22, (8), 1472-1476 (2011).
  26. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic. Acids. Res. 31, (13), 3784-3788 (2003).
  27. Sophocleous, A. M., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics. Mol. Pharm. 9, (4), 727-733 (2012).
  28. Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS). Mol. Pharm. 11, (6), 1869-1879 (2014).
  29. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, (1-2), 1-60 (2000).
  30. Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying. J. Pharm. Sci. 88, (12), 1354-1361 (1999).
  31. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Anal. Biochem. 366, (1), 18-28 (2007).
  32. Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys. J. 95, (12), 5951-5961 (2008).
  33. Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders. Mol. Pharm. 10, (12), 4629-4639 (2013).
  34. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).
  35. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach. Anal. Chem. 81, (19), 7892-7899 (2009).
  36. Jumper, C. C., Schriemer, D. C. Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis. Anal. Chem. 83, (8), 2913-2920 (2011).
  37. Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Pharm. Res. 25, (2), 259-267 (2008).
  38. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids. Biotechnol. Bioeng. 97, (6), 1650-1653 (2007).
Masspektrometrisk Approaches att studera protein struktur och interaktioner i frystorkad Pulver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).More

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders. J. Vis. Exp. (98), e52503, doi:10.3791/52503 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter