Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Introduction

Die Fähigkeit, menschliche Körperzellen in embryonale Stammzellen-ähnliche pluripotenten Stammzellen umprogrammieren (iPS) wurde zuerst von Takahashi et al entdeckt. 2007 ^1. Humane dermale Fibroblasten, die mit Retroviren exprimieren vier Transkriptionsfaktoren transduziert (die so genannt Yamanaka Faktoren Oct3 / 4, Sox2, c-Myc und Klf4) gezeigt wurden hoch ähnlich menschliche embryonale Stammzellen (hES) auf der Grundlage der Morphologie, Proliferation, Genexpression und epigenetische Zustand zu sein; entscheidend ist, sind ebenfalls iPSCs und zur Differenzierung zu Zellen von allen drei Keimschichten ^1. Die Proliferationspotential und Differenzierung Kapazität von iPS-Zellen macht sie sehr attraktiv Werkzeuge; durch Umprogrammieren Zellen von Patienten mit bestimmten Krankheiten, iPSCs sowohl in vitro Krankheitsmodellsystemen und als potentielle Therapeutika verwendet werden.

Zu letzterem Zweck müssen mehrere Probleme, bevor das volle Potenzial von iPS-Zellen behandelt werdenin einer klinischen Umgebung realisiert werden kann; das tumorigene Potential von in vitro kultivierten hESCs und iPSCs, die Verwendung von xenogenen Derivate während Umprogrammierung und Zellerhaltung, und die Notwendigkeit der transplantierten Zellen in vivo zu verfolgen sind entscheidende Hürden für die klinische Anwendung von pluripotenten Stammzellen (Bewertet von Hentze et al. ^2). Eine ideale Lösung für den Bedarf für die Verfolgung von differenzierten Zellen nach Transplantation würde eine visuell detektierbare Markierung, Resists Silencing und Buntheit unabhängig von der Anwendung. Robust und nachhaltig Ausdruck der integrierten Transgene ist am leichtesten erreichbar sind, wenn exogene DNA in die Safe-Harbour-Loci eingeführt; das heißt, Genomorte, die ausreicht, die Transkription eines integrierten Vektor zu ermöglichen, während gleichzeitig die Minderung Perturbationen Expression benachbarter Gene in ^3. Ein solcher Ort, der sehr gut charakterisiert ist seit seiner Entdeckung ist das Adeno-assoziierte Virus integration Site 1 (AAVS1), in dem ersten Intron des Proteinphosphatase 1 regulatorischen Untereinheit 12C (PPP1R12C) -Gen. Dieser Locus wurde gezeigt, nicht nur aufrechterhalten und robuste Expression von integrierten Transgenen durch ausgedehnte Zeit in der Kultur und in vitro Differenzierung ³ zu ermöglichen, sondern auch zum Schutz der umgebenden Gene von Transkriptionsstörungs ^4; Beide Funktionen werden angenommen, dass aufgrund der Anwesenheit von endogenen Chromatin Isolatorelemente flankieren den AAVS1 Website ^5.

Fortschritte in der Genom-Engineering-Tools über nur den letzten zehn Jahren haben die Leichtigkeit und Effizienz, mit der genetischen Manipulationen in jedem Zelltyp erreicht werden erheblich erleichtert. Während frühe erfolgreiche Experimente angeführten überaus niedrige Niveaus von endogenen homologen Rekombination (HR) mit einer eingebrachten Geber für das Gen-Targeting in WSR ^6,7 erreichen, wird die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen, wie beispielsweise Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs), daß signinifikant induzieren homologe Rekombination durch die Erzeugung einer doppelsträngigen DNA-Bruch hat den Wirkungsgrad solcher Experimente ^8,9 stark erhöht. Die Umnutzung der beiden Transkriptionsaktivator ähnlichen Effektoren (Erzählungen) von pflanzenpathogenen Xanthomonas Gattungen und die prokaryotischen Cluster regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / Cas9 System in effiziente ortsspezifische Designer-Nukleasen hat Gen-Targeting in pluripotente Stammzellen aus einem zugänglichen und praxisnahe Methodik ^10-13.

Eine kürzlich durchgeführte Papier beschrieben, ein effizientes Verfahren für die stabile Integration eines grün fluoreszierenden Reporterkassette in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus in menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung von TALE Nukleasen (Talens) ^14. Diese gezielten iPSCs behielten ihre Fluoreszenz selbst nachdem eine gerichtete Differenzierung zu Herzmuskelzellen und die Transplantation in einem Mausmodell für Myokardinfarkt (MI), ein starker Hinweis für die Nützlichkeit solcherstabil fluoreszierende pluripotenten Stammzellen ^14. Gezielt Kolonien zu erhalten, wurde ein Gen-Trap-Verfahren verwendet, wobei ein Spleiß-Akzeptor (SA), plaziert 2A selbstspaltende Peptidsequenz, die das Puromycin-N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen unter der Kontrolle des endogenen Promotors PPP1R12C; also nur iPS, die die DNA-Donor am AAVS1 Locus integriert haben äußern PAC, wodurch sie auswählbar auf Puromycin-Resistenz beruht; (Figur 1, ^15). Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Erzeugung von AAVS1-GFP-iPS-Zellen berichtet in der jüngsten Papier ^14, das den Prozess der Transfektion von iPS-Zellen mit Talens und ein 9,8 kb Spender, um ein 4,2 kb DNA-Fragment in die AAVS1 Safe-Harbour-Locus zu integrieren, die Auswahl iPS-Zellen auf Basis von Puromycin-Resistenz und Kommissionierung Kolonien klonalen Expansion. Die hierin beschriebenen Techniken können auf viele Genomtechnik-Experimente angewendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Basalmembranmatrix und Beschichtung von Kunststoffartikel

1. Das tiefgefrorene Basalmembranmatrix Lager von -20 ° C auf Eis aufgetaut und über Nacht bei 4 ° C.
2. Nach dem Auftauen Pipette 2 mg Aliquots von Basalmembranmatrix in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen. Bewahren Sie diese bei -20 ° C, bis sie benötigt.
3. Um Basalmembranmatrix beschichteten Platten vorbereiten, tauen ein Aliquot auf Eis bis zum letzten Stück Eis in den Eppendorf-Röhrchen ausgeblendet wird (in der Regel innerhalb von ca. 2 h).
4. Nach dem Auftauen hinzuzufügen Basalmembranmatrix bis 12 ml kaltem (4 ° C) DMEM / F12, um Basalmembranmatrix Beschichtungslösung herzustellen.
5. Hinzufügen Basalmembranmatrix Lösung des geeigneten Kulturgefäß. Für eine Platte mit 6 Vertiefungen, zu verzichten 1 ml pro Vertiefung. Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, die Basalmembran-Matrix-Lösung vollständig bedeckt jede Vertiefung.
6. Parafilm verschließen Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, und Inkubation bei room Temperatur 1 Stunde vor der Verwendung. Alternativ Shop Basalmembranmatrix beschichteten Platten / Geschirr bei 4 ° C lagern und innerhalb von 2 Wochen nach Beschichtung.
   HINWEIS: Fügen Sie Zusatz DMEM / F12 mit dem Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale um ein Austrocknen zu verhindern. Vor der Verwendung 4 ° C gelagert Basalmembranmatrix beschichteten Platte / Schale, legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten zu kommen.
7. Aspirat Basalmembranmatrix vollständig vor der Zugabe von Medium und Zellen.

2. Herstellung von E8 Medium

1. Bereiten E8 Kulturmedium durch Auftauen E8 Ergänzung über Nacht bei 4 ° C.
2. Entfernen 10 ml E8 Grundmedium aus der 500 ml Lager und entsorgen.
3. Pipettieren Sie die gesamte 10 ml Fläschchen mit E8 Ergänzung direkt in 490 ml E8 Grundmedium. Nicht warmen komplette E8 Medium in einem 37 ° C Wasserbad, als wiederholte Temperaturschwankungen können die bFGF im comple abbauente E8 Medium.
4. Verwenden Sie vollständige E8 Medium innerhalb von 2 Wochen nach der Zugabe der Ergänzung.

3. Auftauen von iPS-Zellen

1. Entfernen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen iPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff und auf Trockeneis.
2. Schnell auftauen das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad; Schwenken Sie die Durchstechflasche in das Wasserbad, bis nur noch ein winziges Fragment des Eises bleibt.
3. Sprühen Sie die Flasche mit 70% Ethanol und Transfer zu einem biologischen Sicherheitsschrank.
4. 1 ml Raumtemperatur E8 Medium tropfenweise direkt in das Fläschchen.
5. Mit einem 2 ml Pipette die Zellsuspension unter Rühren in 9 ml E8 Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen. Schwenken Sie den Schlauch häufig, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium gut mischen schnell.
6. Zentrifugiere die Zellen bei 200 g für 5 min.
7. Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in einem geeigneten Volumen von E8 mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt.
8. Fügen Sie die Zellen, um eine entsprechende Anzahl von Keller Membrane Matrix-beschichteten Vertiefungen und in ein 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator über Nacht. Es wird empfohlen, mindestens 0,2 x 10 ⁶ iPSC pro Vertiefung einer 6-Well-Platte Platte auf eine schnelle Wiederherstellung nach dem Auftauen zu ermöglichen.

4. Wartung und Routine Passagieren von iPS-Zellen

1. Aktualisieren E8 Medium täglich.
2. Überwachen der Morphologie und der Konfluenz der Zellen mit einem inversen Mikroskop. iPS-Zellen von hoher Qualität wachsen in flache Kolonien mit deutlichen Grenzen; Einzelkolonien besitzen eine "pflastersteinartigen" Aussehen.
3. Passage die iPS-Zellen, wenn sie zu erreichen ~ 70% Konfluenz.
4. Bereiten Sie eine EDTA Passagieren Lösung durch Zugabe von 0,9 g NaCl und 500 ul 0,5 M EDTA zu 500 ml DPBS. Gut mischen, um NaCl und Vakuumfilter lösen, um zu sterilisieren. Erwärmen eines Aliquots der Passagierung Lösung in einem 37 ° C Wasserbad vor Passagierung.
5. Um den Durchgang, absaugen verbrauchten Kulturmedium und wäscht die Zellen einmal mit einem gleichen Volumen von warmem passaging Lösung. Aspirate und Pipetten genug EDTA Passagierung Lösung zur Beschichtung der Zellen (1 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen).
6. Legen Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop und beobachten Sie die iPSC Kolonien. Das Auftreten von Löchern in Kolonien und hob Grenzen sollte deutlich werden innerhalb von 2 bis 5 Minuten.
7. Sorgfältig absaugen EDTA Passagieren Lösung.
8. Unter Verwendung einer 10 ml Pipette verzichtet 4 ml E8 Medium (bei Verwendung einer Platte mit 6 Vertiefungen) unter hohem Druck direkt in jeder Vertiefung passagiert werden.
9. Sammeln Sie die iPSC Klumpen und aufgeteilt in eine entsprechende Anzahl von Vertiefungen in Abhängigkeit von der Split-Verhältnis von 1: 8 bis 1:12. Nicht zu pipettieren, als Aufgliederung der Zellklumpen zu einer schlechten Rentabilität führen.
10. Die Platte wird in einem Brutkasten, und Rock die Platte hin und her und von Seite zu Seite mehrmals, um die Zellen zu dispergieren.

5. Herstellung von MEFs und iPS-Zellen für Tansfection

1. 48 Stunden vor der transfection, Passage iPSCs bei ~ 1: 6 in vier oder mehr Vertiefungen einer Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte, so dass sie zu 70% konfluent 2 Tage damit sein.
2. Am nächsten Tag auftauen DR4 MEFs in MEF Medium, das aus DMEM (hoher Glukose) mit 10% FBS und 1x MEM-NEAA ergänzt.
3. Platte DR4 MEFs in zwei 10-cm-Schalen bei ~ 2 x 10 ⁴ Zellen / cm ² beimpft und über Nacht bei 37 ° C.
4. Am Tag der Transfektion ändern MEF mittlere bis E8 mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt 30 Minuten vor der Durchführung der Transfektion auf iPS-Zellen.
5. Optional: Wenn durchflusszytometrische Analyse von iPS-Zellen nach der Transfektion gewünscht ist, entfernen Sie einen Basalmembranmatrix beschichteten Platte von 4 ° C und bei Raumtemperatur.
6. Optional: 4 h vor der Transfektion ergänzen vorge Transfektion iPSC Kultur Y-27632 in einer Endkonzentration von 10 uM.

6. Gentle-Zelle Dissoziation Reagenz Behandlung einnd Transfektion von iPS-Zellen mit einem Elektroporationssystem

1. Entfernen P3 primären Zell Transfektionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen ~ 30 min. Fügen Sie die gesamte 100 ul Ergänzung zur Transfektion Lösung vor der Verwendung.
2. Warm sanfte-Zelldissoziation Reagenz in einem 37 ° C Wasserbad.
3. Erhalten AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) und AAVS1-CAG-EGFP Geber von -20 ° C.
4. IPS-Zellen zu entfernen aus dem Inkubator und einmal mit DPBS waschen.
5. 1 ml der sanfte-Zelldissoziation Reagenz pro Vertiefung und inkubieren iPS-Zellen bei 37 ° C für 5 Minuten oder bis mehr als 50% der Zellen aus dem Kulturgefäß dissoziiert.
6. Pipettieren Sie die Zellen nach oben und unten ein paar Mal mit einer p1000-Pipette, um alle verbleibenden Zellen aus dem Kulturgefäß zu distanzieren und zu brechen iPSC Klumpen.
7. 2 ml E8 Medium in jede Vertiefung und Pipette auf und ab mehrmals mit einer 10 ml Pipette nach Fürther disaggregieren Zellklumpen in einzelne Zellen
   HINWEIS: Die Transfektionseffizienz sinkt deutlich, wenn Zellklumpen nicht ausreichend aufgeschlüsselt.
8. Sammeln iPSCs in einem 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 100 × g für 3 min.
9. Überstand wird abgesaugt und die Zellen in einer minimalen Menge von E8 Medium.
10. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer nach der Anwendung eines Vitalfarbstoffes wie 0,4% Trypan blau. Stellen Sie sicher, dass die Zellen ausreichend dissoziiert beim Zählen (1-3 Zellen pro "Klumpen").
11. Verzichtet werden 3 x 10 ⁶ Zellen in jeweils zwei 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 100 × g für 3 min.
    HINWEIS: Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit reduziert die Zellstress und ermöglicht eine einfache Resuspension von iPS-Zellen vor der Elektroporation.
12. Stellen Sie die Elektroporation System auf den Zelltyp-spezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H9 (Programm CB-150).
13. Nach dem Zentrifugieren den Überstand aspirieren vom cell Pellets. Um ein Pellet, mit 10 ug des HR Spender als Kontrollprobe. Zu den weiteren Pellet hinzufügen 10 ug des HR Spender, zusammen mit 5 ug jedes TALEN (PZT-AAVS1-L1 und PZT-AAVS1-R1) als Versuchsprobe.
14. Resuspendieren jedes Zellpellet in 100 ul P3 primären Zell Transfektionslösung und übertragen in eine Küvette.
15. Führen Sie die Transfektion und sofort fügen 500 ul Raumtemperatur E8 Medium zu jeder Küvette.
16. Übertragen Sie die transfizierten iPSCs tropfenweise zu einer 10-cm-Schale mit DR4 MEFs in Schritt 5.4 vorbereitet.
17. Optional: Fügen Sie einige Tropfen aus jedem Experiment in eine Vertiefung einer Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen, wenn Durchflusszytometrie anaylsis der Transfektionseffizienz gewünscht wird.
18. Wiederholen Sie die Schritte von 6,15 bis 6,17, beide Proben zu beenden. Am folgenden Tag, waschen Sie die Zellen mit DPBS zweimal und schalten Kulturmedium zu NutriStem, die iPSC Kultur auf Feeder unterstützt besser als E8 erscheint.
19. TrAnsient EGFP-Expression Peaks bei 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion; beurteilen Transfektionseffizienz nach Wunsch.

7. Puromycin Auswahl der Targeted iPSCs

1. Beginnen Puromycin-Selektion 72 Stunden nach der Transfektion, wenn die iPS-Zellen zu erreichen 70% Konfluenz.
2. Für NCRM5 iPSCs beginnen Puromycin-Selektion bei 0,5 ug / ml Puromycin (1/2 der vollen Dosis) in NutriStem Kulturmedium verdünnt. Die optimale Puromycin Konzentration von 0,25 bis 1 & mgr; g / mIL einigen iPSC Linien variieren.
3. Kultur iPS-Zellen in NutriStem + 0,5 ug / ml Puromycin für 3 Tage, erfrischend das Medium täglich.
4. Nach 3 Tagen, erhöhen die Konzentration von Puromycin bis 1 ug / ml.
5. Kultur iPS-Zellen unter 1 ug / ml Puromycin-Selektion für weitere 7 bis 8 Tage, oder bis deutliche Kolonien erscheinen groß genug für Kolonie Kommissionierung.

8. Kolonie Kommissionierung und Ausbau von gezielten iPSCs

1. Verwenden BasalmembranMatrix zu beschichten, eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Dispensieren 50 ul Basalmembranmatrix Beschichtungslösung (2 mg Basalmembranmatrix in 12 ml DMEM / F12 verdünnt) in jede Vertiefung. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht vor dem Gebrauch.
2. Nachdem man die Basalmembranmatrix beschichteten Platte auf Raumtemperatur kommen, saugen Sie den Basalmembranmatrix zubereitet, und 100 & mgr; E8 mit 10 & mgr; Y-27632 in jede Vertiefung ergänzt.
3. Ein inverses Mikroskop in einem biologischen Sicherheitsschrank und Spray leicht mit 70% EtOH zu sterilisieren.
4. Ziehen Sie ein Glas Pasteur Pipette über einem Bunsenbrenner, eine ideale Kolonie-Picking-Tool, das einen kleinen "Haken" an der Spitze zu erhalten. Sterilisieren mit 70% EtOH, und legen Sie in der Haube, um zu trocknen.
5. Entfernen Sie die Schale mit gezielten iPSC Kolonien aus dem Inkubator, und legen Sie in die Haube unter dem Mikroskop.
6. Wählen iPSCs durch Verfolgung einen Kreis um die Kolonie Grenze der Kolonie-Picking-Tool.
7. Verwenden Sie den "Haken" der Kolonie Kommissionierung Werkzeug vorsichtig abkratzen und entfernen Sie die iPSC Kolonie von der Oberfläche der Platte. Bei größeren Kolonien, Zeichnen eines X mit dem Kolonie-Picking-Tool zu Quartal die Kolonie wird das Zellwachstum nach erneuter Beschichtung zu erleichtern.
8. Sobald Zellklumpen sind freistehend und frei schwebend, mit einem p200 Pipette eingestellt auf ~ 30 & mgr; l, um die iPS-Zellen zu sammeln. Plattenzellen direkt in die 96-Well-Platte.
9. Optional: mit einem p20-Pipette, um ~ 5 & mgr; l eingestellt, um die iPS-Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen zu sammeln, dann fügen Sie 50 ul sanft-Zelldissoziation Reagenz für 5 min bei 37 ° C verdaut. Nach der Verdauung, fügen Sie 500 ul E8 Medium in die Eppendorf-Röhrchen, um die sanfte-Zelldissoziation Reagenz verdünnen und Spin-down der Zellen bei 200 xg in einer Standardtischmikrozentrifuge 5 min. Dann saugen die meisten mittel- und verlassen ~ 30 & mgr; l zu resuspendieren und übertragen Sie die Zellen in 96-Well-Platte.
   HINWEIS: DieseAnsatz wird die Dissoziation des Zellklumpen und schnelle Expansion des abgeholt Kolonie zu erleichtern.
10. Weiter Kolonieaufnahme bis eine ausreichende Anzahl von iPSC Kolonien wurden gesammelt (etwa 20-30 Kolonien pro Experiment wird empfohlen).
11. Nach Kolonie Kommissionierung, legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Inkubator über Nacht. Aktualisieren mit kompletter E8 Medium am nächsten Tag, und Kultur, bis ~ 70% konfluent.
12. Passage-Zellen aus dem 96-Loch in eine 24-Loch, dann in eine 6-Loch, wie in Schritten von 4,5 bis 4,10 beschrieben.
    HINWEIS: die Volumina der EDTA-Lösung und E8 Medium sollte bei der Verwendung von Brunnen kleiner als eine Platte mit 6 Vertiefungen entsprechend zu reduzieren.
13. Beurteilen Sie Targeting den Erfolg von Anschluss PCR und Southern-Blot-Analyse, gezielte Kassette Integration und das Fehlen von nach dem Zufallsprinzip eingefügt Vektoren ¹⁶ zu bestätigen.

Representative Results

Eine Visualisierung des Protokolls ist in Abbildung 2, mit Zeiten, in denen iPS-Zellen sind in unterschiedlichen Medium entweder grün oder blau E8 für NutriStem hervorgehoben kultiviert. Es ist wichtig, nur hochwertige iPS-Zellen zu transfizieren; untersuchen Kulturschalen ganz routinemäßige Wartung und prüfen, ob iPS Kulturen enthalten hauptsächlich verschiedene Kolonien die mit einem Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie (3A); differenzierten Zellen sollten nicht mehr als 10% der Kultur besetzen. Transfizierbarkeit von iPS-Zellen beurteilt und optimiert, mit dem kleinen pMax-GFP-Vektor (4A-B), wie Transfektion mit pMax-GFP in der Regel stellt die maximal erreichbare Effizienz aufgrund seiner geringen Größe. Beispielsweise erreicht man 68,6% Transfektionseffizienz mit pMax-GFP (4B). Um die AAVS1 Safe-Harbour-Ziel werden iPSCs mit einem sanften einzellige Dissoziation Reagenz agiert und mit AAVS1-Talens und AAVS1- transfiziertCAG-EGFP (in 1A dargestellt Plasmide). Transfizierte iPSCs werden dann auf einer geeigneten Dichte DR4 MEFs (3B) überzogen. Transiente Expression AAVS1-CAG-EGFP Peaks bei 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion (3C); Wenn gewünscht, kann ein kleiner Teil der transfizierten iPSCs FACS analysiert. NCRM5 iPSCs kann mit der Effizienz von 60,9% unter Verwendung AAVS1-CAG-EGFP Geber (4C) transfiziert werden. Die Transfektionseffizienz kann stark variieren; für Experimente, worin die GFP + -Fraktion ist sogar so niedrig wie 10% auf Puromycin-Selektion fortzusetzen. Nach der Durchführung Puromycin-Selektion sollten einzelne Klone Anzeige einheitliche Fluoreszenz groß genug für Kolonie Kommissionierung (3D) sein. Um Klone abholen wird eine geeignete Kolonie unter geringer Vergrößerung (3E) und wird von ersten Spur isoliert und Kasernierung es (3F-G). Die geviert Kolonien werden dann vorsichtig abkratzend aus dem Kulturgefäß (Figur 3H). Verwendung eines P200-Pipette werden Zellklumpen dann in eine Vertiefung einer Basalmembranmatrix-beschichtete 96-Well-Platte übertragen. iPS-Zellen sollte innerhalb von 2-4 Stunden nach Beschichtung (3I) befestigen. Wenn Anlage nicht innerhalb von 24 Stunden beobachtet, Basalmembranmatrix-Beschichtung oder Y-27632-Behandlung waren wahrscheinlich nicht optimal; Basalmembranmatrix-Mantel eine neue Platte mit 96 Vertiefungen und bereiten frische E8 + 10 uM Y-27632 vor Kommissionierung keine weiteren Kolonien. Sobald in einer 96-Well-Format, gezielte iPSC Klone werden expandiert und sollte stabil und einheitlich Expression von GFP (Figuren 4D-E) aufweisen.

Abbildung 1: Gene Targeting-Vektoren und Targeting schema. (A) Vertretungen der AAVS1-CAG-EGFP und PZT-AAVS1-L1 / R1 Talens Plasmide in dieser Studie verwendet. Der SA-2A Element im AAVS1-CAG-EGFP-Plasmid stellt das Splice-Akzeptor und 2A selbstspaltende Peptid zur Puromycin N-Acetyltransferase (PAC) Genexpression gezielt-Integrationsereignissen zu beschränken. Das Huhn β-Actin-Globin (CAG) Promotor verwendet wird, um die Expression von EGFP zu fahren. (B) Die AAVS1 Safe-Harbour, im Intron 1 des PPP1R12C Gen enthielt, wird mit Talens, um eine doppelsträngige DNA-Bruch erzeugen richtet. Dadurch wird die homologe Rekombination (HR) Reparaturmaschinerie, die dann die AAVS1-CAG-EGFP Spender (Lagerhomologiearme flankieren den Schnitt vor Ort) als Substrat für die Reparatur. Die Kassette wird integriert, und das PAC-Gen unter der Kontrolle des endogenen PPP1R12C Promotors gestellt.

Abbildung 2. Zeitleiste der Gen-Targeting-Experiment. IPS-Zellen kultiviert werdenzu 70% Konfluenz passagiert und ~ 1: 6 am Tag -2 (d-2). MEFs sind bei d-1 plattiert und iPS-Zellen werden gesammelt und bei d0 transfiziert. Bei D1, werden Medien in NutriStem schaltet und iPSCs sind für zwei weitere Tage kultiviert, bevor Puromycin wird dem Medium in d3 eingetragen. Kolonien sind in der Regel bereit für die Kommissionierung von d12. Zeiten des Bezugs von iPS-Zellen sind in E8-Medium sind grün hervorgehoben, während Perioden von NutriStem Kultur sind in blau.

Abbildung 3: iPSC Gen-Targeting repräsentative Bilder (A) Phase-Bild von hoher Qualität iPSCs.. Beachten Sie die Phasen hellen Rand und Kopfsteinförmige Morphologie. (B) DR4 MEFs vernickelt mit 2 x 10 ⁴ Zellen / cm ² 24 Stunden nach dem Auftauen. (C) Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion sind EGFP + Zellen deutlich sichtbar wenn sie unter einem Fluoreszenz micr angesehenoscope. (D) Nach dem Puromycin-basierte Auswahl für ~ 14 Tage, sind Kolonien Anzeige einheitliche GFP-Fluoreszenz groß genug, um abgeholt werden. (EH) Vertreter Bilder der Kolonie Kommissionierung. Kolonien werden aufgenommen unter Verwendung einer Pasteurpipette gezogen, die zuerst von umreißt die Kolonie, und dann durch das Vierteln es zu kleineren Zellklumpen zu erhalten. (I) auf ausgewählte iPSC Kolonien heften sich an die Basalmembran-Matrix beschichtete Oberfläche der Platte mit 96 Vertiefungen in 2 bis 4 Std. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 4: FACS-Analyse von Transfektionseffizienz und klonalen gezielte iPS-Zellen. (A) Kontrolle NCRM5 iPS-Zellen ohne Transfektion von jedem Plasmid. (B) NCRM5iPSCs mit der kleinen Testvektor pMax-GFP transfiziert sind FACS analysiert auf GFP-Expression. (C) Transiente Expression der AAVS1-CAG-EGFP-Plasmid durch FACS untersucht. (D) Ein NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP-Klon zeigt durchweg positiv EGFP-Expression durch FACS analysiert. Notieren Sie sich die enge Bündelung von iPS-Zellen untersucht im Vergleich zu C). (E) Fluoreszenzbild eines erweiterten NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP gezielte Klon.

Discussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von AAVS1 Safe-Harbour gezielte menschlichen iPS-Zellen sind: (1) der effizienten Erbringung von TALEN und Donorplasmiden in iPS-Zellen durch Transfektion; (2) Optimierung der Dissoziation von iPS-Zellen in einzelne Zellen vor der Transfektion und Beschichtungs-Dichte nach der Transfektion; (3) Optimierung der Dosis und der Zeit der Medikamentenauswahl basierend auf dem Wachstum von iPSC Leitung; (4) sorgfältig seziert und Kommissionierung gezielte Kolonien und die Übertragung auf neue Platte / gut. Im Vergleich zu in Hockemeyer Papier ¹⁰ verwendet ähnliche Verfahren verwendet dieses Protokoll ein Paar von Open-Source-AAVS1-Talens, verschiedene iPSC Dissoziation Reagenz und verschiedene Transfektion Gerät Talens und Gebervektoren zu liefern, die die Anzahl der iPS-Zellen in der zu reduzieren geholfen Experiment und gleichzeitig hohe Transfektion und Targeting-Effizienz.

Hocheffiziente Gen Bearbeitung in menschlichen iPSCs erreichen, ist es wichtig, zuerst die Optimierung der Abgabe-Gen EDIting Reagenzien (DNA / RNA), aber gleichzeitig die akute Zelltod die Versandart und Reagenzien führen zu iPS-Zellen. Das Ziel besteht darin, die Abgabeeffizienz zu maximieren, während ein ziemlich niedriges Niveau von Zelltod. Da es sehr einfach ist, große Mengen an AAVS1-TALEN Plasmide, die> 50% HR Effizienz mit Hilfe von Drogen-Auswahl in der menschlichen iPS-Zellen erreichen können, herzustellen, ist es nicht notwendig, mRNAs aus TALEN Plasmide zu machen. Die Herausforderung der Lieferung kommt aus großen Donorplasmiden, die in diesem Fall ist ~ 10 kb. Es wird empfohlen, die AAVS1-CAG-EGFP Spender zu verwenden, die Lieferung Effizienz in bestimmten menschlichen iPS Linien anstatt pMaxGFP bei der Transfektion Kit enthalten testen, da pMaxGFP ist ein ~ 3,5 kb Plasmid kleine und sehr einfach in allen Zellen zu liefern. AAVS1-CAG-EGFP Geber kann mit in 1A gezeigten Restriktionsenzyme zu unterschiedlichen Transgenen in AAVS1 Locus gezielt modifiziert werden. Ein weiterer 12 kb Spender, die eine 6,4 kb Kassette CAG-EGFP ersetzen enthält, muss seinen erfolgreich verwendet, um ähnliche Transfektion und Targeting-Effizienz (Daten nicht gezeigt) zu erzielen. Im allgemeinen sind menschliche iPSCs unter den schwer zu transfizierenden Zelltypen und der Abgabeeffizienz für große Plasmide, wie durch Durchflusszytometrie von GFP + -Zellen gemessen als günstig wie 5-10% betragen. Eine weitere Optimierung der Transfektionseffizienz ist abhängig von der richtigen Dissoziation menschlichen iPSCs in einzelne Zellen, Zellklumpen, da die Chance besteht Gens Bearbeitungsreagenzien in die einzelnen Zellen zu reduzieren. Dieses Protokoll verwendet eine sanfte und schnelle Arbeits Zelldissoziationslösung Reagenz, aber die Behandlung iPSCs für mehr als 10 Minuten ist nicht empfehlenswert. Normalerweise sind die iPSC Kultur ist weniger als 80% konfluent, wenn folgenden Schritt 5.1, so dass eine 5-minütige Inkubation mit vorgewärmter sanft-Zelldissoziation Reagenz in der Regel ausreichend, um die iPS-Zellen in einzelne Zellen mit vorsichtiges Pipettieren distanzieren. Wenn nicht alle Zellen nach 10 min der Behandlung in einzelne Zellen dissoziiert werden, da der Zellkultur über-confließend und die Kolonien werden sehr kompakt, sammeln Sie einfach die empfohlene Anzahl von Einzelzellen aus mehr Wells / Platten und lassen Sie die fest anhaftenden Zellen hinter. Schwere Pipettieren ist nicht zu empfehlen, da mechanische Scher ist schädlich für die Zellen als enzymatische Dissoziation. Bei der Arbeit mit frühen Passage iPS-Zellen (vor der Passage # 15), ist sanft Dissoziation der Praxis für das Überleben der Zellen sehr wichtig, weil die Zellen bereits empfindlicher auf Stress als Transfektion späten Passage iPS-Zellen. Wenn es schwierig ist, mit hoher Effizienz in sowohl Transfektions- und Zellüberlebensrate zu erreichen, wählen Sie die Praxis, die höchste Transfektionseffizienz führt. Nach der Transfektion sollten die Zellen in einer Dichte, die 50 bis 80% Konfluenz am Tag 3 erreicht wird, wenn die Droge-Auswahl startet plattiert werden. Da jeder iPSC Linie wächst anders könnte die nach der Transfektion Plattierungsdichte müssen für jede Zelllinie optimiert werden. Eine hohe Beschichtungs-Dichte zu Über Konfluenz, die die Wirksamkeit von dru reduziert führeng-Auswahl, während eine extrem niedrige Beschichtungs-Dichte kann eine verzögerte Erholung und das Wachstum von resistenten Kolonien führen. Regel 3 Millionen Ausgangs iPSCs genug sind, um in die ½ bis 2 10 cm-Schalen in Abhängigkeit von der das Überleben und Wachstum spezifischer iPSCs plattiert werden. Und falls mit einem neu generierten oder bis jetzt noch nicht getestete iPSC Linie, wodurch eine Puromycin töten Kurve, um die niedrigste wirksame Dosis in nicht transfizierten Zellen kann es notwendig sein zu schaffen; iPSC Leitungen erheblich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Puromycin-Selektion variieren. Die MEFs wurden für die Auswahl verwendet, weil sie zu iPSC Wachstum besser zu unterstützen als einige extrazellulären Matrix während der Medikamentenauswahl angezeigt. Als Faustregel gilt, ein Minimum von 5 Tagen Puromycin bei 1 ug / ml bzw. 7 Tage bei 0,5 ug / ml erforderlich sind, um die Auswahl zu vervollständigen. Schließlich ist Kolonie-Picking-Technik von entscheidender Bedeutung für alle gezielten Kolonien nach Medikamentenauswahl zu bewahren. Vorsichtiges Pipettieren oder Dissoziation Reagenz Behandlung hilft, um die Kolonien in mehrere Teile gleichmäßig zu brechenin das neue gut verteilt, und kann daher schneller Kolonie Expansion. Bei Verwendung einer Dissoziation Reagenz, um die gepickten Kolonien vor dem Beschichten zu zerlegen, stellen Sie sicher, es wird ausreichend mit> 10-fach Medium nach der Behandlung verdünnt, weil die Rest Dissoziation Reagenz konnte die übertragenen Zellen töten, wenn über Nacht stehen gelassen. Egal, welche Technik verwendet wird, üben Kolonieaufnahme vor den realen Experimenten ist ausdrücklich erwünscht.

Da die beschriebene Strategie nutzt ein Gen-Trap-Verfahren, um die Expression des PAC-Gen aus der endogenen PPP1R2C Promotor fahren, Kommissionierung wesentlich mehr als 30 Kolonien sollten nicht als notwendig erweisen. Der SA-2A verbunden PAC Auswahl theoretisch beseitigt zufällige Integration nur Zellen, sondern zusätzliche zufällige Integration (e) können in iPS-Zellen tragen erfolgreiche gezielte Integrationen auftreten. In den meisten Fällen wurden fast 100% des Wirkstoffs ausgewählten Klone Integrationen gezielte und ~ 10-40% haben zusätzliche zufällige Integrations. Der Großteil der gezielten Klone sind in der Regel Single-Allel Targeting zu haben, obwohl Experimente, bei> 50% doppelt Allel Targeting auftritt. Die variable Frequenz des zusätzlichen zufälligen Integrationen sowie das Verhältnis von ein- gegen doppelt Allel Targeting, ist schwierig zu kontrollieren. Daher Kommissionierung ~ 20 Kolonien wird empfohlen, einfach oder doppelt Allel sicherzustellen Targeting-only-Klone erhalten werden kann. Angesichts der erfolglosen Targeting Experimente Neubewertung der Zielzellen "Transfizierbarkeit, überleben, und die Wachstumsraten wird die Wirksamkeit von Nukleasen in der spezifischen Zelllinie, und die Qualität der Spender und Nuklease Vorbereitungen sehr empfehlenswert, bevor erneut versucht das Experiment in ihrer Gesamtheit.

Es sei darauf hingewiesen, daß ähnliche Gen-Trap-Donor Strategien können für das Targeting anderen aktiven Genen verwendet werden, ist aber nicht geeignet für die stille Gen-Targeting, das eine unabhängige Promotor benötigt, um auswählbare Genexpression anzutreiben. Auch während the AAVS1 sicherer Hafen gilt als offene Chromatinstruktur haben, bedeutet das nicht garantieren, dass transgene können stark an diesem Locus ausgedrückt werden. In der Tat, unsere jüngsten Bericht zeigte, dass mehrere schwache Promotoren konnten nachweisbaren fluoreszierenden Reportergenexpression nach gezielten Integration in AAVS1 Ort ¹⁴ zu fahren.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von gut validierten Talens, einen gut untersuchten Safe-Harbor-Locus des menschlichen Genoms zielen. Die Techniken sind sehr gut reproduzierbar und leicht anpassbar an viele Anwendungen, bei denen keine Transgen. Im Vergleich zum Genom nische Verfahren unter Verwendung von Zufallsintegrationen ist AAVS1-TALEN vermittelte Gen-Targeting hocheffizienten und spezifischen, und im Fall von iPS, Ergebnisse in stabil fluoreszierenden Zellen, die das Potenzial zu erweitern und zu differenzieren in eine menschliche Zelltyp aufweisen. Während dieses Protokoll beschreibt nicht die Auslegung und Validierung von Designer-Nukleasen oder die Bewertung von gezielten iPSC Kolonien für pRoper Kassette Integration und Off-Target-Analyse wurden mehrere ausgezeichnete Protokolle diese Aspekte der Methodik im Detail ^16-18 beschrieben. Der Feeder-freien iPSC Kultur und Passagierung Techniken mit E8 Medium werden auch in Details in früheren Veröffentlichung ¹⁹ beschrieben. Das obige Protokoll, während für Gen hinaus in die AAVS1 Safe-Harbour-menschlichen iPS-Zellen optimiert, kann als allgemeine Vorlage für Experimente, die ortsspezifische Nuklease-vermittelte Gen-Bearbeitung / zusätzlich mit einer homologen Rekombination Spender in jedem Zelltyp zu dienen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Store at -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061