Summary
本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。
Abstract
マスト細胞（MC）は、予め形成され、新たに合成され、アレルギー性炎症性および免疫メディエーターを放出することによって、それらの生理学的および病理学的機能を達成する免疫系の分泌細胞である。 MCは「メディエーターは、アレルギーおよび免疫応答で最高潮に達する複数の組織や臓器に影響を与える。 MCメディエーターの合成、貯蔵と放出は、高度に規制されています。予め形成されたメディエーターは、原形質膜と融合し、調節性エキソサイトーシスによってそれらの内容物を放出する細胞の分泌顆粒（SG）にパックされている。我々は、のSGに対して標的化された内因性SGメディエーターと一緒に調整された様式で放出されるレポーター遺伝子と目的遺伝子の同時発現に基づくプロトコルを提示する。プロトコルは、4次元の共焦点がMCのSGの解析高分解能を可能にし、トリガエキソサイトーシスに生物発生から自分のタイムラインを監視する。したがって、相互の遺伝子をスクリーニングするためのこのプロトコルを使用して彼らの表現型および機能的な影響のためのESTは、MCのSGの生合成とエキソサイトーシスを支配する分子メカニズムを解読すると、関係規制当局を特定することができます。これにより、健康と病気におけるMCの機能を占める細胞メカニズムへのさらなる洞察が提供されるべきである。
Introduction
マスト細胞（MC）は、最高の、関節炎、喘息、好酸球性食道炎、慢性皮膚炎、およびアナフィラキシーショック1,2-ならびに冠動脈疾患3,5を含む他の病態などのアレルギー及び炎症反応への関与のために知られている免疫細胞であり癌3,4。また、MCは、同種移植片寛容5,6を誘導例えば、細菌および寄生虫に対する宿主防御および免疫応答の抑制の両方によって、先天性および適応免疫において重要な役割を果たしている。
MCは、CD34 + / CD117 +多能性前駆細胞から7を開発し 、骨髄に由来する。コミット骨髄のMC前駆細胞は血流中に放出し、結合組織と上皮表面8内の主にローカライズする末梢組織中に移行されます。成熟と最終分化は、最終的には影響Oの下で達成されている周囲の環境8,9内のFサイトカイン。
MCがその遭遇イムノグロブリンE（IgE）の生成をもたらした抗体を入力アレルゲン（抗原、Ag）などによって活性化することができる。同じAgに対する再曝露の際のIgE細胞結合の架橋に続いてMCのFcεRIの受容体、このようなIgEの結合、FcεRIの凝集および細胞の脱顆粒で最高潮に達しシグナル伝達カスケードの開始の結果は[10,11に総説] 。 MCはまた、活性化された独立してIgEの、神経ペプチド5,12、13、毒素、細菌抗原およびウイルス抗原14,15によって、正に荷電したペプチドの数は、集合的に、基本的な分泌、免疫細胞およびサイトカイン5,13,12,16と称される、17。 MCがさらに炎症反応を増幅する独自のリリースメディエーターの多くによって活性化される。
MCが免疫を含ま分泌顆粒（SGS）が充てんされていそのようなキマーゼおよびトリプターゼ、血管内皮増殖因子およびいくつかのサイトカインおよびケモカイン8,9などのヒスタミン及び（げっ歯類における）セロトニン血管作用性アミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、を含む調節メディエーター。これらのメディエーターは、「行く準備ができて」いるとMCSが適切な刺激によって活性化されると、これらのメディエーターは、分18,19秒のうちに規制エキソサイトーシス（脱顆粒）によって細胞から放出される。この最初のイベントは、アラキドン酸代謝物、複数のサイトカインおよびケモカイン20,21,22を含む生物学的に強力な物質の大きな配列のデノボ合成および放出が続く。新たに合成された製品のリリースは、独立して、SGの放出が原因で発生します。まとめると、これらのメディエーターは、初期および後期相炎症やアレルギー反応を開始する。したがって、MCの活性化と脱顆粒を占めるのメカニズムを理解することは、理論と臨床IMPの両方があるortance。
遺伝的にプライマリおよび培養されたのMCを操作する難しさが不十分な解決のままのMC脱顆粒のメカニズムを解明しようとする試みを、妨げている。我々は、目的の遺伝子と粘膜マスト細胞株、ラット好塩基球性白血病（RBL）-2H3（本明細書でRBLと呼ばれる）、または骨髄由来のMC（BMMCに）30とを共トランスフェクトすることにより、レポーターベースのアッセイを開発し、この問題を克服するために、及びニューロペプチドY（NPY）は、SGのレポーターとして、単量体のRFP（mRFPと）に融合した。
NPYは、以前に、他のシステムにおける内因性SGマーカーの挙動を再現することが示された。 mRFPと蛍光は、pH非感受性であるため、また、NPY-mRFPとの表現は、酸性のSGの可視化を可能にするだけでなく、定量的な96ウェルプレートを用いて、エキソサイトーシスの評価および蛍光プレートリーダー。我々は、NPY-mRFPとはRBL細胞およびBMMCを酸性のSGに送達されることが示されており、細胞から放出される内因性のSG貨物（ すなわち 、βヘキソサミニおよびセロトニン）30、32と並んで、規制の方法で。このプロトコルは、彼らの表現型およびRBL細胞32内のSGの特性や脱顆粒上の機能への影響のために、目的の遺伝子をスクリーニングすることができ、高分解能イメージングベースの方法論を提供しています。具体的には、このプロトコルは、リアルタイムMCのSGのトラッキングとそのエリアまたはボリュームのサイズ、その数、組立体の動力学、細胞骨格に沿ったそれらの動きと異なる条件下で、原形質膜との最終的な融合の定量化を可能にする。例えば、DNP特異的IgEで細胞を感作し、異なる摂動の下で多価のAg（DNP共役血清アルブミン）を用いて細胞を誘発する（ すなわち 、重量または変異遺伝子の過剰発現は、目的の遺伝子のノックダウン、または薬理学的操作）と対照細胞と比較する。
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Protocol
RBL細胞培養メディアの作製
- （これは、約1％のPESTを行う）（これは、10％FBSを行う）ウシ胎児血清を56 mlの低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlを混合し、その後ペニシリンストレプトマイシン5.5mlのを追加する。
- 4℃で0.22μmの細孔サイズや店舗で500〜1,000ミリリットルボトル·トップ·掃除機用フィルターを使用してメディアをフィルタリングします。
RBL細胞の2.文化
- どちらのプレートまたはフラスコ中で37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で、RBL細胞を成長させる。 10cmプレート中で増殖されたRBL細胞を、10 mlの培地を補充し、約10 7細胞/プレートのコンフルエントな単層を形成すべきである。
- 細胞層がコンフルエントに近づいたとき、より低い密度で培養物をreplate。
- 真空に接続され、無菌パスツールピペットを用いてプレート/フラスコから培養液を除去します。
- あらかじめ温め（37細胞単層をすすぎ全体単層（ボリューム培養プレート/フラスコの大きさに依存するカバー℃）0.25％トリプシン/ EDTA; 10cmプレート2）を加えた。これは細胞を剥離します。
- あるいは、リンと細胞単層を食塩水（PBS）をバッファリングすすぎ、PBSを除去し、予め温めた（37℃）トリプシン/ EDTAを加える。このステップは、より高速なセルを切り離します。
- 37°C（せいぜい10分）でインキュベーターでプレート/フラスコを置きます。
- 彼らは切り離さしているかどうかをチェックするために光学顕微鏡で細胞を検査します。細胞は10分後に取り外すなかった場合は、優しくプレート/フラスコをタップします。
- 細胞を懸濁するための培養プレート/フラスコに培地を加える（培地の体積は、少なくともトリプシン溶液の体積よりも2倍であるべきである）。
- 25℃で200gで3分間の遠心分離によって細胞をペレット化。
- 培地中の細胞を懸濁します。 1：10によって細胞を希釈し、新しい培養皿に播種する。彼らはREACまで、48〜72時間細胞をインキュベートH約90％コンフルエンス。
- 最大3ヶ月（30継代）と同じ手順（セクション2.2.1-2.2.8）を繰り返します。
トランスメディアの調製。
- K-パイプpHが7、Ca 2+のアセテートの1 mM溶液およびMg 2+アセテートの100 mM溶液の100 mM溶液を準備します。
- DMEM培地を用いて20 mMの中にK-パイプのpH7の100mM溶液を希釈し、2の最終濃度が10μMおよびMg 2+アセテートの100mM溶液の最終濃度までのCa 2+アセテートの1mM溶液を追加mMの。
- カリウムグルタミン酸を計量し、128 mMの最終濃度に溶液に添加、よく混合し、使用するまで4℃で維持。 -20℃で残りの解決方法（ すなわち 、K-パイプ、Ca 2+の酢酸塩、Mg 2+を酢酸塩）を保管してください。
RBL細胞の4トランスフェクション
- 使用したプレート/フラスコから培地を除去真空に接続され、無菌パスツールピペット。
- 全体単分子層をカバーする必要があらかじめ温め（37℃）、トリプシン/ EDTAで細胞単層をすすぐ。 37°C（せいぜい10分）でインキュベーターでプレート/フラスコを置きます。細胞は、光学顕微鏡を用いて剥離しているかどうかを確認してください。
- 細胞を懸濁するための培養プレート/フラスコに培地を加える（培地の容積はトリプシン溶液の体積よりも少なくとも2より大きい以上であるべきである）。
- 血球計数器を用いて細胞数を数えます。
- 25℃で200×gで3分間の遠心分離により1.5×10 7細胞をペレット化。上清を破棄し、トランスフェクション培地の280μlを添加する。 4ミリメートルのキュベットに反応ミックスを転送します。
- NPY-mRFPとプラスミド20μgのを追加し、いずれかコントロール空のプラスミドまたはテストプラスミド30μgの。反応ミックスの最終容量は300μlのである必要があります。
- すぐに氷上で10分間置きます。残留水とpからキュベットを拭き9ミリ、300 Vでエレクトロポレーションにroceed。
- エキソサイトーシスの測定のために、300μlの培地を含む24ウェル組織培養皿に直ちに細胞をreplate。各ウェルに反応ミックスの8μL（4×10 5細胞）を追加します。制御のための追加のウェルに4×10 5の非トランスフェクトされた細胞を追加します。すべてのトランスフェクションのためにそれぞれの治療のために、少なくとも二連のウェルを持ってするのに十分な井戸を準備します。
- タイムラプス顕微鏡検査のために、80μlの培地を含む8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラスシステムですぐに細胞をreplate。各チャンバーに反応ミックスの1.5μL（7.5×10 4細胞）を追加します。 （カバーガラスの中央にチャンバーは画像に簡単である、カバーガラスの端にチャンバーを使用しないようにしてください）。
注：重要なことは、すべてのセルがトリガに応じていないと時折タイムラプス顕微鏡検査が原因8ウェルチャンバーborosiの焦点の喪失とドリフトに廃止されているlicateカバーガラスシステム。そのため、各トランスフェクションのために、各治療のために、少なくとも8室を用意。 - FcεRIを媒介活性化のための細胞を感作のために、メディア（少なくとも2時間のIgEで細胞を培養する）に、マウスのDNP特異的モノクローナルIgEの1μg/ mlのを追加します。
- 18〜24時間後の細胞は、プラスミドを発現することを確認するために、蛍光顕微鏡を使用しています。 mRFPと蛍光の励起および発光波長は、以下のとおりです。λEx584、およびλem607 nmの。 NPY-MRFPがSGSに対応して小胞構造に表示されます。関心のある第二の遺伝子は、蛍光タグに融合されている場合は、同じ細胞に両方のプラスミドの同時発現を確認するために蛍光顕微鏡を使用する。テストされた遺伝子は、GFPに融合される場合、GFP蛍光の励起および発光波長は、以下のとおりです。λEx488、およびλem507 nmの。 GFPタグ付けされたタンパク質は、NPY-mRFPとを表明同じ細胞で表示されます。
- エキソサイトーシスの測定のためのTを進めるOステップ5とタイムラプス顕微鏡検査のためには、ステップ6に進みます。
5. NPY-mRFPとエキソサイトーシスを測定
- タイロード緩衝液の調製：
- 54のKCl、20のMgCl 2、2.74 M NaClおよびDDWさ8mmのNaH 2 PO 4の溶液を調製する。十分に混合し、4℃で保存する。このステップでは、20倍のタイロードバッファーの調製のためである。
- 20mMのHepesの溶液のpH 7、1.8のCaCl 2、1mg / mlのBSA、5.6 mMのグルコースとDDWでタイロード20Xの1から20までの希釈を準備し、よく混ぜる。このステップは、1×タイロードバッファーの調製のためである。
- -20℃で1×タイロードバッファとストアを分注し。繰り返し凍結融解は避けてください。
- 24ウェルプレートから培地を除去し、タイロード緩衝液で3回洗浄する。対照ウェルに200μlのタイロード緩衝液を添加することによって刺激されていない細胞を準備します。
- 10μL/ウェルの20Xは、試薬[（ 例えば千/ mlのDNP-BSAまたはDNPをアクティブに濃縮準備-HSA（Ag）を、200μMのCa 2+イオノフォア（例えば A23187）、および20μMのCa 2+イオノフォアと1000nmの12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）]の組み合わせ。試薬はDMSOに格納されている場合、1％DMSOを含有するタイロード緩衝液中で20倍濃度に試薬を希釈する。 30分間37℃でインキュベートする。
- 、96ウェルプレートにも慎重にそれぞれの上清を削除し、氷上に置き、光から避ける。 （上清を細胞から放出されたキメラペプチドNPY-mRFPとが含まれている）。
- 各ウェルに、0.5％トリトンX-100を含有する200μlのタイロード緩衝液を添加し、10分間37℃でインキュベートする。 （このステップは、細胞から放出されていなかったNPY-MRFPの残りが含まれている細胞溶解物の準備のために重要である）。細胞溶解物を収集し、96ウェルプレートに移し、氷上に置き、光から避ける。
- fluorescを用いて、細胞上清および細胞溶解物の蛍光を測定するレンスプレートリーダー、590-、20nmのバンド幅の励起フィルター及び635-、35nmの帯域幅発光フィルターを使用して。
- リリースNPY-MRFPの割合を計算します。
注：蛍光リーダー対策任意の蛍光単位（AFU）。 AFUの値は、マシンとその感度とトランスフェクション効率に依存します。- ブランクとしてトランスフェクトRBL細胞の自家蛍光を設定します。全蛍光（上清のAFU +対応する溶解物のAFU）に各上清のAFUを分割し、100を掛け。
エキソサイトーシスの6タイムラプス顕微鏡
- 8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラス系でトランスフェクションされた細胞/チャンバーの種子7.5×10 4。 18~24時間後、チャンバーから培地を除去し、タイロード緩衝液で3回洗浄
- 各チャンバーにタイロードバッファーの72を添加する。 10倍の濃度にタイロードバッファ内の活性化試薬を希釈する。 <LI>加熱室（37℃）とCO 2コントローラ（4.8％）、および40Xまたは63X目的を搭載した共焦点蛍光顕微鏡を使用してください。顕微鏡システムをオンにする：水銀ランプ、コンピュータ、およびレーザーを。加熱されたチャンバは、実験を開始する前に、右の温度であることを確認します。
- 加熱されたチャンバー内に室を置き、チャンバーが正しく、安定したインストールされていることを確認してください。
- 関連するフォアに係る蛍光ライトをオンにして、トランスフェクトされた細胞を可視化する。目的の細胞は、漂白及び細胞毒性を最小限にするために、フィールドに入ると蛍光をオフにします。これは、このフィールドは約2-3トランスフェクトされた細胞が含まれることが重要である。トランスフェクトされた細胞は、よく伸びるが、互いに接触しないべきである。
- ノイズや過飽和ならびに毒性を最小限にする（顕微鏡に応じて）レーザーパワーを調整し、ゲインを設定し、信号対雑音比を変更するためのオフセット。で高速スキャンまたはデルは、レーザー博覧会（平均値2）の持続時間を最小にする。
- 最大ピンホールのサイズを調整し、これはレーザパワーを減少可能になり、長時間の焦点画像を維持する。所望であれば、信号対雑音比に最良の信号を与え、二次元共焦点光学スライスの順次走査を獲得1エアリー単位（AU）にピンホールのサイズを調整し、3次元画像を再構成するためにZスタックのパラメータを設定する≤0.7程度の光学スライスを持つZ -axes。
- 15分に15〜30秒にそれぞれ取得及び総取得の期間の間隔の時間を設定し、画像の取得を開始。買収の5分後時系列を一時停止する。 10倍のトリガーの8μlを添加し、すぐに取得を継続する。
- 、写真を保存するデコンボリューションソフトウェアを使用してデコンボリューションを行い、三次元画像およびIMARISソフトウェアを使用してムービーにスタックを再構成する。
- IMARISソフトウェアに共焦点蛍光顕微鏡によって得られたデコンボリューションされた時系列画像からデータをインポートする。このソフトウェアは、40以上の顕微鏡のファイルを読み込みます。ソフトウェアは、ファイルを読むことができない場合。 TIFファイルとインポートにファイルを変換する。
- オープンデータセットプレス編集の最後に時間点を追加するには - >時間ポイントを追加し、新しいデータ·セットをインポートします。
- 表面ウィザードオプションを使用してmRFPとチャネルの表面を作成します。デフォルトのアルゴリズムを選択してください。 NPY-MRFPのチャンネルを選択してください。ノイズを低減する平滑化オプションをマークします。細部の損失を回避するために0.05μmのエリア詳細レベルを下げる。
- 強度閾値を設定します。新しいグレーの表面が表示されます。 「設定」に移動し、「中心点」から「面」からスタイルを切り替えます。
- 、選択したオブジェクトのプロパティの[統計]タブに移動し、詳細タブと特定の値SUCを選択蛍光強度などの時間、音量等
- データを確認し、値が画像と互換性があることを確認します。例えば、二つ以上の隣接する顆粒は、大きな1つの顆粒として測定されることがあります。平均顆粒サイズを定量化するための顆粒の実際の数にマージされた顆粒の大きさに分割。
- Excelファイルに所望のデータセットをエクスポートし、データを分析する。
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Representative Results
そのためMCの低いトランスフェクション効率のため、遺伝子操作は、内因性のSGメディエーターで測定した平均分泌の読み出しに影響を残すことはほとんどありません。それにもかかわらず、レポーター遺伝子のNPY-mRFPと、同じ細胞において同時トランスフェクトされたプラスミドの完全な同時発現を確立することにより、NPY-mRFPとのモニタリングは、排他的に、目的の遺伝子を発現する細胞集団を監視することになる。したがって、従来の方法に比べて、このアッセイの利点は、選択的に遺伝子操作された細胞（ 図1）を監視する能力である。
実際に、このアッセイを用いて、我々は、可溶性NSF [N-エチルマレイミド感受性融合】付着タンパク質受容体（SNARE）タンパク質とのRab GTPアーゼファミリーの44のメンバーを含む小胞輸送を調節する遺伝子をスクリーニングしている。我々はSGsize、数字、カーゴ組成物およびエキソサイトー23を調節する遺伝子を同定した。
Weは、30のRabを特定し、その変更された（ すなわち 、阻害または刺激する）のいずれかにAgによりまたはCa 2+イオノフォアの組み合わせとホルボールエステルTPA（イオン/ TPA）23によって刺激RBL細胞におけるエキソサイトーシスを。共焦点イメージングは、細胞またはSGの30,32の形態を変える劇的な表現型の原因となったのSNAREとのRabを明らかにした。これらのタンパク質の共焦点イメージングは、細胞またはSGの形態30,32に劇的な表現型の原因となった8のSNAREとのRabを明らかにした。このプロトコルを使用して、我々は、個々のSGを追跡し、それらのサイズ、蛍光強度、それらの移動およびエキソサイトーシスの測定を実行することができた。例えば、我々はSG生合成30の制御因子としてのRab5を同定した。 Rab5のは、エンドサイトーシスおよびエンドソーム融合24のマスター調節因子として同定されている。私たちは、恒常的に負（CN）GDPロックRab5の（Rab5A、Rab5BとRab5C）の内因的に発現アイソフォームの変異体、またはEの共発現を示しているshRNAを標的とRab5A / B / CのXPRESSIONは、その数30の同時増加と有意のSG 'サイズを減少させた。逆に、GTP-ロック、構成的に活性な（CA）Rab5A変異体の発現（Rab5A Q79Lは、本明細書中の「CA Rab5A」）初期エンドソームの同型融合（のEE）24を促進することが知られている、巨大が形成された我々は彼らの分泌貨物NPY-MRFPのコンテンツやセロトニン、および規制ファッション30にexocytoseするそれらの能力に基づいてのSGとして識別Rab5A装飾小胞、。
図2は、NPY-mRFPと含有のSGの形態計測分析を示しています。 CAのRab5A発現細胞の平均のSG容積は、その数が20倍（図減少させながら制御GFP発現細胞でのSGの平均容積よりも> 20倍大きかった44ミクロン3の値に達し図2（a））。逆相関SGの数と大きさ（図2A）との間でのSGのRab5の媒介拡大がその同型融合を含むことが示唆された。 CAのRab5Aによって形成されたのSGを含む巨大なNPY-MRFPがそうでなければ可能であることができなかった細部でのSGを監視可能にする高解像度の生細胞の共焦点顕微鏡イメージングを可能にする。例えば、私たちは最も可能性が高いエンドソーム（ 図2B）に対応した、巨大なのSGに散在小さな構造と並んでのSGを融合にRab5Aを検出しました。さらに、当社は、示されている、新たに形成されたのSGとRab5Aの選択的かつ一過性の関連は唯一、新たに生成された顆粒は、他のSG 30と融合する能力を持っている融合装置と互換性があることを示唆して新たに形成されたのSGとのRab5が一過性に、好ましくは仲間という。
図3は、CAの発現により形成されたMC巨人のSGの代表タイムラプス画像を示す刺激後のシングルSGの解像度でRab5Aとエキソサイトーシスの動態。 MCのエキソサイトーシスの間に、SGSは向かって移動し、細胞膜と融合する。結果として分泌貨物は、細胞外空間に細胞から放出される。この実験系では、NPY-mRFPとは、細胞から放出され、細胞上清中に見出される。細胞上清中のNPY-mRFPとの蛍光を蛍光プレートリーダーで測定することができる。 NPY-mRFPとは、上清中に希釈されたので、その蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡によって検出または可視化することができない。 NPY-mRFPと蛍光強度とNPY-mRFPと含有のSGとそのdisappearance.Therefore、刺激された細胞およびNPYの測定のライブセルイメージングの収縮で急速かつ劇的な減少でエキソサイトーシスの結果の間に顆粒からNPY-MRFPのリリースSGのサイズを含む-mRFP蛍光強度またはNPY-MRFPのエキソサイトーシスの動態の正確な評価を提供個々の顆粒。 図3Bは、Ca 2+イオノフォアで細胞を刺激した後のSGの蛍光強度を示している。原形質膜と融合しなかった単一のSGの蛍光強度は一定のままでのSGは、異なる時点（ すなわち 、2、3、6、および11分後の刺激）でエキソサイトーシスを受ける。
図1：プロトコルの主なステップのイラスト RBL細胞はNPY-mRFPと、目的の第二の遺伝子または対応する対照プラスミドで同時トランスフェクトされ、すぐにカバースリップ、8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラスシステムまたは96ウェルプレートに播種した。翌日、休止およびトリガー細胞におけるNPY-mRFPと含有のSGの画像は、共焦点顕微鏡法（A）によって取得される。レスチンに加えて、エキソサイトーシスグラムは、96ウェルプレート蛍光リーダー（B）においてNPY-mRFPとの放出を測定することによって定量cellsisを引き起こします。
図2：SGの「大きさの定量化 RBL細胞はNPY-mRFPとし、GFPまたはGFP-CAのRab5Aいずれかで同時トランスフェクションし、8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラスシステム上に播種した。 24時間後、8ウェルチャンバーは、レーザー共焦点顕微鏡を備えた加熱室（37℃）に入れた。光学切片は0.7μmとの連続した画像のZスタック画像は63X油/ 1.4の開口数の対物レンズを使用して捕獲された。画像は、デコンボリューションされた三次元画像がIMARISソフトウェアによって構築した。 SGsとその数の容積がIMARISソフトウェア（A）を用いて計算した。 NPY-mRFPと含有granuの一部レはRab5A（矢印）内に埋め込まれているように見える。その他は、裸またはRab5A（矢印）で架橋されている。スケールバー=5μmの（B）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：activatedRBL細胞内の単一のSGの解像度での程度とエキソサイトーシスの反応速度を測定する RBL細胞は、NPY-mRFPとし、GFP-CAのRab5Aと播種IN8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラスシステム同時トランスフェクトした。 24時間後IN8ウェルチャンバーは、加熱されたチャンバー（37℃）を装備したレーザー共焦点顕微鏡に入れ、細胞を10μMのCa2 +イオノフォアでトリガーされた。画像は、63X油/ 1.4の開口数の対物レンズを用いて15秒毎に取得した。イメージズデコンボリューションした後、IMARISソフトウェアによって処理された。スケールバー=5μmの（A）。 NPY-mRFPを含有顆粒の平均蛍光強度は、IMARISソフトウェアによって決定され、データは、時間0（のCa2 +イオノフォアの添加時間）に応じて標準化した。矢印はSGcargoのリリースはwasnotedれる時点（B）を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々は、エキソサイトーシスのためのレポーター遺伝子を用いて、生細胞中でのSGの時間経過の三次元撮像によりMCのエキソサイトーシス及び4の（x、y、zは、t）は、次元定量化の定量化を組み合わせた、革新的な戦略を記載している。この技術は、それらの成熟、エキソサイトーシスの能力と脱顆粒の買収を通じて、早けれゴルジからの出口として開始のSGの監視などのMC機能への影響のためのタンパク質の家族のスクリーニングを可能にします。一緒のSGの形態計測と運動の特徴付けとエキソサイトーシスの測定値の組み合わせは、試験したタンパク質は、MC機能を媒介するメカニズムへの洞察を提供しています。従って、この方法論を使用して、標的遺伝子の遺伝子操作は、MCのSGストアとは、その貨物を放出することによって、新しい分子機構を明らかにすることができる。特に、NPYは、MCF-7細胞、細胞株由来のfrのような他の分泌細胞におけるエキソサイトーシスのためのレポーターとして機能することができるOM人間乳腺腺癌31、クロム親和細胞34と膵β細胞35。
遺伝子操作は、機能的なネットワークを研究するための現在利用可能な最も強力なツールです。遺伝子操作は、削除が削除並列ネットワーク間のクロストークを強制または冗長性のためには効果がありません他のタンパク質とは対照的に、システムの崩壊を強制され、各ネットワークに不可欠なタンパク質の同定を可能に。内因性メディエーターのエキソサイトーシスを測定する場合しかし、MCの低いトランスフェクション効率を、細胞のごく一部は、「操作」の試験DNAを発現している。内因性メディエーターのエキソサイトーシスを測定する場合したがって、総読み出しにトランスフェクトした細胞の寄与は軽微であります。したがって、MCの中で調節性エキソサイトーシスに関連した複雑なネットワークを探索するようなアプローチを採用しようとすると、ヘクタールだったmpered。この手法は、低トランスフェクション効率の障害を克服し、目的の遺伝子の発現、ノックダウンおよび突然変異誘発の上に起因するMCのSGの表現型の交代を観察する簡単な方法を提供します。
この技術は、一過性のトリプルトランスフェクションを用いて機能ネットワークの相互作用の階層モードを調査するために拡張することができる。結果は、特定の表現型を救出することができる遺伝子を決定するために分析される。より劇的な表現型を引き起こすか、何の効果もありません。そのような組合せのトランスフェクションに基づいて、エキソサイトーシスのネットワークを構築することができる。たとえば、トリプルトランスフェクションを使用して、我々はRab5の依存SG融合25のプロセスにおいて下流メディエーターとしてSNAREタンパク質VAMP8を識別することができました。
この方法は、単一のSGの解像度で可視化し、エキソサイトーシスの定量を可能にする。実際、我々はSGの表示微分応答がSTIMすることを示すことができたULI。他のものはなかったか、MC SG融合の差動速度の理由を決定することが残っている間、一定のSGは、原形質膜と融合した理由に関する理由。この実験的なアプローチを使用して今後の研究では、これらの質問に答える可能性を秘めている。例えば、異なるのSNAREまたは個々のSG上のRabとエキソサイトーシスの能力との相関とシングルSGの解像度におけるエキソサイトーシスの動態の定量化は、エキソサイトーシスの新規レギュレーターを明らかにする必要があります。
タンパク質の過剰発現は細胞機能または形態に影響を与える可能性があるため、この技術の主な制限は、遺伝子操作である。したがって、相補的なアプローチを使用して結果を検証することが不可欠である。例えば、構成的に活性な変異体の過剰発現は、エキソサイトーシス、恒常ネガティブ変異体の効果を阻害するか、または遺伝子のノックダウン時にもテストする必要があります。
この技術を使用して、我々はidentifMCのエキソサイトーシスに影響を与えるか、SGの形態を変えるMC関数のIED小説レギュレータ。 SGの形態計測特性評価とエキソサイトーシス測定の組み合わせを一緒に機能し、試験したタンパク質の作用メカニズムに深く洞察を提供しています。
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Acknowledgments
私たちは、NPY-mRFPとcDNAの贈り物のために博士U. Asheryに感謝。私たちは、博士に感謝。 MJ Kofron、L. Mittleman、M. Shaharbani、およびY. Zilberstein顕微鏡と画像解析との貴重な援助のために。また、この原稿の重要な読書のために博士ジョセフ·オルリーに感謝。この作品は、科学のためのイスラエルアカデミーによって設立されたイスラエル科学財団からの助成金によってサポートされていました（RS-Eに1139年から1112年。）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
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