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Immunology and Infection

मस्तूल सेल स्रावी Granules की जांच कर; जैवसंश्लेषण से exocytosis के लिए

Published: January 26, 2015 doi: 10.3791/52505
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य मस्तूल सेल स्राव के कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण की अनुमति देगा एक विधि विकसित करने के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल ब्याज और वास्तविक समय के जीन के साथ cotrasfected एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की रिहाई की मात्रात्मक आकलन पर आधारित है स्रावी दाना की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करती है।

Abstract

मस्तूल कोशिकाओं (एमसी) का गठन किया-पूर्व और नए संश्लेषित, एलर्जी, सूजन और immunoregulatory मध्यस्थों को रिहा द्वारा अपने शारीरिक और रोग कार्यों को पूरा है कि प्रतिरक्षा प्रणाली के स्रावी कोशिकाओं रहे हैं। MCs के 'मध्यस्थों एलर्जी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में बनी कई ऊतकों और अंगों को प्रभावित। एम सी मध्यस्थों के संश्लेषण, भंडारण और रिहाई अत्यधिक विनियमित रहे हैं। पूर्व गठित मध्यस्थों प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और विनियमित एक्सोसाइटोसिस से अपनी सामग्री को रिहा कि साइटोप्लास्मिक स्रावी कणिकाओं (एसजी) में पैक कर रहे हैं। हम एसजीएस के लिए लक्षित है और अंतर्जात एसजी मध्यस्थों के साथ एक विनियमित फैशन में जारी किया गया है कि एक पत्रकार जीन के साथ ब्याज की एक जीन के सह-अभिव्यक्ति के आधार पर एक प्रोटोकॉल, प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल एम सी एसजीएस का विश्लेषण करती है और ट्रिगर एक्सोसाइटोसिस को जीवजनन से उनके समय की निगरानी उच्च संकल्प चार आयामी confocal सक्षम बनाता है। इस प्रकार, इंटर के जीन स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोगउनके प्ररूपी और कार्यात्मक प्रभाव के लिए स्था एम सी एसजीएस की जीवजनन और एक्सोसाइटोसिस है कि सरकार आणविक तंत्र का गूढ़ रहस्य और इसमें शामिल नियामकों की पहचान करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, स्वास्थ्य और रोग में MCs के समारोह के लिए खाते में है कि सेलुलर तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान की जानी चाहिए।

Introduction

मस्तूल कोशिकाओं (एमसी) सर्वश्रेष्ठ जैसे गठिया, दमा, इओसिनोफिलिक ग्रासनलीशोथ, जीर्ण सूजन और कोरोनरी धमनी की बीमारी 3,5 और सहित सदमे 1,2 के साथ ही अन्य विकृतियों के रूप में एलर्जी और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में उनकी भागीदारी के लिए जाना जाता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं कैंसर 3,4। इसके अलावा, एमसीएस allograft सहिष्णुता 5,6 उत्प्रेरण उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया और परजीवी के खिलाफ मेजबान बचाव में और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन से दोनों, सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

MCs / + CD117 + pluripotent पूर्वज कोशिकाओं 7 CD34 से विकास, अस्थि मज्जा से उत्पन्न। प्रतिबद्ध अस्थि मज्जा एम सी पूर्वज खून में जारी की है और संयोजी ऊतक और उपकला सतहों 8 के भीतर मुख्य रूप से स्थानीयकृत परिधि के ऊतकों में विस्थापित कर रहे हैं। परिपक्वता और टर्मिनल भेदभाव अंततः प्रभाव ओ के तहत प्राप्त कर रहे हैंआसपास के परिवेश 8,9 भीतर च साइटोकिन्स।

MCs जिसका मुठभेड़ इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) की पीढ़ी में हुई एंटीबॉडी टाइप एक allergen (प्रतिजन, एजी) द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। एक ही एजी को फिर से जोखिम पर आईजीई बाध्य सेल के पार से जोड़ने के द्वारा पीछा एम सी के FcεRI रिसेप्टर्स करने के लिए इस तरह के आईजीई का बंधन, FcεRI एकत्रीकरण और सेल degranulation में खत्म है कि एक संकेत झरना की दीक्षा में परिणाम [10,11 में समीक्षा] । MCs के अलावा, neuropeptides 5,12 द्वारा स्वतंत्र रूप से आईजीई का सक्रिय 13, बैक्टीरियल और वायरल एंटीजन 14,15, सामूहिक रूप से बुनियादी secretagogues, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और साइटोकिन्स 5,13,12,16 के रूप में भेजा सकारात्मक आरोप लगाया पेप्टाइड्स के एक नंबर रहे हैं विषाक्त पदार्थों 17। MCs के भी आगे भड़काऊ प्रतिक्रिया बढ़ाना जो अपने खुद के जारी किया मध्यस्थों, के कई द्वारा सक्रिय कर रहे हैं।

MCs के इम्युनो होते हैं कि स्रावी कणिकाओं (एसजीएस) के साथ पैक कर रहे हैंऐसे chymase और tryptase, संवहनी endothelial वृद्धि कारक है और कई साइटोकिन्स और chemokines 8,9 के रूप में इस तरह के हिस्टामिन और (कृन्तकों में) सेरोटोनिन के रूप में vasoactive amines, proteoglycans, प्रोटिएजों, सहित विनियामक मध्यस्थों,। इन मध्यस्थों "जाने के लिए तैयार कर रहे हैं" और MCs के एक उचित प्रोत्साहन से सक्रिय कर रहे हैं, एक बार इन मध्यस्थों मिनट 18,19 सेकंड के एक मामले में विनियमित एक्सोसाइटोसिस (degranulation) द्वारा कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं। यह प्रारंभिक घटना arachidonic एसिड चयापचयों, कई साइटोकिन्स और chemokines 20,21,22 सहित जैविक रूप से शक्तिशाली पदार्थ, के एक बड़े सरणी के डी नोवो संश्लेषण और रिहाई के बाद है। नए संश्लेषित उत्पादों की रिहाई के लिए स्वतंत्र रूप एसजी रिहाई के कारण होती है। सामूहिक रूप से, इन मध्यस्थों जल्दी और देर चरण भड़काऊ और एलर्जी प्रतिक्रियाओं का आरंभ। इसलिए, एम सी सक्रियण और degranulation के लिए लेखांकन तंत्र को समझने सैद्धांतिक और नैदानिक ​​छोटा सा भूत की दोनों कर रहे हैंortance।

आनुवंशिक रूप से प्राथमिक और सुसंस्कृत MCs के हेरफेर करने के लिए कठिनाई खराब सुलझाया बना रहा है जो एम सी degranulation अंतर्निहित तंत्र, को स्पष्ट करने का प्रयास बाधा उत्पन्न हो गया है। ब्याज की एक जीन के साथ इस समस्या को दूर करने के लिए हम सह transfecting श्लैष्मिक मस्तूल सेल लाइन, चूहे basophilic ल्यूकेमिया से एक पत्रकार आधारित परख विकसित (आरबीएल) -2H3 (यहाँ आरबीएल के रूप में) या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न MCs (BMMCs) 30 और neuropeptide वाई (NPY) एक एसजी पत्रकार के रूप में, मोनोमेरिक आरएफपी (mRFP) से जुड़े हुए।

NPY पहले से अन्य प्रणालियों में अंतर्जात एसजी मार्करों के व्यवहार पुनरावृत्ति को दिखाया गया था। MRFP प्रतिदीप्ति असंवेदनशील पीएच, की अभिव्यक्ति है क्योंकि इसके अलावा, NPY-mRFP 96 अच्छी तरह प्लेटें और एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग करके अम्लीय एसजीएस के दृश्य के साथ ही एक्सोसाइटोसिस की मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है। हम चाहते हैं कि NPY-mRFP आरबीएल कोशिकाओं और BMMCs के अम्लीय एसजीएस को दिया है पता चला है और कोशिकाओं से जारी हैअंतर्जात एसजी कार्गो (यानी, β-hexosaminidase और सेरोटोनिन) 30, 32 के साथ एक विनियमित फैशन में। इस प्रोटोकॉल उनके प्ररूपी और आरबीएल कोशिकाओं 32 में एसजी विशेषताओं और degranulation पर कार्यात्मक प्रभाव के लिए ब्याज की स्क्रीनिंग जीन की अनुमति देता है कि एक उच्च संकल्प इमेजिंग आधारित पद्धति प्रदान करता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय एमसी एसजीएस की ट्रैकिंग और उनके क्षेत्र या मात्रा आकार, उनकी संख्या, विधानसभा के कैनेटीक्स, सेल cytoskeleton साथ उनके आंदोलन और विभिन्न परिस्थितियों में प्लाज्मा झिल्ली के साथ उनके अंतिम संलयन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, DNP-विशिष्ट IgE के साथ कोशिकाओं को संवेदनशील बनाने और विभिन्न perturbations के तहत एक multivalent एजी (DNP संयुग्मित सीरम albumin) के साथ कोशिकाओं को ट्रिगर (यानी, गुम्मट या उत्परिवर्ती जीन की अभिव्यक्ति है, या औषधीय जोड़तोड़ से अधिक ब्याज की जीन की पछाड़ना,) और कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए की तुलना।

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Protocol

आरबीएल सेल संस्कृति मीडिया के 1. तैयारी

  1. (इस ~ 1% कीट बनाता है) (यह 10% FBS के बनाता है) भ्रूण गोजातीय सीरम के 56 मिलीलीटर के साथ कम ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 500 मिलीलीटर मिक्स, और फिर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन की 5.5 मिलीलीटर जोड़ने।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार और दुकान के साथ 500-1,000 मिलीलीटर की बोतल टॉप वैक्यूम फिल्टर का उपयोग करके मीडिया फिल्टर।

आरबीएल प्रकोष्ठों के 2. संस्कृति

  1. या तो प्लेटों या बोतल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में आरबीएल कोशिकाओं को विकसित। 10 सेमी प्लेटों में बढ़ रहे हैं कि आरबीएल कोशिकाओं 10 मिलीलीटर मध्यम के साथ पूरक और ~ 10 7 कोशिकाओं / प्लेट का मिला हुआ monolayer फार्म की जानी चाहिए।
  2. सेल परत संगम के पास आ गया है, जब एक कम घनत्व में संस्कृति replate।
    1. वैक्यूम से जुड़ा एक बाँझ पाश्चर विंदुक का उपयोग थाली / कुप्पी से संस्कृति के माध्यम से निकालें।
    2. (37 prewarmed साथ सेल monolayer कुल्लापूरे monolayer (मात्रा संस्कृति की थाली / कुप्पी के आकार पर निर्भर करता है को शामिल किया गया है कि डिग्री सेल्सियस) 0.25% / trypsin EDTA, 10 सेमी की थाली के लिए 2 मिलीलीटर)। यह कोशिकाओं को अलग कर देंगे।
    3. वैकल्पिक रूप से, फास्फेट के साथ सेल monolayer खारा (पीबीएस) बफर कुल्ला पीबीएस को दूर करने और / EDTA के prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) trypsin जोड़ें। यह कदम तेजी से कोशिकाओं detaches।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस (कोई 10 से अधिक मिनट) पर एक मशीन में थाली / फ्लास्क रखें।
    5. वे अलग किया है, तो जाँच करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण किया। कोशिकाओं 10 मिनट के बाद अलग नहीं किया, तो धीरे थाली / फ्लास्क पर नल।
    6. कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए संस्कृति की थाली / फ्लास्क मध्यम जोड़ें (मध्यम की मात्रा कम से कम trypsin समाधान की मात्रा की तुलना में बड़ा दो गुना होना चाहिए)।
    7. 25 डिग्री सेल्सियस पर 200 जी में 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    8. मध्यम में कोशिकाओं Resuspend। 01:10 द्वारा कोशिकाओं पतला और एक नई संस्कृति डिश में बीज। वे reac तक, 48-72 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेतेएच लगभग 90% संगम।
    9. अप करने के लिए तीन महीने (30 अंश) के लिए एक ही प्रक्रिया (धारा 2.2.1-2.2.8) दोहराएँ।

अभिकर्मक मीडिया 3. तैयार करना।

  1. कश्मीर पाइपों पीएच 7, सीए 2 + एसीटेट की एक मिमी समाधान और 2 मिलीग्राम + एसीटेट के 100 मिमी समाधान की एक 100 मिमी समाधान तैयार है।
  2. DMEM मीडिया का उपयोग कर 20 मिमी में कश्मीर पाइपों पीएच 7 के लिए 100 मिमी समाधान पतला, 2 की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 माइक्रोन और 2 मिलीग्राम + एसीटेट के 100 मिमी समाधान के अंतिम एकाग्रता के लिए सीए 2 + एसीटेट की 1 मिमी समाधान जोड़ने मिमी।
  3. पोटेशियम ग्लूटामेट वजन और 128 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता का हल करने के लिए जोड़ने के लिए, मिश्रण अच्छी तरह से और उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष समाधान (यानी।, कश्मीर पाइप्स, सीए 2 + एसीटेट, 2 मिलीग्राम + एसीटेट) रखें।

आरबीएल प्रकोष्ठों के 4. अभिकर्मक

  1. एक का उपयोग कर प्लेट / कुप्पी से संस्कृति के माध्यम से निकालेंवैक्यूम से जुड़ा बाँझ पाश्चर विंदुक।
  2. पूरे monolayer कवर किया जाना चाहिए कि prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) trypsin / EDTA के साथ सेल monolayer कुल्ला। 37 डिग्री सेल्सियस (कोई 10 से अधिक मिनट) पर एक मशीन में थाली / फ्लास्क रखें। कोशिकाओं ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग अलग है अगर जाँच करें।
  3. कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए संस्कृति की थाली / फ्लास्क मध्यम जोड़ें (मीडिया की मात्रा trypsin समाधान की मात्रा की तुलना में कम से कम दो-बड़ा और अधिक होना चाहिए)।
  4. Hemocytometer का उपयोग सेल संख्या की गणना।
  5. 25 डिग्री सेल्सियस पर 200 XG पर 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा 1.5 × 10 7 कोशिकाओं गोली। Supernatants त्यागें और अभिकर्मक माध्यम के 280 μl जोड़ें। 4 मिमी क्युवेट में प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरण।
  6. जोड़ें NPY-mRFP प्लाज्मिड 20 माइक्रोग्राम प्रति और नियंत्रण खाली प्लाज्मिड या एक परीक्षण किया प्लाज्मिड की या तो 30 माइक्रोग्राम प्रति। प्रतिक्रिया मिश्रण की अंतिम मात्रा 300 μl होना चाहिए।
  7. इसके तत्काल बाद 10 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है। अवशिष्ट पानी और पी से क्युवेट साफ कर लें9 मिसे के लिए 300 वी पर electroporation के लिए roceed।
  8. एक्सोसाइटोसिस के मापन के लिए, 300 μl मध्यम युक्त 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर बर्तन में तुरंत कोशिकाओं replate। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण (4 × 10 5 कोशिकाओं) के 8 μl जोड़ें। नियंत्रण के लिए अतिरिक्त वेल्स को 4 × 10 5 गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं जोड़ें। कम से कम हर अभिकर्मक के लिए प्रत्येक उपचार के लिए कुओं नकल है करने के लिए पर्याप्त कुओं तैयार करें।
  9. समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए, 80 μl मध्यम युक्त एक 8 अच्छी तरह चैम्बर borosilicate coverglass प्रणाली में तुरंत कोशिकाओं replate। प्रत्येक कक्ष के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण (7.5 × 10 4 कोशिकाओं) के 1.5 μl जोड़ें। (Coverglass के केंद्र में कक्षों की छवि के लिए आसान कर रहे हैं coverglass के किनारे पर कक्षों का उपयोग कर से बचने की कोशिश)।
    नोट: महत्वपूर्ण बात है, सभी कोशिकाओं एक ट्रिगर करने के लिए प्रतिक्रिया नहीं है और कभी-कभी समय चूक माइक्रोस्कोपी के कारण 8 अच्छी तरह चैम्बर borosi का ध्यान केंद्रित की हानि और बहाव को निराकृत किया गया हैlicate coverglass प्रणाली। इसलिए, प्रत्येक अभिकर्मक के लिए प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम 8 कक्षों तैयार करते हैं।
  10. FcεRI मध्यस्थता सक्रियण के लिए कोशिकाओं को सुग्राही बनाने के लिए, मीडिया (कम से कम दो घंटे के लिए आईजीई के साथ कोशिकाओं को सेते हैं) करने के लिए माउस DNP के विशिष्ट मोनोक्लोनल आईजीई का एक माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर जोड़ें।
  11. 18-24 घंटा के बाद कोशिकाओं प्लास्मिड व्यक्त कि की पुष्टि के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। mRFP प्रतिदीप्ति की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य हैं: λEx 584, λEm 607 एनएम। द्वारा एन पी वाय-mRFP एसजीएस के अनुरूप जो vesicular संरचनाओं में दिखाई देनी चाहिए। ब्याज की दूसरी जीन एक फ्लोरोसेंट टैग से जुड़े हुए है, तो एक ही कोशिकाओं पर दोनों plasmids के सह अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। परीक्षण किया जीन GFP के लिए जुड़े हुए है अगर उदाहरण के लिए, GFP प्रतिदीप्ति की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य हैं: λEx 488, λEm 507 एनएम। GFP टैग प्रोटीन द्वारा एन पी वाय-mRFP व्यक्त है कि एक ही कोशिकाओं पर दिखाई देनी चाहिए।
  12. एक्सोसाइटोसिस माप के लिए T आगे बढ़नाओ चरण 5 और समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए, 6 कदम आगे बढ़ना।

5. द्वारा एन पी वाय-mRFP एक्सोसाइटोसिस मापने

  1. Tyrode बफर की तैयारी:
    1. 54 मिमी KCl, 20 मिमी 2 MgCl, 2.74 एम NaCl और DDW में 8 मिमी नाह 2 पीओ 4 के एक समाधान तैयार है। अच्छी तरह मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। यह कदम 20x Tyrode बफर तैयार करने के लिए है।
    2. एक 20 मिमी Hepes के समाधान के पीएच 7, 1.8 मिमी 2 CaCl, 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 5.6 मिमी ग्लूकोज और DDW में Tyrode 20x की 1-20 कमजोर पड़ने को तैयार है और अच्छी तरह मिक्स। यह कदम 1x Tyrode बफर तैयार करने के लिए है।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1x Tyrode बफर और दुकान विभाज्य। दोहराया ठंड और विगलन से बचें।
  2. 24 अच्छी तरह से थाली से संस्कृति के माध्यम से निकालें और Tyrode बफर के साथ 3 बार धोएं। कुओं को नियंत्रित करने के लिए 200 μl Tyrode बफर जोड़कर unstimulated कोशिकाओं को तैयार।
  3. / अच्छी तरह से 20X के 10 μl अभिकर्मक [(जैसे 1000 एनजी / एमएल DNP-बीएसए या DNP को सक्रिय केंद्रित तैयार करें-HSA (एजी), 200 माइक्रोन सीए 2 + ionophore (जैसे A23187), और 20 माइक्रोन सीए 2 + ionophore और 1000 एनएम 12-हे tetradecanoylphorbol-13-एसीटेट (टीपीए)] का एक संयोजन। अभिकर्मकों DMSO में जमा हो जाती है, तो 1% DMSO युक्त Tyrode बफर में 20x एकाग्रता में अभिकर्मकों पतला। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए अच्छी तरह से ध्यान से प्रत्येक के supernatants निकालें बर्फ पर जगह और प्रकाश से बचें। (Supernatants कोशिकाओं से जारी किया गया था कि चिमेरिक पेप्टाइड द्वारा एन पी वाय-mRFP होते हैं)।
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 0.5% ट्राइटन X-100 युक्त 200 μl Tyrode बफर जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। (यह कदम कोशिकाओं से जारी नहीं किया गया है कि NPY-mRFP के शेष होते हैं कि सेल lysates की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है)। सेल lysates लीजिए और एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण, बर्फ पर जगह और प्रकाश से बचें।
  6. एक fluoresc का उपयोग करते हुए सेल supernatants और सेल lysates की प्रतिदीप्ति उपायखिलाडि़यों प्लेट रीडर, एक 590-, 20 एनएम बैंडविड्थ उत्तेजना फिल्टर और 635-, 35 एनएम बैंडविड्थ उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर।
  7. जारी की NPY-mRFP के प्रतिशत की गणना:
    नोट: प्रतिदीप्ति पाठक उपाय मनमाना प्रतिदीप्ति इकाइयों (AFU)। AFU मूल्यों मशीन और इसकी संवेदनशीलता और अभिकर्मक दक्षता पर निर्भर करते हैं।
    1. के रूप में रिक्त nontransfected आरबीएल कोशिकाओं के autofluorescence सेट करें। कुल प्रतिदीप्ति करने के लिए प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला के AFU (supernatants इसी lysate के + AFU की AFU) फूट डालो और 100 से गुणा करना।

एक्सोसाइटोसिस 6. समय चूक माइक्रोस्कोपी

  1. एक 8 अच्छी तरह चैम्बर borosilicate coverglass प्रणाली में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं / चैंबर के 7.5 × 10 4 बीज। 18-24 घंटा के बाद, कक्षों से मध्यम संस्कृति को हटाने और Tyrode बफर के साथ तीन बार धोने
  2. प्रत्येक कक्ष के लिए Tyrode बफर के 72 μl जोड़ें। 10x एकाग्रता के लिए Tyrode बफर में सक्रिय अभिकर्मकों पतला।
    3. <ली> एक गर्म चैम्बर (37 डिग्री सेल्सियस) और सीओ 2 नियंत्रक (4.8%) और एक 40x या 63X उद्देश्य से लैस एक confocal प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करें। माइक्रोस्कोप सिस्टम पर मुड़ें: पारा दीपक, कंप्यूटर, और पराबैंगनीकिरण। गर्म चैम्बर प्रयोग शुरू करने से पहले सही तापमान पर है कि सुनिश्चित करें।
  3. गर्म कक्ष में चैम्बर जगह और चैम्बर सही ढंग से और स्थिर स्थापित किया गया है कि यह सुनिश्चित कर लें।
  4. प्रासंगिक फ्लोरोफोरे के अनुसार प्रतिदीप्ति प्रकाश पर बारी और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कल्पना। ब्याज की एक सेल विरंजन और cytotoxicity को कम करने के क्रम में क्षेत्र में एक बार प्रतिदीप्ति बंद करें। यह इस क्षेत्र के बारे में 2-3 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में शामिल होंगे कि महत्वपूर्ण है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में अच्छी तरह से फैला हुआ है, लेकिन एक दूसरे को छू नहीं किया जाना चाहिए।
  5. शोर और oversaturation के रूप में अच्छी तरह से विषाक्तता को कम से कम करने के लिए (माइक्रोस्कोप के आधार पर) लेजर बिजली समायोजित करें, और लाभ की स्थापना की और शोर अनुपात करने के लिए संकेत को संशोधित करने के लिए ऑफसेट। में तेजी से स्कैन याडेर लेजर प्रदर्शनी (औसत 2) की अवधि को कम करने के लिए।
  6. इस लेजर शक्ति घटते सक्षम बनाता है, एक अधिकतम करने के पिनहोल आकार समायोजित करें और समय की एक लंबी अवधि के लिए ध्यान केंद्रित छवियों बनाए रखने के लिए। अगर वांछित जेड ढेर में दो आयामी confocal ऑप्टिकल स्लाइस की तीन आयामी, शोर अनुपात करने के लिए सबसे अच्छा संकेत देता है कि एक हवादार इकाई (एयू) के लिए पिनहोल आकार को समायोजित करने और अधिग्रहण लगातार स्कैनिंग में छवि को फिर से संगठित करने के लिए, मानकों सेट ऑप्टिकल स्लाइस ≤0.7 माइक्रोन से Z -axes।
  7. 15-30 सेकंड के लिए प्रत्येक अधिग्रहण और 15 मिनट के लिए कुल अधिग्रहण की अवधि के बीच अंतराल समय निर्धारित करने और छवियों को प्राप्त करने लगते हैं। अधिग्रहण के 5 मिनट के बाद समय श्रृंखला को थामने। 10x ट्रिगर के 8 μl जोड़ें और तुरंत अधिग्रहण जारी है।
  8. , चित्र सहेजें एक deconvolution के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर deconvolution के प्रदर्शन और तीन आयामी छवियों और Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक फिल्म के लिए ढेर के पुनर्निर्माण।

  1. Imaris सॉफ्टवेयर करने के लिए confocal प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा प्राप्त किया गया है कि deconvoluted समय श्रृंखला छवियों से डेटा आयात करें। यह सॉफ्टवेयर 40 से अधिक माइक्रोस्कोपी फ़ाइलें पढ़ता है। सॉफ्टवेयर फ़ाइलों को नहीं पढ़ सकते हैं; TIF फ़ाइलें और आयात करने के लिए फ़ाइलों को परिवर्तित।
  2. एक खुले डेटा सेट प्रेस संपादित के अंत करने के लिए समय अंक जोड़ने के लिए -> सेट नए डेटा समय बिंदुओं को जोड़ें और आयात करते हैं।
  3. सतह जादूगर विकल्प का उपयोग mRFP चैनल की सतह बनाएँ। डिफ़ॉल्ट कलन विधि चुनें। द्वारा एन पी वाय-mRFP के चैनल चुनें। शोर को कम करने के लिए समरेखण विकल्प निशान। छोटे विवरण 0.05 माइक्रोन के लिए क्षेत्र के विस्तार के स्तर को कम करने के नुकसान से बचने के लिए।
  4. तीव्रता दहलीज निर्धारित करें। नई ग्रे सतह प्रदर्शित किया जाएगा। "सेटिंग्स" के लिए जाओ और "केंद्र बिंदु" के लिए "भूतल" से शैली स्विच।
  5. , चयनित वस्तु के गुणों में आंकड़ा टैब पर जाएं विस्तृत टैब और विशिष्ट मूल्य सफलता का चयनप्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में एच, मात्रा आदि
  6. डेटा की समीक्षा करें और मूल्यों छवियों के साथ संगत कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि। उदाहरण के लिए, दो या अधिक आसन्न कणिकाओं एक बड़ा छोटा दाना के रूप में मापा जा सकता है। औसत दाना आकार बढ़ाता के लिए कणिकाओं की वास्तविक संख्या को विलय granules के आकार विभाजित करते हैं।
  7. एक्सेल फाइल करने के लिए वांछित डेटा सेट निर्यात और डेटा का विश्लेषण।
एफ

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Representative Results

क्योंकि MCs के कम अभिकर्मक दक्षता की, आनुवंशिक जोड़तोड़ अंतर्जात एसजीएस मध्यस्थों द्वारा मापा औसत स्राव के readouts पर एक प्रभाव छोड़ने के लिए संभावना नहीं है। फिर भी, विशेष रूप से ब्याज की जीन व्यक्त करता है कि सेल की आबादी की निगरानी में रिपोर्टर जीन द्वारा एन पी वाय-mRFP का पूरा सह अभिव्यक्ति और एक ही कोशिकाओं पर सह ट्रांसफ़ेक्ट प्लाज्मिड, NPY-mRFP परिणामों की निगरानी की स्थापना के द्वारा। इसलिए, पारंपरिक तरीकों की तुलना में इस परख का लाभ चुनिंदा आनुवंशिक रूप से चालाकी से कोशिकाओं (चित्रा 1) की निगरानी करने की क्षमता है।

दरअसल, हम घुलनशील है NSF [एन ethylmaleimide संवेदनशील संलयन] लगाव प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन और रब GTPases परिवार के 44 सदस्यों सहित vesicular तस्करी को नियंत्रित करने वाले जीन की जांच की है इस परख का उपयोग कर। हम SGsize, संख्या, कार्गो संरचना और एक्सोसाइटोसिस 23 विनियमित कि जीन की पहचान की।

डब्ल्यूई 30 Rabs पहचान की है कि बदल (यानी, रोकना या उत्तेजित) या तो एजी द्वारा या एक सीए 2 + ionophore के संयोजन और phorbol एस्टर टीपीए (आयन / टीपीए) 23 से प्रेरित आरबीएल कोशिकाओं में एक्सोसाइटोसिस। Confocal इमेजिंग कोशिकाओं या एसजीएस 30,32 की आकृति विज्ञान फेरबदल नाटकीय phenotypes के कारण होता है कि फन्दे और Rabs का पता चला। इन प्रोटीनों की confocal इमेजिंग कोशिकाओं या एसजी आकृति विज्ञान 30,32 पर नाटकीय phenotypes के कारण होता है कि 8 फन्दे और Rabs का पता चला। इस प्रोटोकॉल का उपयोग हम व्यक्तिगत एसजीएस ट्रैक और उनके आकार, प्रतिदीप्ति तीव्रता, उनके आंदोलन और एक्सोसाइटोसिस के मापन प्रदर्शन करने में सक्षम थे। उदाहरण के लिए, हम एसजी जीवजनन 30 की एक नियामक के रूप में Rab5 की पहचान की। Rab5 endocytosis और endosomal फ्यूजन 24 के एक मास्टर नियामक के रूप में पहचान की गई है। हम अनिवार्यता से नकारात्मक (सीएन) सकल घरेलू उत्पाद बंद Rab5 की endogenously व्यक्त isoforms की म्यूटेंट (Rab5A, Rab5B और Rab5C), या ई की है कि सह अभिव्यक्ति से पता चला हैshRNAs को लक्षित Rab5A / बी / सी, की है xpression उनकी संख्या 30 में एक सहवर्ती वृद्धि के साथ काफी एसजीएस 'आकार कम कर दिया। इसके विपरीत, एक जीटीपी बंद, अनिवार्यता से सक्रिय (सीए) Rab5A उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति (Rab5A Q79L, इस के साथ साथ: "सीए Rab5A") जल्दी endosomes की homotypic संलयन (EEs) 24 सुविधाजनक बनाने के लिए जाना जाता है, जो विशाल के गठन में हुई हम उनके स्रावी कार्गो द्वारा एन पी वाय-mRFP की सामग्री और सेरोटोनिन, और एक विनियमित फैशन 30 में exocytose करने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर एसजीएस रूप में पहचान की है, जो Rab5A सजाया पुटिकाओं,।

चित्रा 2 द्वारा एन पी वाय-mRFP युक्त एसजीएस की morphometric विश्लेषण दर्शाता है। सीए Rab5A व्यक्त कोशिकाओं में मतलब एसजीएस मात्रा> नियंत्रण GFP- व्यक्त उनकी संख्या 20 गुना की कमी हुई थी, जबकि कोशिकाओं (चित्रा में एसजीएस का मतलब मात्रा से बड़ा 20 गुना था जो 44 माइक्रोन 3 के मूल्य पर पहुंच गया 2A)। उलटा रिश्तासंख्या और एसजीएस (2A चित्रा) के आकार के बीच एसजीएस की Rab5 की मध्यस्थता इज़ाफ़ा उनके homotypic संलयन शामिल है का सुझाव दिया। सीए Rab5A द्वारा गठित एसजीएस युक्त विशाल द्वारा एन पी वाय-mRFP अन्यथा संभव नहीं हो सकता है कि विवरण में एसजीएस निगरानी में सक्षम बनाता है कि एक उच्च संकल्प में जीवित कोशिकाओं के confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, हम सबसे अधिक संभावना है, विशाल एसजीएस के बीच बिखरे हुए छोटे संरचनाओं के साथ एसजीएस fusing endosomes (चित्रा 2 बी) के लिए इसी में Rab5A का पता चला। इसके अतिरिक्त, हम पता चला है नवगठित एसजीएस साथ Rab5A के चुनिंदा और क्षणिक एसोसिएशन केवल नव सृजित कणिकाओं अन्य एसजीएस 30 के साथ फ्यूज करने की क्षमता है, जिसमें एक fusogenic तंत्र के साथ संगत है, सुझाव है कि नवगठित एसजीएस साथ Rab5 क्षणिक और बेहतर एसोसिएट्स कि।

चित्रा 3 सीए की अभिव्यक्ति द्वारा गठित किया गया है कि एम सी विशाल एसजीएस के प्रतिनिधि समय चूक छवियों से पता चलता हैRab5A और उत्तेजना के बाद एक भी एसजी के संकल्प में एक्सोसाइटोसिस के कैनेटीक्स। एम सी एक्सोसाइटोसिस के दौरान, एसजीएस की ओर बढ़ने और प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज। एक परिणाम के रूप में स्रावी कार्गो बाह्य अंतरिक्ष में कोशिकाओं से जारी है। इस प्रायोगिक प्रणाली में, NPY-mRFP कोशिकाओं से जारी है और कोशिकाओं supernatants में पाया। सेल supernatants में NPY-mRFP के प्रतिदीप्ति एक प्रतिदीप्ति पाठक द्वारा मापा जा सकता है। द्वारा एन पी वाय-mRFP supernatants में पतला है क्योंकि हालांकि, इसकी प्रतिदीप्ति संकेत का पता चला या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना नहीं की जा सकती। द्वारा एन पी वाय-mRFP प्रतिदीप्ति तीव्रता और NPY-mRFP युक्त एसजीएस और उनके disappearance.Therefore, उत्तेजित कोशिकाओं और NPY के माप का जीना सेल इमेजिंग का संकोचन में एक तेजी से और नाटकीय कमी में एक्सोसाइटोसिस परिणाम के दौरान कणिकाओं से NPY-mRFP की रिहाई -mRFP प्रतिदीप्ति तीव्रता या NPY-mRFP युक्त एसजी आकार की एक्सोसाइटोसिस के कैनेटीक्स का सटीक आकलन प्रदान करते हैंव्यक्तिगत कणिकाओं। 3B चित्रा एक सीए 2 + Ionophore के साथ कोशिकाओं उत्तेजक बाद एसजीएस की प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है। प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज नहीं था कि एक एकल एसजी की प्रतिदीप्ति तीव्रता निरंतर बनी जबकि एसजीएस, अलग अलग समय बिंदुओं (यानी, 2, 3, 6, और 11 मिनट के पद उत्तेजना) में एक्सोसाइटोसिस गुज़रना पड़ता है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। प्रोटोकॉल का मुख्य चरणों का चित्रण आरबीएल कोशिकाओं द्वारा एन पी वाय-mRFP और ब्याज या नियंत्रण प्लाज्मिड इसी की एक दूसरी जीन के साथ cotransfected और तुरंत coverslips, 8 अच्छी तरह चैम्बर borosilicate coverglass प्रणाली या 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। अगले दिन, विश्राम में NPY-mRFP युक्त एसजीएस की छवियां और ट्रिगर कोशिकाओं confocal माइक्रोस्कोपी (ए) के द्वारा अर्जित कर रहे हैं। Restin के अलावा, एक्सोसाइटोसिसजी एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रतिदीप्ति पाठक (बी) में NPY-mRFP की रिहाई को मापने के द्वारा मात्रा cellsis और ट्रिगर।

चित्रा 2
चित्रा 2:। एसजीएस 'आकार की मात्रा आरबीएल कोशिकाओं द्वारा एन पी वाय-mRFP और GFP या तो या GFP-सीए Rab5A साथ cotransfected और 8 अच्छी तरह चैम्बर borosilicate coverglass प्रणाली पर वरीयता प्राप्त थे। 24 घंटा बाद में, 8 अच्छी तरह चैम्बर लेजर confocal खुर्दबीन सुसज्जित गर्म चैम्बर (37 डिग्री सेल्सियस) में रखा गया था। ऑप्टिकल स्लाइस 0.7 माइक्रोन के साथ लगातार छवियों के Z ढेर छवियों एक 63X तेल / 1.4 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया था। छवियों deconvoluted गया और तीन आयाम छवियों Imaris सॉफ्टवेयर के द्वारा निर्माण किया गया। एसजीएस और उनकी संख्या की मात्रा Imaris सॉफ्टवेयर (ए) का उपयोग कर की गणना की गई। द्वारा एन पी वाय-mRFP युक्त Granu का हिस्सा हैलेस Rab5A (तीर) के भीतर एम्बेडेड प्रतीत होता है। दूसरों को नग्न या Rab5A (तीर) के साथ पाटने हैं। स्केल बार = 5 माइक्रोन (बी)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3:। ActivatedRBL कोशिकाओं में एक भी एसजी के संकल्प में किस हद तक और एक्सोसाइटोसिस के कैनेटीक्स माप आरबीएल कोशिकाओं द्वारा एन पी वाय-mRFP और GFP-सीए Rab5A और वरीयता प्राप्त in8 अच्छी तरह चैम्बर borosilicate coverglass प्रणाली के साथ cotransfected थे। 24 घंटा बाद में in8 अच्छी तरह चैम्बर एक गर्म चैम्बर (37 डिग्री सेल्सियस) से लैस एक लेजर confocal खुर्दबीन में रखा गया था और कोशिकाओं 10 माइक्रोन सीए 2 + Ionophore के साथ शुरू हो गया। छवियाँ एक 63X तेल / 1.4 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग हर 15 सेकंड का अधिग्रहण किया गया था। इमेजिसdeconvoluted और फिर Imaris सॉफ्टवेयर से प्रोसेस किया गया। स्केल बार = 5 माइक्रोन (ए)। द्वारा एन पी वाय-mRFP युक्त कणिकाओं के मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता Imaris सॉफ्टवेयर के द्वारा निर्धारित किया गया था और डाटा समय 0 (सीए 2 + Ionophore के अलावा के समय) के अनुसार सामान्यीकृत थे। तीर SGcargo की रिहाई wasnoted, जिस पर समय अंक (बी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम एक्सोसाइटोसिस के लिए एक पत्रकार जीन का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में एसजीएस की समय-व्यपगत तीन आयामी इमेजिंग द्वारा MCs के एक्सोसाइटोसिस और चार (एक्स, वाई, जेड, टी) आयाम quantifications की मात्रा का ठहराव को जोड़ती है कि एक अभिनव रणनीति का वर्णन है। इस तकनीक के रूप में जल्दी उनकी परिपक्वता के माध्यम से गोल्गी से उनके बाहर निकलने, एक्सोसाइटोसिस क्षमता और degranulation के अधिग्रहण के रूप में शुरू में इस तरह की निगरानी एसजीएस के रूप में एम सी समारोह पर उनके प्रभाव के लिए प्रोटीन के परिवारों की स्क्रीनिंग के लिए सक्षम बनाता है। एक साथ एसजीएस की morphometric और गतिज अभिलक्षण साथ एक्सोसाइटोसिस के मापन के संयोजन का परीक्षण प्रोटीन एम सी कार्यों मध्यस्थता जिसके द्वारा तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसलिए, इस पद्धति का उपयोग कर, लक्षित जीन की आनुवंशिक हेरफेर एम सी एसजीएस की दुकान और उनके कार्गो जारी है जिसके द्वारा नए आणविक तंत्र का अनावरण कर सकते हैं। विशेष रूप से, NPY ऐसे MCF 7 कोशिकाओं, एक सेल लाइन निकाली गई fr के रूप में अन्य स्रावी कोशिकाओं में एक्सोसाइटोसिस के लिए एक पत्रकार के रूप में काम कर सकते हैंओम एक मानव स्तन ग्रंथि ग्रंथिकर्कटता 31 क्रोमाफिन कोशिकाओं 34 और अग्नाशय β-कोशिकाओं को 35।

आनुवंशिक जोड़तोड़ कार्यात्मक नेटवर्क पर शोध के लिए वर्तमान में उपलब्ध सबसे शक्तिशाली उपकरण हैं। जिसका विलोपन समानांतर नेटवर्क के बीच crosstalk लागू या अतिरेक के कारण कोई प्रभाव नहीं पड़ेगा अन्य प्रोटीन, विरोध के रूप में आनुवंशिक जोड़तोड़, जिसका विलोपन प्रणाली के पतन को लागू करेंगे प्रत्येक नेटवर्क में आवश्यक प्रोटीन की पहचान की अनुमति। हालांकि, क्योंकि MCs के कम अभिकर्मक दक्षता की, केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश 'जोड़ तोड़' परीक्षण डीएनए व्यक्त करते है अंतर्जात मध्यस्थों की एक्सोसाइटोसिस जब मापने। अंतर्जात मध्यस्थों की एक्सोसाइटोसिस मापने इसलिए, जब कुल readout के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का योगदान मामूली है। इसलिए, इस तरह के दृष्टिकोण को अपनाने के लिए प्रयास कर MCs में विनियमित एक्सोसाइटोसिस के साथ जुड़े जटिल नेटवर्क का पता लगाने के लिए किया गया था हाmpered। इस तकनीक को कम अभिकर्मक दक्षता की बाधा पर काबू पा और अभिव्यक्ति, पछाड़ना और ब्याज की जीन की उत्परिवर्तजनन से अधिक की वजह से एम सी एसजीएस की प्ररूपी alternations के निरीक्षण करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है।

इस तकनीक को क्षणिक ट्रिपल अभिकर्मक का उपयोग कर कार्यात्मक नेटवर्क की बातचीत के पदानुक्रम और मोड की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है। परिणाम एक निश्चित फेनोटाइप बचाव कर सकते हैं जो जीन निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जाएगा; एक अधिक नाटकीय phenotype के कारण या कोई प्रभाव नहीं है। ऐसे मिश्रित transfections के आधार पर, एक्सोसाइटोसिस नेटवर्क का निर्माण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्रिपल अभिकर्मक का उपयोग कर हम Rab5 निर्भर एसजी फ्यूजन 25 करने की प्रक्रिया में एक बहाव के मध्यस्थ के रूप में जाल प्रोटीन VAMP8 की पहचान करने में सक्षम थे।

इस विधि एकल एसजीएस के संकल्प में दृश्य और एक्सोसाइटोसिस की मात्रा का ठहराव परमिट। दरअसल हम एसजीएस प्रदर्शन अंतर प्रतिक्रियाओं Stim को दिखाने के लिए कि सक्षम थेUli। दूसरों को नहीं किया है या एम सी एसजी फ्यूजन का अंतर है कैनेटीक्स के लिए कारण है, जबकि प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े हुए कुछ एसजीएस रहना के रूप में क्यों कारण निर्धारित किया जाना है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य के अध्ययन के लिए इन सवालों के जवाब देने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न फन्दे या व्यक्तिगत एसजीएस पर Rabs और एक्सोसाइटोसिस क्षमता के साथ संबंध है और एक भी एसजी के संकल्प में एक्सोसाइटोसिस के कैनेटीक्स की मात्रा का ठहराव एक्सोसाइटोसिस के उपन्यास नियामकों प्रकट करना चाहिए।

इस तकनीक का मुख्य सीमा एक प्रोटीन की overexpression सेल समारोह या आकृति विज्ञान प्रभावित हो सकती है क्योंकि आनुवंशिक हेरफेर है। इसलिए, यह पूरक दृष्टिकोण के साथ परिणामों को मान्य करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, एक अनिवार्यता से सक्रिय उत्परिवर्ती की overexpression एक्सोसाइटोसिस, एक विधान नकारात्मक उत्परिवर्ती के प्रभाव को रोकता है या जीन के नीचे दस्तक के रूप में जब अच्छी तरह से जांच की जानी चाहिए।

इस तकनीक का उपयोग करना, हम identifएम सी एक्सोसाइटोसिस प्रभावित या एसजी आकृति विज्ञान बदल जो एम सी कार्यों का आइईडी उपन्यास नियामकों। एसजीएस morphometric लक्षण वर्णन के साथ मिलकर एक्सोसाइटोसिस माप के संयोजन गहरी समारोह में अंतर्दृष्टि और परीक्षण प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र प्रदान करता है।

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Acknowledgments

हम NPY-mRFP सीडीएनए के उपहार के लिए डॉ यू Ashery धन्यवाद। हम डीआरएस धन्यवाद। एम.जे. Kofron, एल Mittleman, एम Shaharbani, और माइक्रोस्कोपी के साथ अमूल्य सहायता के लिए वाई Zilberstein और छवि विश्लेषण करती है। हम भी इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ यूसुफ ओरली धन्यवाद। इस काम के विज्ञान के लिए इसराइल अकादमी द्वारा स्थापित इसराइल विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (1139-1112 रुपये ई।)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

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References

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

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Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

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