Summary
Målet med den foreliggende protokollen var å utvikle en metode som gjør at funksjonelle genomiske analyser av mast celle sekresjon. Protokollen er basert på kvantitativ vurdering av frigivelsen av et fluorescerende reportergen cotrasfected med genet av interesse og sanntids analyse av den sekretoriske granuler sin morfologi.
Abstract
Mastceller (MC) er sekretoriske celler i immunsystemet som oppnår deres fysiologiske og patologiske funksjoner ved å slippe pre-dannet og nylig syntetiserte allergiske, inflammatoriske og immunmediatorer. MCS 'meklere påvirker flere vev og organer som kulminerte i allergiske og immunresponser. Syntese, lagring og frigjøring av MC meklere er sterkt regulert. De forhånds dannet meklere er pakket i cytoplasmatiske sekresjonsgranuler (SG) som blandes med plasmamembranen og slipper sitt innhold av regulerte eksocytose. Vi presenterer en protokoll, basert på co-uttrykket av et gen av interesse med en reporter gen som er målrettet mot SGS og er utgitt i et regulert mote sammen med de endogene SG meklere. Protokollen gir høy oppløsning fire dimensjonale konfokal analyser av MC SGS og overvåke deres tidslinje fra biogenese til utløst eksocytose. Dermed bruker denne protokollen for screening gener av interest for deres fenotypiske og funksjonell innvirkning lar forklaring på de molekylære mekanismene som styrer biogenese og eksocytose av MC SGS og identifisere regulatorer involvert. Dermed bør ytterligere innsikt i de cellulære mekanismene som står for MCs funksjon i helse og sykdom gis.
Introduction
Mastceller (MC) er immunceller som er best kjent for sitt engasjement i allergiske og betennelsesreaksjoner som leddgikt, astma, eosinofil øsofagitt, kronisk eksem og anafylaktisk sjokk 1,2 samt andre patologier inkludert koronarsykdom 3,5 og kreft 3,4. I tillegg MCs spiller viktige roller i medfødt og adaptiv immunitet, både i verts forsvar mot bakterier og parasitter og ved undertrykkelse av immunresponser, for eksempel indusere allograft toleranse 5,6.
MCs stammer fra benmargen, utvikling fra CD34 + / CD117 + pluripotente stamceller 7. Forpliktet benmargs MC stamfedre er sluppet ut i blodet og migrere inn i de perifere vev lokalisering hovedsakelig innen bindevev og epiteliale overflater 8. Modning og terminal differensiering blir til slutt oppnådd under påvirkning of cytokiner innenfor det omkringliggende miljø 8,9.
MCS kan aktiveres ved et allergen (antigen, Ag), som støter resultert i generering av immunoglobulin E (IgE) type antistoffer. Binding av et slikt IgE til FceRI MC s reseptorer, fulgt av tverrbinding av cellebundet IgE ved re-eksponering av det samme Ag, resulterer i FceRI aggregering og initiering av en signalkaskade som kulminerer i cellen degranulering [gjennomgått i 10,11] . MCS er også aktiveres uavhengig av IgE, av neuropeptider 5,12, toksiner 13, bakterielle og virale antigener 14,15, et antall positivt ladede peptider kollektivt referert til som basis sekretagoger, immunceller og cytokiner 5,13,12,16 , 17. MCS blir også aktivert ved mange av sine egne frigitte mediatorer, noe som ytterligere forsterker den inflammatoriske respons.
MCs er fullpakket med sekresjonsgranuler (SGS) som inneholder immunregulatoriske mediatorer, inkludert vasoaktive aminer, slik som histamin og serotonin (i gnagere), proteoglykaner, proteaser, slik som chymase og tryptase, vaskulær endotelial vekstfaktor og flere cytokiner og kjemokiner 8,9. Disse meklere er "klar til å gå" og når MCs aktiveres av en passende stimulus, er disse meklere frigjøres fra celler ved regulert eksocytose (degranulation) i løpet av noen sekunder til minutter 18,19. Denne første hendelse blir fulgt av de novo syntesen og frigivelse av en stor mengde biologisk potente substanser, inkludert arachidonsyremetabolitter, flere cytokiner og kjemokiner 20,21,22. Utgivelsen av nye syntetiserte produkter oppstår uavhengig av SG release. Sammen er disse meklere starte tidlig og sen fase inflammatoriske og allergiske reaksjoner. Derfor forstå mekanismene regnskap for MC-aktivering og degranulation er både av teoretisk og klinisk importance.
Vanskelig til genetisk manipulere primære og kultiverte MCs har hemmet forsøkene på å belyse mekanismene bak MC degranulation, som forble dårlig løst. For å overvinne dette problemet vi utviklet en reporter baserte analysen av co-trans slimhinnene mastcellelinje, Rottebasofile leukemi (RBL) -2H3 (heretter omtalt som RBL) eller benmarg avledet MCs (BMMCs) 30 med et gen av interesse og neuropeptid Y (NPY) fusjonert til monomert RFP (mRFP), som en SG reporter.
NPY ble tidligere vist å rekapitulere oppførselen av endogene SG markører i andre systemer. Videre, på grunn mRFP fluorescens er pH-ufølsomt, ekspresjon av NPY-mRFP tillater visualisering av de sure SG samt kvantitativ vurdering av exocytose ved bruk av 96-brønners plater og en fluorescens plateleser. Vi har vist at NPY-mRFP leveres til de sure SGS RBL celler og BMMCs og frigjøres fra cellenei et regulert mote langs den endogene SG last (dvs. β-heksosaminidase og serotonin) 30, 32. Denne protokollen gir en høy oppløsning bildebasert metodikk som gjør at screening gener av interesse for deres fenotypiske og funksjonell innvirkning på SG egenskaper og degranulation i RBL celler 32. Spesielt, tillater denne protokollen sanntid sporing av MC SG og kvantifisering av sitt område eller volum størrelse, deres antall, kinetikken for montering, deres bevegelse langs cellens cytoskjelett og deres endelige fusjon med plasmamembranen under forskjellige forhold. For eksempel sensibiliserende cellene med DNP-spesifikk IgE og utløser cellene med et flerverdig Ag (DNP konjugert serumalbumin) under forskjellige forstyrrelser (dvs. knockdown av gener som er av interesse, i forhold til ekspresjon av WT eller muterte gener, eller farmakologiske manipulasjoner) og sammenligne å styre celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av RBL Cell Culture Media
- Bland 500 ml lav glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 56 ml føtalt bovint serum (dette gjør 10% FBS), og deretter legge til 5,5 ml penicillin streptomycin (dette gjør ~ 1% PEST).
- Filtrere media ved å bruke 500-1000 ml flaske-Top Vakuum filtre med 0,22 mikrometer porestørrelse og oppbevares ved 4 ° C.
2. Culture of RBL Cells
- Vokser RBL celler i en fuktet atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C i enten plater eller kolber. RBL celler som vokser i 10 cm plater bør suppleres med 10 ml medium og danne konfluent enkeltlag av ~ 10 7 celler / plate.
- Når cellelaget nærmer konfluens, replate kulturen til en lavere tetthet.
- Fjerne kulturmediet fra platen / kolbe ved anvendelse av en steril Pasteur-pipette koblet til vakuum.
- Skyll cellemonolag med prewarmed (37° C) 0,25% trypsin / EDTA som dekker hele monolag (volumet er avhengig av størrelsen på kulturplaten / kolbe; 2 ml til 10 cm plate). Dette vil løsne cellene.
- Alternativt, skyll cellemonolag med Phosphate saltvann (PBS), fjerne PBS og legge prewarmed (37 ° C) trypsin / EDTA. Dette trinnet løsner cellene raskere.
- Sett platen / kolbe i en inkubator ved 37 ° C (ikke mer enn 10 min).
- Inspisere cellene under optisk mikroskop for å undersøke om de har frittliggende. Hvis cellene ikke løsner etter 10 min, banke forsiktig på plate / kolbe.
- Legg medium til kulturplate / kolben for å suspendere cellene (volumet av mediet bør være minst to ganger større enn volumet av den trypsin-oppløsning).
- Pelletere cellene ved sentrifugering i 3 minutter ved 200 g ved 25 ° C.
- Resuspender cellene i mediet. Fortynne cellene ved 01:10 og frø i en ny kultur parabolen. Cellene inkuberes i 48-72 timer, inntil de Reach tilnærmet 90% konfluens.
- Gjenta samme prosedyre (avsnitt 2.2.1-2.2.8) i inntil 3 måneder (30 passasjer).
3. Utarbeidelse av Transfeksjon Media.
- Forberede en 100 mM løsning av K-Rør pH 7, 1 mM løsning av Ca 2+ acetat og 100 mM løsning av Mg 2+ acetat.
- Fortynn 100 mM løsning av K-rør pH 7 til 20 mm ved bruk av DMEM medium, tilsett 1 mM oppløsning av Ca 2+ acetat til en sluttkonsentrasjon på 10 mM og 100 mM løsning av Mg2 + acetat til en sluttkonsentrasjon på 2 mM.
- Vei kalium glutamat og legge til løsningen til en sluttkonsentrasjon på 128 mM, bland godt og holde ved 4 ° C inntil bruk. Hold de resterende løsninger (dvs., K-Rør, Ca 2+ acetate, Mg 2+ acetate) ved -20 ° C.
4. Transfeksjon av RBL Cells
- Fjerne kulturmediet fra platen / kolbe ved anvendelse av ensteril Pasteur pipette koblet til vakuum.
- Rens cellenes monolag med forvarmet (37 ° C) trypsin / EDTA som skal dekke hele monolag. Sett platen / kolbe i en inkubator ved 37 ° C (ikke mer enn 10 min). Sjekk om cellene har frittliggende, ved hjelp av optisk mikroskop.
- Legg medium til kulturplate / kolben for å suspendere cellene (volumet av mediet bør være i det minste 2-større mer enn volumet av den trypsin-oppløsning).
- Telle celle nummer hjelp hemocytometer.
- Pellet 1,5 x 10 7 celler ved sentrifugering i 3 min ved 200 x g ved 25 ° C. Forkaste Supernatantene og legge 280 mL av transfeksjon medium. Overfør reaksjonsblandingen til 4 mm kyvette.
- Tilsett 20 ug av NPY-mRFP plasmid og enten 30 ug av kontroll tomt plasmid eller en testet plasmid. Det endelige volum av reaksjonsblandingen bør være 300 ul.
- Umiddelbart plassere på is i 10 min. Tørk kyvetten fra restvann og proceed til elektroporering ved 300 V for 9 msek.
- For målinger av exocytose, replate cellene umiddelbart i 24 brønners vevskulturskåler inneholdende 300 ul medium. Legg 8 pl av reaksjonsblanding (4 x 10 5 celler) til hver brønn. Legg 4 × 10 5 ikke transfekterte celler til ytterligere brønner for kontroll. Forbered nok brønner for å ha minst duplikatbrønner for hver behandling for hver transfeksjon.
- For tiden lapse mikroskopi, replate cellene umiddelbart i en 8-brønn kammer borosilikat dekkglass system som inneholder 80 mL medium. Tilsett 1,5 pl av reaksjonsblanding (7,5 x 10 4 celler) til hvert kammer. (Prøv å unngå å bruke kamrene på kanten av dekkglass, kamrene i sentrum av dekkglass er lettere å bilde).
MERK: Viktigere, ikke alle cellene respons på en utløser og tidvis time-lapse mikros oppheves på grunn av tap av fokus og drift av 8-vel kammer borosilicate dekkglass system. Derfor fremstille minst åtte kamre for hver behandling for hver transfeksjon. - For sensibiliserende cellene for FceRI-formidlet aktivering, tilsett 1 ug / ml av muse-DNP spesifikt monoklonalt IgE til mediet (inkubere cellene med IgE i minst 2 timer).
- Etter 18-24 timers bruk en fluorescerende mikroskop for å bekrefte at cellene uttrykker plasmider. Magnetisering og utslippsbølgelengder av mRFP fluorescens er: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-mRFP skal vises i vesikulær strukturer som tilsvarer SGS. Hvis det andre genet av interesse blir sammensmeltet til en fluorescerende tag bruke et fluorescerende mikroskop for å bekrefte ko-ekspresjon av begge plasmider på de samme celler. For eksempel, hvis den testede genet er kondensert til GFP, The eksitasjons- og emisjonsbølgelengder av GFP fluorescens er: λEx 488, λEm 507 nm. GFP tagget protein skal vises på de samme cellene som uttrykker NPY-mRFP.
- For eksocytose målinger fortsette to trinn 5 og for tiden lapse mikroskopi, går du videre til trinn 6.
5. Måling NPY-mRFP eksocytose
- Utarbeidelse av Tyrode buffer:
- Forbered en løsning av 54 mM KCl, 20 mM MgCI2, 2,74 M NaCl og 8 mm NaH 2 PO 4 i DDW. Bland godt og oppbevar ved 4 ° C. Dette trinnet er for utarbeidelse av 20x Tyrode buffer.
- Fremstille en løsning av 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM glukose og 1 til 20 fortynning av Tyrode 20x i DDW og bland godt. Dette trinnet er for utarbeidelse av 1x Tyrode buffer.
- Delmengde 1x Tyrode buffer og oppbevares ved -20 ° C. Unngå gjentatt frysing og tining.
- Fjerne dyrkningsmediet fra 24 brønn plate og vaskes tre ganger med Tyrode-buffer. Forbered ustimulerte celler ved å legge 200 mL Tyrode buffer for å kontrollere brønner.
- Forbered 10 ul / brønn av 20X konsentrert aktiverende reagens [(for eksempel 1000 ng / mL DNP-BSA, eller DNP-HSA (Ag), 200 mM Ca 2+ ionofor (f.eks A23187), og en kombinasjon av 20 mM Ca2 + ionofor og 1000 nM 12-O- tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA)]. Hvis reagensene er lagret i DMSO, fortynnes reagensene inn 20x konsentrasjon i Tyrode-buffer inneholdende 1% DMSO. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
- Fjern supernatanten fra hver brønn forsiktig til en 96 brønners plate, plasser på is og unngå mot lys. (Supernatantene inneholde kimerisk peptid NPY-mRFP som ble løslatt fra cellene).
- Tilsett 200 ul Tyrodes buffer inneholdende 0,5% Triton X-100 til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. (Dette trinnet er viktig for utarbeidelse av cellelysater som inneholder de gjenværende av NPY-mRFP som ikke ble frigitt fra cellene). Samle cellelysater og overføre til en 96 brønners plate, legg på is og unngå fra lys.
- Måle fluorescensen av cellesupernatanter og cellelysater ved anvendelse av en fluorescerenderansen plateleser, ved hjelp av en 590-, 20 nm båndbredde eksitasjonsfilteret og 635-, 35 nm båndbredde utslipp filter.
- Beregne hvor stor andel av NPY-mRFP utgitt:
MERK: fluorescens leser tiltaket vilkår fluorescensenheter (AFU). AFU verdier avhenger av maskinen og dens følsomhet og transfeksjonseffektiviteten.- Still autofluorescence av nontransfected RBL celler som tomme. Dele AFU av hver supernatant til total fluorescens (AFU av supernatantene + AFU av tilsvarende lysatet) og multipliser med 100.
6. Time-lapse mikroskopi av eksocytose
- Seed 7.5 × 10 4 av transfekterte celler / kammer i en 8-brønn kammer borosilikat dekkglass system. Etter 18-24 timer, fjerne kulturmediet fra kamrene og vask tre ganger med Tyrode buffer
- Legg 72 mL av Tyrode buffer til hvert kammer. Fortynne aktiverings-midler i Tyrode buffer til 10x konsentrasjon. <li> Bruk en konfokal fluorescens mikroskop utstyrt med et oppvarmet kammer (37 ° C) og CO2-kontroller (4,8%) og en 40X eller 63X objektiv. Slå på mikroskopet systemer: kvikksølvlampe, datamaskin, og lasere. Sørg for at oppvarmet kammer er på riktig temperatur før du starter eksperimentet.
- Plasser kammeret i oppvarmet kammer og sørg for at kammeret er riktig installert og stabil.
- Slå på fluorescens-lys i henhold til den aktuelle fluoroforen og visualisere transfekterte celler. Slå av fluorescens når en celle av interesse er i feltet for å minimere bleking og cytotoksisitet. Det er viktig at dette feltet vil inneholde ca 2-3 transfekterte celler. De transfekterte cellene skal være godt spredt, men ikke berøre hverandre.
- Justere lasereffekten (avhengig av mikroskop) for å redusere støy og oversaturation samt toksisitet, og sette forsterkningen og offset for å modifisere signalet til støyforholdet. Skanne raskt i ellerder for å minimere varigheten av laser utstilling (gjennomsnittlig 2).
- Juster pinhole størrelse til et maksimum, dette gjør det mulig å redusere lasereffekten og for å opprettholde bilder fokusert i en lang tidsperiode. Dersom det er ønskelig, sett parametrene for Z bunken for å rekonstruere bildet i tre dimensjonal, justere pinhole størrelse til en luftig enhet (AU) som gir best signal til støyforhold og skaffe påfølgende skanning av to-dimensjonale konfokale optiske skiver i z -axes med optiske skiver ≤0.7 mikrometer.
- Sett intervall tid mellom hvert kjøp til 15-30 sek og varigheten av total oppkjøpet til 15 min og begynne å skaffe bilder. Etter 5 min av oppkjøpet pause tidsserien. Legg 8 mL av 10x trigger og fortsette oppkjøpet umiddelbart.
- Lagre bildene, utføre dekonvolvering bruker en dekonvolvering programvare og rekonstruere de stabler til tredimensjonale bilder og en film ved hjelp Imaris programvare.
- Importere data fra deconvoluted tidsseriebilder som ble innhentet av konfokal fluorescens mikroskop til Imaris programvare. Denne programvare leser mer enn 40 mikros filer. Hvis programvaren ikke kan lese filer; konvertere filene til tif-filer og import.
- For å legge til tidspunkter til enden av en åpen datasettet trykker redigere -> Legg til tidspunkter og importere de nye datasettet.
- Lag overflaten av mRFP kanal med overflate veiviser alternativet. Velg standard algoritme. Velg kanalen av NPY-mRFP. Markere alternativet utjevning for å redusere støy. For å unngå tap av små detaljer redusere arealet detaljnivået til 0,05 mikrometer.
- Still intensitet terskel. Ny grå overflaten vil bli vist. Gå til "Innstillinger" og bytte stilen fra "Center point" til "Surface".
- Gå til statistikken fanen i egenskapene for valgt objekt, velger du detaljert fanen og den spesifikke verdien such som fluorescens intensitet, volum etc.
- Gjennomgå data og bekreftet at verdiene er kompatible med bildene. For eksempel kan to eller flere tilstøtende granuler måles som en større granuler. For å kvantifisere den gjennomsnittlige kornstørrelse dele størrelsen på de fusjonerte granuler til det faktiske antall av granuler.
- Eksportere de ønskede datasettene til Excel-filer og analysere dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grunn av den lave transfeksjonseffektivitet av MCs, genetiske manipulasjoner er usannsynlig å forlate en innvirkning på avlesninger av gjennomsnittlig sekresjon målt ved endogene SG-meklere. Likevel, ved å etablere en oversikt ko-ekspresjon av reportergenet NPY-mRFP og ko-transfektert plasmid på de samme celler, overvåking av NPY-mRFP resultater i å overvåke utelukkende cellepopulasjonen som uttrykker genet av interesse. Derfor, er fordelen med denne analyse sammenlignet med konvensjonelle metoder evnen til selektivt å overvåke genetisk manipulerte celler (figur 1).
Faktisk, ved hjelp av denne analysen har vi vist gener som regulerer vesicular menneskehandel inkludert løselig NSF [N-etylmaleimid sensitive fusjon] vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner og 44 medlemmer av Rab GTPases familien. Vi identifisert gener som regulerer SGsize, antall, sammensetning av last og eksocytose 23.
We identifisert 30 Rabs som endres (dvs. inhibere eller stimulere) exocytose i RBL-celler stimulert med enten Ag eller av en kombinasjon av et Ca 2+ ionofor og forbolester TPA (Ion / TPA) 23. Konfokal bildebehandling avslørte snarer og Rabs som forårsaket dramatiske fenotyper forandre morfologi av cellene eller SGS 30,32. Konfokal avbildning av disse proteinene avslørt åtte snarer og Rabs som forårsaket dramatiske fenotyper på cellene eller SG morfologi 30,32. Ved hjelp av denne protokollen vi var i stand til å spore individuelle SGS og utføre målinger av deres størrelse, fluorescens intensitet, deres bevegelse og eksocytose. For eksempel har vi identifisert Rab5 som en regulator av SG biogenese 30. Rab5 har blitt identifisert som en mester regulator av endocytose og endosomal fusjon 24. Vi har vist at samtidig uttrykk for konstitutivt negative (CN) BNP-låst mutanter av endogent uttrykt isoformer av Rab5 (Rab5A, Rab5B og Rab5C), eller eXpression av Rab5A / B / C målretting shRNAs, redusert betydelig SGS 'størrelse med en samtidig økning i sine tall 30. Omvendt, ekspresjon av et GTP-låst, konstitutivt aktiv (CA) Rab5A mutant (Rab5A Q79L, heri: "CA Rab5A"), som er kjent for å lette fusjon av homotypisk tidlige endosomer (EES) 24, resulterte i dannelsen av gigant Rab5A-dekorerte blemmer, som vi identifiserte som SGS basert på innholdet av sekretorisk last NPY-mRFP og serotonin, og deres evne til å exocytose i et regulert mote 30.
Figur 2 viser morfometriske analyser av NPY-mRFP holdig SGS. Den midlere SG volum i CA Rab5A-uttrykkende celler nådde verdien av 44 um 3, som var> 20 ganger større enn den midlere volum av SGS i styre GFP-uttrykkende celler, mens deres antall var redusert med 20 ganger (figur 2A). Den inverse forholdetmellom antall og størrelse av SGS (figur 2A) antydet at Rab5-mediert utvidelse av SGS involverer deres homotypisk fusjon. Den gigantiske NPY-mRFP inneholder SGS dannet av CA Rab5A tillater konfokalmikroskopi avbildning av levende celler i en høy oppløsning som gjør det mulig å overvåke SGS i detaljer som ikke kunne være mulig ellers. For eksempel, vi har oppdaget Rab5A i fusing SGS sammen mindre strukturer spredt blant den gigantiske SGS, mest sannsynlig tilsvarer endosomes (figur 2B). I tillegg har vi vist at Rab5 forbigående og helst forbinder med nydannede SGS som tyder på at den selektive og forbigående sammenslutning av Rab5A med nydannede SGS er kompatibel med en fusogene apparat som bare nylig genererte granulater har kapasitet til å fusjonere med andre SGS 30.
Figur 3 viser representative tid-lapse bilder av MC gigant SGS som ble dannet av uttrykk for CARab5A og kinetikken exocytose i oppløsningen av en enkelt SG etter stimulering. Under MC eksocytose, SGS bevege seg mot og sikring med plasmamembranen. Som en konsekvens av den sekretoriske lasten frigjøres fra cellene til det ekstracellulære rom. I dette eksperimentelle systemet, blir NPY-mRFP frigjøres fra cellene og finnes i cellene supernatantene. Fluorescensen av NPY-mRFP i cellesupernatanter kan måles ved en fluorescens-leser. Men fordi NPY-mRFP er fortynnet i supernatantene sin fluorescens signal kan ikke oppdages eller visualisert ved fluorescens mikroskopi. Frigjøringen av NPY-mRFP fra kornene under exocytose resulterer i en hurtig og dramatisk reduksjon i NPY-mRFP fluorescensintensitet og krymping av NPY-mRFP holdige SG og deres disappearance.Therefore, levende celle avbildning av stimulerte celler og målinger av NPY -mRFP fluorescens intensitet eller NPY-mRFP inneholder SG størrelse gir nøyaktige vurderinger av kinetikken av eksocytose avindividuelle granulat. Figur 3B viser fluorescensstyrkene SGS etter å stimulere cellene med en Ca 2+ ionofor. SGS gjennomgå exocytose ved forskjellige tidspunkter (f.eks, 2, 3, 6 og 11 min etter stimulering), mens fluorescensintensiteten av en enkelt SG som ikke smelter sammen med plasmamembranen forble konstant.
Fig. 1: Illustrasjon av de viktigste trinnene i protokollen RBL-celler kotransfektert med NPY-mRFP og et annet gen av interesse, eller tilsvarende kontroll-plasmid og øyeblikkelig sådd ut på dekkglass, 8-brønners kammer borsilikat dekkglass system eller 96-brønners plater. Neste dag, er bilder av NPY-mRFP holdig SGS i hvile og utløste celler kjøpt opp av konfokal mikroskopi (A). I tillegg eksocytose av Resting og utløste cellsis kvantifisert ved å måle frigivelsen av NPY-mRFP i en 96-brønners plate fluorescens-leser (B).
Figur 2:. Kvantifisering av SGS 'størrelse RBL celler ble transfektert med NPY-mRFP og enten GFP eller GFP-CA Rab5A og sådd på 8-vel kammer borosilikat dekkglass system. 24 timer senere ble 8-brønners kammer anbragt i laser konfokal mikroskop utstyrt oppvarmet kammer (37 ° C). Z-stack bilder av etterfølgende bilder med optiske skiver 0,7 mikrometer ble tatt med en 63X olje / 1.4 numerisk apertur objektiv. Bildene ble deconvoluted og tre dimensjon bildene ble bygget av Imaris programvare. Volumet av SGS og deres nummer ble beregnet ved hjelp av Imaris programvare (A). En del av NPY-mRFP holdig Granules ser ut til å være innebygd i Rab5A (pilspisser). Andre er naken eller bro med Rab5A (piler). Skala bar = 5 mikrometer (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Måle omfanget og kinetikk eksocytose i oppløsning på en enkelt SG i activatedRBL celler RBL celler ble transfektert med NPY-mRFP og GFP-CA Rab5A og seeded IN8-brønn kammer borosilikat dekkglass system. 24 timer senere IN8-brønn kammeret ble plassert i en laser konfokal mikroskop utstyrt med et oppvarmet kammer (37 ° C), og cellene ble utløst med 10 mM Ca2 + ionofor. Bilder ble kjøpt hver 15 sek ved hjelp av en 63X olje / 1.4 numerisk apertur objektiv. Imagesvar deconvoluted og deretter behandles av Imaris programvare. Skala bar = 5 um (A). Den midlere fluorescensintensitet av NPY-mRFP inneholdende granuler ble bestemt ved Imaris programvare og data ble normalisert i henhold til tid 0 (tidspunkt for tilsetningen av Ca2 + ionofor). Pilene representerer de tidspunkter hvor utgivelsen av SGcargo wasnoted (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi som kombinerer kvantifisering av MCS exocytose og fire (x, y, z, t) dimensjons kvantifisering av tidsforskjøvede tredimensjonal avbildning av SGS i levende celler ved hjelp av et reporter-gen for exocytose. Denne teknikken gjør at screening av familier av proteiner for deres innvirkning på MC-funksjon som overvåkings SGS begynner så tidlig som sin exit fra Golgi gjennom sin modning, oppkjøp av eksocytose kompetanse og degranulation. Kombinasjonen av målinger av eksocytose sammen med morfometriske og kinetiske karakterisering av SGS gir innsikt i mekanismene som de testede proteiner megle MC funksjoner. Derfor bruker denne metoden, kan genetisk manipulering av målrettede gener avsløre nye molekylære mekanismer som MC SGS butikken og slipper sin last. Spesielt, kan NPY tjene som en reporter for exocytose i andre sekretoriske celler som MCF-7-celler, en cellelinje avledet from et menneske melkekjertlene adenokarsinom 31, kromaffinceller 34 og bukspyttkjertelen β-celler 35.
Genetiske manipulasjoner er de kraftigste verktøyene som er tilgjengelige for å forske funksjonelle nettverk. Genetiske manipulasjoner tillate identifisering av essensielle proteiner i hvert nettverk, hvis delesjon vil tvinge kollaps av systemet, i motsetning til andre proteiner, hvis delesjon vil fremtvinge krysstale mellom parallelle nett eller ikke ha noen effekt på grunn av redundans. Imidlertid, på grunn av den lave transfeksjonseffektivitet av MCS, ved måling exocytose av endogene mediatorer bare en liten brøkdel av celler som uttrykker 'manipulere' test DNA. Derfor, når man måler exocytose av endogene mediatorer, er bidraget fra de transfekterte celler til den totale avlesning mindre. Derfor, for å forsøke å vedta en slik tilnærming utforske de komplekse nettverk forbundet med regulert eksocytose i MCs var hektarmpered. Denne teknikken seirer hindringen av lav transfeksjonseffektivitet og gir en enkel måte å observere fenotypiske vekslingene i MC SGS forårsaket av over uttrykk, knockdown og mutagenese av gener av interesse.
Denne teknikken kan utvides for å undersøke hierarkiet og modusen for samhandling av funksjonelle nettverk ved hjelp av forbigående trippel-transfeksjon. Resultatene vil bli analysert for å fastslå hvilket gen kan redde en viss fenotype; føre til en mer dramatisk fenotype eller ikke ha noen effekt. Basert på slike kombinatoriske transfections, kan eksocytose nettverk bygges. For eksempel bruker trippel-transfeksjon vi var i stand til å identifisere den SNARE protein VAMP8 som en nedstrøms mekler i prosessen med Rab5 avhengig SG fusjon 25.
Denne metoden tillater visualisering og kvantifisering av eksocytose i oppløsningen av enkelt SGS. Vi var faktisk i stand til å vise at SG-skjerm differensial svar på Stimuli. Grunnen til hvorfor visse SGS smeltet sammen med plasmamembranen mens andre ikke gjorde det eller årsaken til differensialkinetikk MC SG fusjon fortsatt ikke bestemt. Fremtidige studier med denne eksperimentelle tilnærming har potensial til å svare på disse spørsmålene. For eksempel bør kvantifisering av ulike snarer eller Rabs for individuelle SGS og korrelasjon med eksocytose kompetanse og kinetikken av eksocytose i oppløsning på en enkelt SG avsløre nye regulatorer av eksocytose.
Den viktigste begrensning ved denne teknikk er den genetiske manipulering fordi overekspresjon av et protein kan påvirke cellefunksjonen eller morfologi. Derfor er det viktig å validere resultatene med komplementære løsninger. For eksempel bør ved overekspresjon av en konstitutivt aktiv mutant hemmer exocytose, effekten av en konstitutiv negativ mutant eller slå ned av genet som skal testes også.
Ved hjelp av denne teknikken, vi ID-kort produksjonIED nye regulatorer av MC-funksjoner, som påvirker MC eksocytose eller endrer SG morfologi. Kombinasjonen av eksocytose målinger sammen med SGS morfometrisk karakterisering gir dypere innsikt i funksjon og virkningsmekanismer av de testede proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr. U. Ashery for gaven av NPY-mRFP cDNA. Vi takker legene. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, og Y. Zilberstein for uvurderlig hjelp med mikroskopi og bildeanalyser. Vi takker også Dr. Joseph Orly for kritisk lesing av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Israel Science Foundation, grunnlagt av Israel Academy for Sciences (1139-1112 til RS-E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
