Summary
本议定书的目标是开发一种方法，使肥大细胞分泌功能基因组分析。所述协议是基于荧光报道基因cotrasfected与感兴趣和实时的基因的释放定量评估分析分泌颗粒的形态。
Abstract
肥大细胞（MC）是免疫系统的分泌细胞完成其生理和病理功能通过释放预先形成和新合成的过敏性，炎性和免疫调节介质。 MC的中介影响多个组织和器官最终在过敏和免疫反应。在MC介质的合成，储存和释放受到严格的监管。预形成的介质都装在胞质分泌粒剂（SG），该融合与质膜和由稳压胞吐作用释放其内容。我们提出了一个协议的基础上，共表达的与一个报告基因的兴趣被靶向SGS和被释放的调节的方式沿着内源性SG介质的基因。该协议使高分辨率四维共聚焦分析了MC的SGS和监控，从生源的时间表，以触发胞吐。因此，使用该协议除筛选基因EST他们的表型和功能的影响允许破译支配的MC的SG的生物合成和胞吐作用的分子机制，并确定所涉及的监管机构。由此，进一步的见解认为占在健康和疾病的MC功能的细胞机制应提供。
Introduction
肥大细胞（MC）是最知名的是它们在过敏性和炎性反应，如关节炎，哮喘，嗜酸细胞性食管炎，慢性皮炎和过敏性休克1,2-以及其他疾病，包括冠状动脉疾病3,5-和参与免疫细胞癌症3,4。此外，管委会发挥固有免疫和适应性免疫的重要角色，无论是在对抗细菌和寄生虫的宿主防御和抑制免疫反应，例如诱导移植耐受5,6。
的MC从骨髓来源，来自CD34 + / CD117 +多潜能祖细胞7显影。致力于骨髓祖细胞的MC被释放到血液中，并迁移到结缔组织和上皮表面8内定位主要的外周组织。成熟和终末分化的影响o在最终会实现f显示周围环境8,9内细胞因子。
管委会可通过过敏原（抗原，抗原），其遭遇导致免疫球蛋白E（IgE）的一代型抗体被激活。这样的IgE结合到MC的了FcεRI受体，随后交联的细胞结合的IgE的经重新暴露于相同的银，导致了FcεRI聚集和一个信号级联高潮在细胞脱粒的起始[10,11中综述] 。的MC也被激活，独立的IgE，通过神经肽5,12，毒素13，细菌和病毒抗原14,15，多个带正电荷的肽统称为基本分泌素，免疫细胞和细胞因子5,13,12,16的17。的MC是由许多自身释放介质，其进一步放大炎性反应也被激活。
管委会都挤满了分泌颗粒（SGS）含有免疫调节介质，包括血管活性胺，如组胺和血清素（在啮齿动物），蛋白聚糖，蛋白酶，如胃促胰酶和类胰蛋白酶，血管内皮生长因子和多种细胞因子和趋化因子8,9。这些介质是“准备好”，并一次的MC是由一个适当的刺激物激活，这些介质被从细胞通过在几秒钟到几分钟18,19事项调节胞吐作用（脱粒）释放。这个初始事件之后是从头合成一个大阵列的生物效物质，包括花生四烯酸代谢物，多种细胞因子和趋化因子20,21,22和释放。新合成的产品发布时的独立SG发布。总的来说，这些调解员开展早期和晚期炎症和过敏性反应。因此，了解占MC激活和脱颗粒的机制是理论和临床小鬼ortance。
转基因操纵初级和培养管委会的困难阻碍了试图阐明基本MC脱颗粒的机制，仍然解决不好。为了克服这个问题，我们开发了一种基于记者通过测定共转染的粘膜肥大细胞系，大鼠嗜碱性白血病（RBL）-2H3（本文中称为RBL）或骨髓衍生的MC（的BMMCs）30与感兴趣的基因和神经肽Y（NPY）融合到单体RFP（MRFP），作为SG记者。
NPY先前所示扼要重述在其它系统的内源性SG标志物的行为。此外，由于荧光MRFP是pH值不敏感的，表达NPY-MRFP允许酸性的SG的可视化以及胞吐作用的定量评估通过使用96孔板和荧光板读数器。我们已经表明，NPY-MRFP被输送到RBL细胞和的BMMCs的酸性SGS和从该细胞释放在经调节的方式沿着内源性SG货物（ 即 ，β氨基己糖苷酶和血清素）30，32。这个协议提供了高分辨率成像为基础的方法，它允许对他们的表型和在RBL细胞32上SG上的特点和脱粒功能影响兴趣基因的筛选。具体地，该协议允许的MC的SG的实时跟踪和它们的面积或体积的大小，它们的数量，组装的动力学，其沿着细胞骨架的运动以及它们在不同条件下质膜最终融合的定量。例如，用DNP特异性IgE致敏的细胞和触发细胞用多价抗原（DNP缀合的血清白蛋白）根据不同的扰动（ 即 ，击倒的感兴趣的基因，过的重量或突变基因的表达，或药理学操作），并比较，以控制细胞。
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Protocol
1.准备RBL细胞培养基
- 混合500毫升低葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）与56毫升胎牛血清（这使得10％FBS），然后添加5.5青霉素链霉素毫升（这使得〜1％PEST）。
- 用500-1000毫升瓶顶真空过滤器具有0.22微米的孔径大小和存储在4℃过滤介质。
2.文化RBL细胞
- 在任一板或培养瓶生长RBL细胞在5％的CO 2的潮湿气氛中在37℃。 RBL细胞正在生长于10cm板应补充有10毫升培养基，形成的〜10 7个细胞/板汇合单层。
- 当细胞层将至合流，replate培养以较低的密度。
- 除去从板/烧瓶用无菌巴斯德移液管连接到真空中的培养基中。
- 冲洗细胞单层用预热（37℃）0.25％胰蛋白酶/ EDTA，涵盖了整个单层（体积取决于培养板/瓶的大小;2毫升为10cm平板）。这将分离的细胞。
- 或者，冲洗细胞单层用磷酸盐缓冲盐水（PBS），除去PBS并加入预热（37℃）胰蛋白酶/ EDTA。这一步分离的细胞快。
- 放置板/烧瓶在恒温箱在37℃（不超过10分钟）。
- 检查该光学显微镜下的细胞，以检查它们是否已经脱离。如果细胞10分钟后没有脱落，轻轻拍打上盘/瓶。
- 添加培养基向培养板/烧瓶以悬浮细胞（该介质的体积应至少2倍比胰蛋白酶溶液的体积大）。
- 沉淀细胞离心3分钟，以200g在25℃。
- 重悬在培养基中的细胞。由1:10稀释的细胞和种子在一个新的培养皿中。孵育细胞48-72小时，直到他们REACħ大约90％汇合。
- 长达3个月（30代）重复相同的过程（部分2.2.1-2.2.8）。
3.准备转染媒体。
- 制备K -管道pH值7， 钙离子乙酸1mM溶液和镁离子醋酸100mM的溶液的100毫溶液。
- 稀释的K-管道的pH 7的100mM的溶液成使用DMEM培养基20毫米， 钙醋酸1mM溶液添加至10微米，镁离子醋酸100mM的溶液的最终浓度为2的终浓度毫米。
- 权衡谷氨酸钾，并添加到该溶液中，以128毫米的最终浓度，拌匀，并保持在4℃直至使用。保持其余的解决方案（ 即 ，K -管道， 钙离子，乙酸镁离子乙酸酯）于-20℃。
4.转染RBL细胞
- 从使用该板/烧瓶除去培养基无菌巴斯德吸管连接至真空。
- 冲洗细胞单层用预热（37℃）胰蛋白酶/ EDTA应覆盖整个单层。放置板/烧瓶在恒温箱在37℃（不超过10分钟）。检查，如果细胞用光学显微镜已经分离。
- 添加培养基向培养板/烧瓶以悬浮细胞（在介质的体积应至少2大于胰蛋白酶溶液的体积更大）。
- 使用血细胞计数器计数细胞数。
- 沉淀1.5×10 7个细胞离心3分钟，在200×g离心25℃。弃去上清液，加入280微升转介质。转移反应混合物成4mm杯。
- 加入20 NPY-MRFP质粒微克，要么30微克控制空质粒或测试质粒。该反应混合物的最终体积应为300微升。
- 立即放置在冰上10分钟。擦去残留的水和对反应杯roceed电穿孔在300V 9毫秒。
- 为胞吐的测量，在含有300微升培养基的24孔组织培养皿中立即replate细胞。加入8微升的反应混合物（4×10 5细胞）至各孔。加入4×10 5个非转染细胞额外井控制。准备足够的孔中至少有两个孔，每个处理为每转染。
- 对于时间推移显微镜，在含有80微升培养基的8孔腔室硼硅酸盐玻璃罩系统立即replate细胞。添加1.5微升的反应混合物（7.5×10 4个细胞）至各室。 （尽量避免使用该室在玻璃罩的边缘，该室在玻璃罩的中心更容易图像）。
注：重要的是，并非所有的细胞响应于触发和偶尔的时间推移显微镜是由于失去焦点的8孔腔室borosi和漂移废止licate玻璃罩系统。因此，准备至少8室，每个处理每个转染。 - 对于敏化的细胞为了FcεRI介导的活化，加入小鼠DNP特异性单克隆IgE的1微克/毫升到介质（孵育的细胞的IgE至少2小时）。
- 后18-24小时用荧光显微镜，以确认该细胞表达的质粒。 MRFP荧光的激发和发射波长分别是：λEx584，λEm607纳米。 NPY-MRFP应该出现在对应于SGS的囊泡结构。如果感兴趣的第二个基因融合到荧光标签使用荧光显微镜来确认的共表达两种质粒在相同的细胞。例如，如果所测试的基因融合到绿色荧光蛋白，GFP荧光的激发和发射波长分别是：λEx488，λEm507纳米。绿色荧光蛋白标记的蛋白质应出现在表达NPY-MRFP相同的细胞。
- 对于胞外分泌的测量进行吨Ø第5步和时间的推移显微镜，继续执行步骤6。
5.测量NPY-MRFP胞吐作用
- 制备台氏缓冲液：
- 制备的54毫米氯化钾，20mM的MgCl 2的，2.74 M氯化钠和8毫的NaH 2 PO 4在DDW中的溶液。拌匀，保存在4℃。本步骤是制备的20倍的Tyrode缓冲液中。
- 制备的20毫摩尔的Hepes中的溶液pH值为7，1.8毫氯化钙 ，1毫克/毫升BSA，5.6毫葡萄糖和1至20的稀释20倍的Tyrode在DDW中并充分混合。本步骤是制备1X的Tyrode缓冲液中。
- 分装1X的Tyrode缓冲液并储存在-20℃。避免反复冻融。
- 除去从24孔板的培养基中洗3次的Tyrode缓冲液中。通过加入200微升的Tyrode缓冲液以控制井制备未刺激细胞。
- 制备10微升/孔20X的浓缩活化试剂〔（ 例如 1000纳克/毫升的DNP-BSA或DNP-HSA（银），200μM的Ca 2+离子载体（例如 A23187），和20微米的Ca 2+离子载体和1000纳米12-O-十四烷-13-乙酸酯（TPA）]的组合。如果试剂被储存在DMSO中，稀释试剂成20倍的浓度中含有1％DMSO中的Tyrode缓冲液中。孵育在37℃下30分钟。
- 以及小心取出每个上清液至96孔板，放置在冰上，并避免光照。 （上清液包含所述嵌合肽的NPY-MRFP被从细胞中释放）。
- 加含有0.5％的Triton X-100，以每200微升的Tyrode缓冲液，并培育在37℃下进行10分钟。 （本步骤是制备包含NPY-MRFP为没有从细胞中释放的剩余的细胞裂解物的重要）。收集细胞裂解物，并转移到一个96孔板中，放置在冰上，并避免光照。
- 使用fluoresc测量细胞上清液和细胞裂解物的荧光ENCE板读数器，使用的是590-，20纳米的带宽激发滤光片和635-，35纳米的带宽发射滤光片。
- 计算NPY-MRFP公布的百分比：
注：荧光读取器测量任意荧光单位（AFU）。 AFU值取决于机器和它的灵敏度和转染效率上。- 设置未转染的RBL细胞作为空白的自体荧光。将每个上清液的总荧光的AFU（上清液+ AFU相应裂解物的AFU）再乘以100。
胞吐6.定时显微镜
- 在8孔室硼硅酸盐玻璃罩系统种子7.5×10 4个转染细胞/室。后18-24小时，从所述腔室取出培养基洗3次，用蒂罗德缓冲
- 加入72微升的Tyrode缓冲液到每个室中。淡化台氏缓冲的激活剂，以10倍的浓度。 <li>使用配备有加热室（37°C）和CO 2控制器（4.8％）和40X或63X客观的共聚焦荧光显微镜。打开显微镜系统：汞灯，计算机，激光器。确保该加热室是在合适的温度在开始实验之前。
- 将室中的加热室中，并确保该室被正确和稳定的安装。
- 根据相关的荧光团开启荧光灯和可视化转染的细胞。关闭荧光一旦感兴趣的细胞是在现场，以尽量减少漂白和细胞毒性。这个字段将包含约2-3转染的细胞是重要的。转染的细胞应良好分散，但不互相接触。
- 调整激光功率（取决于显微镜）以减少噪声和过饱和，以及毒性，并设置增益和偏移修改信噪比。在扫描速度快或德，以尽量减少激光博览会（平均2）的持续时间。
- 调节针孔尺寸到最大，这使得能够降低激光功率，并保持集中的时间很长的周期的图像。如果需要的话，设置参数为Z-堆栈来重建图像在三维，调整针孔大小为1通风单元（AU），该给出最佳的信噪比，并获得连续的二维共焦光学切片扫描ž-axes光学切片≤0.7微米。
- 设定每个采集到15-30秒，总采集到15分钟的持续时间之间的间隔时间，并开始获取图像。 5分钟后，采集的暂停时间序列。添加8微升10倍的触发，并立即继续进行收购。
- 保存的图片，采用了卷积软件进行反褶积和重建书库三维图像，并使用了Imaris软件的一部电影。
- 从共聚焦荧光显微镜来了Imaris软件获得的解卷积时间序列图像导入数据。该软件可读取超过40显微镜文件。如果软件无法读取的文件;将文件转换为TIF文件和进口。
- 时间点添加到一个开放的数据集新闻编辑结束 - >添加时间点，并导入新的数据集。
- 创建使用表面向导选项MRFP通道的表面。选择默认的算法。选择的NPY-MRFP的信道。纪念平滑选项，以减少噪音。为了避免损失的小细节降低区域的细节层面，以0.05微米。
- 设定强度阈值。新的灰面将显示。进入“设置”，并从“中心点”到“面”切换风格。
- 转到所选对象的属性的统计选项卡中，选择详细的标签和特定值SUCH作为荧光强度，音量等。
- 检查数据并确认值与图像相兼容。例如，两个或更多个相邻的颗粒可能被测量为1大颗粒。用于量化的平均颗粒尺寸除以合并的颗粒，以颗粒剂的实际数量的大小。
- 导出所需的数据集到Excel文件和分析数据。
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Representative Results
因为市政局的转染效率低的，遗传操作是不可能离开平均分泌的内源性的SG介质测量读数产生影响。然而，由在监测只表达感兴趣的基因的细胞群体建立完整的共表达的报告基因的NPY-MRFP和共转染质粒在相同细胞中，监测的NPY-MRFP结果。因此，这种测定法与传统方法相比的优点是能够选择性地监测遗传操作的细胞（ 图1）的能力。
事实上，采用此法，我们筛选基因调节囊泡运输包括可溶性NSF [N-乙基马来酰亚胺敏感的融合]附着蛋白受体（SNARE）蛋白质和饶GTP酶家族的44名成员。我们确定的基因调节SGsize，数量，货物组成和胞吐23。
W¯¯Ë确定30的RAB的改变（ 即抑制或刺激）胞吐由两种Ag或由钙离子载体的佛波醇酯TPA（离子/ TPA）23的组合刺激RBL细胞。共聚焦成像显示斯耐尔和RABS引起剧烈的表型改变的细胞或所述的SG 30,32的形态。这些蛋白质的共聚焦成像显示8斯耐尔和RABS导致对细胞或对SG形态30,32戏剧性的表型。使用该协议，我们能够跟踪各个SGS和执行他们的大小，荧光强度，其运动和胞吐的测量。例如，我们发现Rab5的为SG生物发生30的调节器。 Rab5的已被确定为内吞作用和内体融合24主调节器。我们已经表明，共表达Rab5的的内源性表达的同种型的组成型阴性（CN）的GDP锁定突变体（RAB5A，Rab5B和Rab5C），或电子邮件的RAB5A / B / C的靶向的shRNA，XPRESSION显著的SGS的尺寸与它们的数量30同时增加减少。相反地，一GTP-锁定，组成性活性（CA）RAB5A突变体的表达（RAB5A Q79L，本文中：“CA RAB5A”），这是已知的，以促进早期内涵体同型融合（EES）24，导致巨的形成RAB5A装饰囊泡，我们鉴定为的SG基于分泌货物NPY-MRFP其含量和血清素，以及它们在经调节的方式30至exocytose容量。
图2显示了-MRFP含NPY的SGS形态分析。在加利福尼亚州RAB5A表达细胞的平均的SG体积达到44微米3的值，为> 20倍比的SG在控制表达GFP的细胞，而它们的数量减少了20倍（图的平均体积较大2A）。逆关系的数量和的SG（图2A）的尺寸之间建议的SG的Rab5的介导放大涉及他们的同型融合。巨NPY-MRFP含有由加利福尼亚RAB5A形成的SG允许活细胞的共焦显微镜成像的高分辨率使得能够监测的SG在细节，可能是不可能的，否则。例如，我们发现RAB5A在融合的SG旁边散落巨人之间的SG更小的结构，最有可能对应内涵体（ 图2B）。此外，我们已经表明，Rab5的瞬时和优选同伙与新形成的SG表明RAB5A与新形成的SG的选择性和瞬态关联是与膜融合装置，其中仅新生成的颗粒具有熔合与其他的SG 30的能力相兼容。
图3显示了MC巨头的SGS通过CA的表达，形成代表延时图像RAB5A和胞外分泌的刺激后单SG的分辨率动力学。期间的MC胞吐，SGS的走向和熔合质膜。作为结果分泌货物从细胞释放到细胞外空间。在此实验系统中，NPY-MRFP是从细胞中释放，并在细胞中发现的上清。 NPY-MRFP在细胞上清液中的荧光可通过荧光读取器来测量。但是，由于NPY-MRFP稀释上清液中的荧光信号不能被检测到，或通过荧光显微镜观察。 NPY-MRFP从颗粒中胞吐导致的NPY-MRFP荧光强度和含NPY-MRFP SGS和他们disappearance.Therefore，刺激细胞和神经肽Y的测量活细胞成像的收缩迅速而显着降低释放-mRFP荧光强度或NPY-MRFP含有SG大小提供的胞吐的动力学的准确的评估个别颗粒。 图3B示出的SG的荧光强度与钙离子载体刺激的细胞后。 SGS的经历胞吐在不同时间点（ 即 ，2，3，6，和11分钟后的刺激），而一个单一的SG未与质膜融合的荧光强度保持恒定。
图1：图示的协议的主要步骤的RBL细胞共转染具有NPY-MRFP，感兴趣或相应对照质粒的第二基因，并立即接种在盖玻片，8孔腔室硼硅酸盐玻璃罩系统或96孔板中。第二天， - MRFP含NPY的SGS在休息和触发细胞图像共聚焦显微镜（A）收购。此外，胞吐restin的的克和触发cellsis通过测量NPY-MRFP的释放在96孔板荧光读数器（B）的定量。
图2：在SGS的大小的定量 RBL细胞共转染与NPY-MRFP和GFP或GFP-CA RAB5A并接种于8孔腔室硼硅酸盐玻璃罩系统。 24小时后，在8孔腔室被放置在激光共聚焦显微镜配备加热室（37℃）。连续图像的光学片0.7微米的Z堆栈图像使用63X油/ 1.4数值孔径的物镜所捕获。的图像进行去卷积和三维图像是由了Imaris软件构成。使用了Imaris软件（A）中分别计算的SGS和它们的数量的体积。含NPY-MRFP granu的一部分莱斯似乎被嵌入内RAB5A（箭头）。其他人则赤身裸体或桥接与RAB5A（箭头）。比例尺= 5微米（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：测量在activatedRBL电池的单SG的分辨率的程度和胞吐动力学 RBL细胞共转染与NPY-MRFP和GFP-CA RAB5A并接种IN8阱室硼硅酸盐玻璃罩系统。 24小时后IN8阱室放置在激光共聚焦显微镜配备有加热室（37℃），将细胞触发与10μM的钙离子载体。图像被收购，每15秒使用63X油/ 1.4的数值孔径的目标。图片是卷积然后由了Imaris软件进行处理。比例尺= 5微米（A）。的NPY-MRFP含颗粒的平均荧光强度由了Imaris软件确定，并根据时间0（加成的钙离子载体的时间）的数据进行归一化。箭头代表的时间点，在这SGcargo释放wasnoted（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们描述了一种创新的策略，通过时间流逝立体使用报道基因用于胞吐作用在活细胞中的SG成像结合的MC胞吐和4（X，Y，Z，t）的维数的量化值的量化。这项技术使蛋白质他们对MC功能影响的家庭，如监测的SG，早在他们从高尔基通过其成熟的退出，收购胞外分泌能力和脱粒开始筛选。胞吐连同了SGS的形态和动能表征测量相结合，提供了深入了解通过该测试的蛋白介导MC功能的机制。因此，使用这种方法，目标基因的遗传操作可揭示通过该MC的SG储存和释放他们的货物的新的分子机制。值得注意的是，神经肽Y可以作为记者为胞吐在其他分泌细胞如MCF-7细胞，细胞系衍生FR嗡人乳腺腺癌31，嗜铬细胞34和胰腺β细胞35。
遗传操作目前可用于研究功能网络的最有力的工具。遗传操作允许必需的蛋白质的每个网络，其缺失将强制系统的崩溃中的识别，而不是其他蛋白质，其缺失将强制平行网络之间的串扰或没有由于冗余的效果。因为市政局的转染效率低的但是，测量内源性介质唯一的细胞的一小部分被表达“操纵”被测DNA的胞吐作用时。因此，测量内源性介质的胞吐时，转染细胞的总读出的贡献较小。因此，试图通过这样的方式，探索在管委会监管胞吐作用相关的复杂网络是哈mpered。该技术克服了转染效率低的障碍物，并提供了一种简单的方法来观察的MC的SG的表型交替过度表达，击倒和感兴趣的基因的诱变所致。
这种技术可以延长调查采用瞬时三转功能的网络交互的层次和模式。将结果进行分析，以确定哪些基因可以拯救某种表型;导致更剧烈的表型或没有任何效果。基于这样的组合转染，胞吐网络可以构造。例如，使用三重转染我们能够识别SNARE蛋白VAMP8如在Rab5的依赖性SG融合25的处理的下游介质。
此方法允许可视化和胞吐的量化在单一的SG的分辨率。事实上，我们能够证明的SG显示不同的反应STIM乌利。要确定的理由为何融合与质膜而其他没有或为MC SG融合差动动力学的原因一定的SG保持不变。使用这种实验方法今后的研究必须回答这些问题的可能性。例如，不同的SNARE蛋白的RAB或个人SGS及与胞外分泌能力的相关性和胞吐在一个单一的SG的分辨率动力学的量化应该揭示胞吐的新型监管。
该技术的主要局限是遗传操作，因为蛋白质的过表达可能影响细胞的功能或形态。因此，有必要以验证结果与互补的方法。例如，当一个组成型活性突变体的过表达抑制胞吐中，组成型失活突变体的效果或敲基因的向下应当以及测试。
使用这种技术，我们IDENTIFMC的功能，影响MC胞外分泌或改变SG形态IED新颖监管。胞吐测量与SGS形态特征组合在一起提供了更深入地了解功能和测试蛋白质的作用机制。
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Acknowledgments
我们感谢U.阿瑟瑞博士NPY-MRFP的cDNA的礼物。我们感谢博士。 MJ Kofron，L. Mittleman，M. Shaharbani和Y. Zilberstein与显微镜宝贵援助和图像分析。我们也感谢约瑟夫·奥利博士这个手稿的批判性阅读。这项工作是由以色列科学基金会的资助，由以色列科学院科学支持成立（1139至1112年，以RS-E）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
