Summary
Målet med denne protokol var at udvikle en metode, der vil gøre det muligt for funktionelle genomiske analyser af mast celle sekretion. Protokollen er baseret på kvantitativ vurdering af udgivelsen af en fluorescerende reporter gen cotrasfected med genet af interesse og tidstro analyser af sekretoriske granula morfologi.
Abstract
Mastceller (MC) er sekretoriske celler i immunsystemet, der udføre deres fysiologiske og patologiske funktioner ved at frigive præformede og nyligt syntetiserede allergiske, inflammatoriske og immunregulerende mediatorer. MC'er 'mediatorer påvirker flere væv og organer kulminerede i allergiske og immunrespons. Syntesen, opbevaring og frigivelse af MC mæglerne er stærkt reguleret. De præformede mediatorer er pakket i cytoplasmatiske sekretoriske granula (SG), der fusionere med plasmamembranen og frigøre deres indhold ved reguleret exocytose. Vi præsenterer en protokol, baseret på co-ekspression af et gen af interesse med et reportergen, der er målrettet til SGS og frigives på en reguleret måde ved siden af de endogene SG mediatorer. Protokollen giver høj opløsning fire dimensional konfokal analyser af MC SGs og overvåge deres tidslinje fra biogenese til udløst exocytose. Således ved hjælp af denne protokol til screening gener af interest for deres fænotypiske og funktionelle konsekvenser tillader decifrere de molekylære mekanismer, der styrer biogenese og exocytose MC SGs og identificere de involverede myndigheder. Derved bør ydes yderligere indsigt i de cellulære mekanismer, der tegner sig for MC'er funktion i sundhed og sygdom.
Introduction
Mastceller (MC) er immunceller, der er bedst kendt for deres deltagelse i allergiske og inflammatoriske reaktioner, såsom gigt, astma, eosinofil esophagitis, kronisk dermatitis og anafylaktisk shock 1,2 samt andre patologier, herunder koronararteriesygdom 3,5 og cancer 3,4. Desuden MCs spiller en vigtig rolle i medfødte og adaptive immunitet, både i vært forsvar mod bakterier og parasitter, og ved undertrykkelse af immunreaktioner, fx inducere allograft tolerance 5,6.
MC'er stammer fra knoglemarven, udvikling fra CD34 + / CD117 + pluripotente stamceller 7. Committed knoglemarv MC progenitorer frigives til blodbanen og migrere ind i de perifere væv lokalisering overvejende inden bindevæv og epiteloverflader 8. Modning og terminal differentiering til sidst opnås under indflydelse of cytokiner inden det omgivende miljø 8,9.
MCs kan aktiveres af et allergen (antigen, Ag), hvis møde resulterede i dannelsen af immunglobulin E (IgE) type antistoffer. Binding af sådanne IgE til MC FceRI receptorer, efterfulgt af krydsbinding af cellebundet IgE ved fornyet behandling med det samme Ag, resulterer i FceRI sammenlægning og indledning af en signaleringskaskade der kulminerer i celle degranulering [revideret i 10,11] . MCs også aktiveres uafhængigt af IgE, som neuropeptider 5,12, toksiner 13, bakterielle og virale antigener 14,15, en række positivt ladede peptider kollektivt benævnt grundlæggende sekretagoger, immunceller og cytokiner 5,13,12,16 , 17. MCs også aktiveres af mange af deres egne frigivne mediatorer, hvilket yderligere forstærker den inflammatoriske respons.
MCs er pakket med sekretoriske granulat (SGS), som indeholder immunoregulatoriske mediatorer, herunder vasoaktive aminer, såsom histamin og serotonin (i gnavere), proteoglycaner, proteaser, såsom chymase og tryptase, vaskulær endotelvækstfaktor og flere cytokiner og chemokiner 8,9. Disse mæglere er "klar til at gå", og når MC'er aktiveres af en passende stimulus, er disse mediatorer frigives fra cellerne ved reguleret exocytose (degranulering) i løbet af få sekunder til minutter 18,19. Denne indledende begivenhed efterfulgt af de novo-syntese og frigivelse af en bred vifte af biologisk potente stoffer, herunder arachidonsyremetabolitter, multiple cytokiner og chemokiner 20,21,22. Frigivelse af nyligt syntetiserede produkter sker uafhængigt af SG udgivelse. Kollektivt, disse mediatorer indlede tidlige og sene fase inflammatoriske og allergiske reaktioner. Derfor forstå de mekanismer, der tegner sig for MC-aktivering og degranulering er både teoretisk og klinisk importance.
Vanskeligheden for genetisk manipulere primære og dyrkede MC'er har hæmmet forsøgene på at belyse mekanismerne bag MC degranulering, som forblev dårligt løst. For at overvinde dette problem, vi udviklede en reporter assay ved co-transfektion af mucosale mastcellelinje, rotte basofile leukæmi (RBL) -2H3 (i det følgende benævnt RBL) eller knoglemarv afledte MC'er (BMMCs) 30 med et gen af interesse og neuropeptid Y (NPY) fusioneret til monomere RFP (mRFP) som SG reporter.
NPY er tidligere vist at rekapitulere adfærd endogene SG markører i andre systemer. Desuden, på grund mRFP fluorescens pH ufølsom ekspression af NPY-mRFP tillader visualisering af de sure strain gauges samt kvantitativ vurdering af exocytose ved anvendelse af 96-brønds plader og en fluorescenspladelæser. Vi har vist, at NPY-mRFP leveres til de sure generalsekretærerne for RBL celler og BMMCs og frigives fra cellernepå en reguleret måde ved siden af endogene SG last (dvs. β-hexosaminidase og serotonin) 30, 32. Denne protokol giver en høj opløsning billeddannelse-baserede metode, der tillader screening gener af interesse for deres fænotypiske og funktionelle indvirkning på SG egenskaber og degranulering i RBL-celler 32. Konkret denne protokol giver real time tracking af MC SGs og kvantificering af deres område eller volumen størrelse, deres antal, kinetik delene, deres bevægelse langs cellens cytoskelet og deres endelige fusion med plasmamembranen under forskellige forhold. For eksempel, sensibiliserende af cellerne med DNP-specifikt IgE og udløser cellerne med en multivalent Ag (DNP konjugeret serum albumin) under forskellige forstyrrelser (dvs. knockdown af gener af interesse, overekspression af vildtype eller mutante gener eller farmakologiske manipulationer) og sammenligning med kontrolceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af RBL cellekulturmedier
- Bland 500 ml lav glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 56 ml føtalt bovint serum (dette gør 10% FBS), og derefter tilsættes 5,5 ml penicillin streptomycin (dette gør ~ 1% PEST).
- Filtrer mediet med 500-1.000 ml flaske-Top Vacuum Filtre med 0,22 um porestørrelse og opbevares ved 4 ° C.
2. Kultur af RBL Cells
- Grow RBL-celler i en fugtig atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C i enten plader eller kolber. RBL-celler, der vokser i 10 cm plader bør suppleres med 10 ml medium og danne sammenflydende monolag af ~ 10 7 celler / plade.
- Når cellelaget nærmer konfluens replate kulturen ved en lavere densitet.
- Fjern kulturmediet fra pladen / kolbe under anvendelse af en steril Pasteur-pipette forbundet til vakuum.
- Skyl cellemonolaget med forvarmet (37° C) 0,25% trypsin / EDTA, der dækker hele monolaget (mængden afhænger af størrelsen af dyrkningspladen / kolbe; 2 ml til 10 cm plade). Dette vil løsne cellerne.
- Alternativt skylles cellemonolaget med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), fjern PBS og tilføje forvarmet (37 ° C) trypsin / EDTA. Dette trin løsner cellerne hurtigere.
- Pladen / kolbe i en inkubator ved 37 ° C (ikke mere end 10 min).
- Undersøg cellerne under det optiske mikroskop for at se, om de har fritliggende. Hvis cellerne ikke løsrive efter 10 min, forsigtigt trykke på pladen / kolben.
- Tilføj medium til kulturen plade / kolbe at suspendere cellerne (mængden af mediet bør være mindst 2 gange større end volumenet af trypsin opløsning).
- Pelletere cellerne ved centrifugering i 3 minutter ved 200 g ved 25 ° C.
- Resuspender cellerne i medium. Fortynd cellerne 1:10 og frø i en ny dyrkningsskål. Inkuberes cellerne i 48-72 timer, indtil de Reach ca. 90% konfluens.
- Gentag den samme procedure (afsnit 2.2.1-2.2.8) i op til 3 måneder (30 passager).
3. Fremstilling af Transfektion Media.
- Der fremstilles en 100 mM opløsning af K-rør pH 7, 1 mM opløsning af Ca 2+ acetat og 100 mM opløsning af Mg2 + acetat.
- 100 mM opløsning af K-rør pH 7 i 20 mM ved anvendelse af DMEM medier fortyndes, tilsæt 1 mM opløsning af Ca 2+ acetat til en slutkoncentration på 10 uM og 100 mM opløsning af Mg2 + acetat til en slutkoncentration på 2 mM.
- Kaliumglutamat afvejes og tilsættes til opløsningen til en slutkoncentration på 128 mM, bland godt og holde ved 4 ° C indtil anvendelse. Hold de resterende løsninger (dvs.., K-rør, Ca2 + acetat, Mg2 + acetat) ved -20 ° C.
4. Transfektion af RBL Cells
- Fjern kulturmediet fra pladen / kolbe under anvendelse af ensteril Pasteur-pipette forbundet til vakuum.
- Skyl cellemonolaget med forvarmet (37 ° C) trypsin / EDTA, der bør dække hele monolag. Pladen / kolbe i en inkubator ved 37 ° C (ikke mere end 10 min). Kontroller, om cellerne er fritliggende med den optiske mikroskop.
- Føj medium til kulturen plade / kolbe at suspendere cellerne (omfanget af medierne bør være mindst 2-større mere end volumen af trypsin opløsning).
- Tæl celle nummer med hæmocytometer.
- Pellet 1,5 × 10 7 celler ved centrifugering i 3 minutter ved 200 xg ved 25 ° C. Kassér supernatanterne og tilsæt 280 pi transfektion medium. Overfør reaktionsblandingen i 4 mm kuvette.
- Der tilsættes 20 ug NPY-mRFP plasmidet og enten 30 ug af kontrol tom plasmid eller en testet plasmid. Det endelige volumen af reaktionsblandingen bør være 300 pi.
- Anbringes straks på is i 10 min. Tør kuvetten fra restvand og proceed til elektroporering ved 300 V til 9 ms.
- Til måling af eksocytose, replate cellerne straks i 24-brønds vævskulturskåle indeholdende 300 pi medium. Tilsæt 8 pi af reaktionsblandingen (4 x 10 5 celler) til hver brønd. Tilføj 4 × 10 5 ikke-transficerede celler til yderligere brønde til kontrol. Forbered nok brønde til at have mindst overlappe brønde for hver behandling for hver transfektion.
- For tid bortfalder mikroskopi, replate cellerne straks i en 8-godt kammer borosilikat dækglas indeholdende 80 pi medium. Tilføj 1,5 pi af reaktionsblandingen (7,5 x 10 4 celler) til hvert kammer. (Prøv at undgå at bruge kamrene på kanten af dækglasset, kamrene i centrum af dækglasset er lettere at billedet).
BEMÆRK: Det er vigtigt, ikke alle cellerne svar på en udløser og lejlighedsvis time-lapse mikroskopi ophæves på grund af tab af fokus og afdrift af 8-godt kammer borosieksemplarer dækglas system. Derfor fremstilles mindst 8 kamre for hver behandling for hver transfektion. - For sensibilisering af celler for FceRI medieret aktivering tilsættes 1 ug / ml af muse DNP specifikt monoklonalt IgE til medierne (inkubere cellerne med IgE i mindst 2 timer).
- Efter 18-24 timer anvende et fluorescerende mikroskop for at bekræfte, at celler udtrykker plasmider. De excitations- og emissions- bølgelængder mRFP fluorescens er: X ex 584, Aem 607 nm. NPY-mRFP skal vises i vesikulære strukturer, der svarer til SGS. Hvis det andet gen af interesse er fusioneret til et fluorescerende mærke anvende et fluorescerende mikroskop for at bekræfte co-ekspression af begge plasmider i de samme celler. For eksempel, hvis det testede gen er fusioneret til GFP, The excitations- og emissionsbølgelængder af GFP-fluorescens er: X ex 488, Aem 507 nm. GFP mærkede protein skal vises på de samme celler, der udtrykker NPY-mRFP.
- For exocytose målinger fortsætte to trin 5 og tid bortfalder mikroskopi, skal du fortsætte til trin 6.
5. Måling NPY-mRFP exocytose
- Fremstilling af Tyrode buffer:
- Forbered en opløsning af 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl og 8 mM NaH 2 PO 4 i DDW. Bland godt og opbevares ved 4 ° C. Dette trin er til fremstilling af 20x Tyrode buffer.
- Der fremstilles en opløsning af 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM glucose og 1 til 20 fortynding af Tyrode 20x i DDW og bland godt. Dette trin er til fremstilling af 1x Tyrode buffer.
- Alikvot den 1x Tyrodes buffer og opbevares ved -20 ° C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning.
- Fjern kulturmediet fra 24-brønds plade og vaskes 3 gange med Tyrode-puffer. Forbered ustimulerede celler ved tilsætning af 200 pi Tyrode buffer til kontrolbrønde.
- Forbered 10 pl / brønd af 20X koncentreret aktiverende reagens [(fx 1.000 ng / ml DNP-BSA eller DNP-HSA (Ag), 200 uM Ca 2+ ionophor (f.eks A23187), og en kombination af 20 uM Ca 2+ ionophor og 1000 nM 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)]. Hvis reagenserne opbevares i DMSO, fortyndes reagenserne i 20x koncentration i Tyrode-puffer indeholdende 1% DMSO. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Fjern supernatanterne fra hver brønd omhyggeligt til en 96-brønds plade, anbringes på is og undgå fra lys. (Supernatanterne indeholder det kimære peptid NPY-mRFP der blev udgivet fra cellerne).
- Tilsæt 200 pi Tyrode buffer indeholdende 0,5% Triton X-100 til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. (Dette trin er vigtigt til fremstilling af cellelysater, som indeholder den resterende del af NPY-mRFP som ikke blev frigivet fra cellerne). Saml cellelysaterne og overføres til en 96-brønds plade, anbringes på is og undgå fra lys.
- Mål fluorescensen af cellesupernatanterne og cellelysater ved hjælp af en fluorescerning pladelæser under anvendelse af en 590-, 20 nm båndbredde excitationsfilter og 635-, 35 nm båndbredde emission filter.
- Procentdelen af NPY-mRFP frigives:
BEMÆRK: fluorescens læser foranstaltning vilkårlige fluorescensenheder (AFU). AFU værdier afhænger af maskinen og dens følsomhed og transfektionseffektivitet.- Indstil autofluorescens af ikke-transficerede RBL celler som tomme. Opdel AFU af hver supernatant til den samlede fluorescens (AFU af supernatanterne + AFU af den tilsvarende lysat) og gange med 100.
6. Time-lapse mikroskopi af exocytose
- Seed 7,5 x 10 4 af de transficerede celler / kammer i en 8-brønds kammer borsilicat dækglas system. Efter 18-24 timer, fjerne dyrkningsmediet fra kamrene og vask 3 gange med Tyrode buffer
- Tilføj 72 pi Tyrode buffer til hvert kammer. Fortynd aktiverende reagenser i Tyrode-puffer til 10x koncentration. <li> Brug et konfokalt fluorescensmikroskop udstyret med et opvarmet kammer (37 ° C) og CO 2 controller (4,8%) og en 40X eller 63X objektiv. Tænd mikroskop systemer: kviksølv lampe, computer, og lasere. Sørg for, at det opvarmede kammer er ved den rigtige temperatur, før du starter eksperimentet.
- Placer kammeret i den opvarmede kammer og sørg for, at kammeret er installeret korrekt og stabil.
- Tænd fluorescenslyset ifølge den relevante fluoroforen og visualisere transficerede celler. Sluk fluorescens, når en celle af interesse er inden for området for at minimere blegning og cytotoksicitet. Det er vigtigt, at dette felt vil indeholde omkring 2-3 transficerede celler. De transficerede celler skal være godt fordelt, men ikke rører hinanden.
- Juster lasereffekten (afhængigt af mikroskop) for at minimere støj og overmætning samt toksicitet og indstille gain og offset at ændre signal-støj-forholdet. Scan hurtigt i ellerder for at minimere varigheden af laser exposition (gennemsnit 2).
- Juster pinhole størrelse til et maksimum, giver dette faldende lasereffekten og opretholde billeder fokuseret i en lang periode. Hvis det ønskes, indstille parametre for Z stakken for at rekonstruere billedet i tredimensionelle, justere pinhole størrelse til 1 luftige enhed (AU), der giver det bedste signal støjforhold og erhverve successiv scanning af todimensionale konfokale optiske skiver i z -axes med optiske skiver ≤0.7 um.
- Indstil intervallet mellem hver erhvervelse til 15-30 sek og varigheden af den samlede erhvervelse til 15 min og begynde at erhverve billeder. Efter 5 min på erhvervelse pause tidsserien. Tilsæt 8 pi 10x udløse og fortsætte købet straks.
- Gem billederne, udføre deconvolution hjælp af en deconvolution software og rekonstruere stakke til tredimensionelle billeder og en film med Imaris software.
- Importere dataene fra deconvoluted tidsserie billeder, der blev opnået ved konfokal fluorescens mikroskop til Imaris software. Denne software læser mere end 40 mikroskopi filer. Hvis softwaren ikke kan læse filerne; konvertere filerne til TIF filer og import.
- Hvis du vil tilføje tidspunkter til enden af en åben datasæt tryk på Rediger -> Tilføj tidspunkter og importere de nye datasæt.
- Opret overflade mRFP kanalen ved hjælp guiden overflade mulighed. Vælg standard algoritme. Vælg den kanal af NPY-mRFP. Markér udjævning mulighed for at reducere støjen. For at undgå tab af små detaljer reducere området detaljeniveau til 0,05 um.
- Indstil tærsklen intensitet. Ny grå overflade vil blive vist. Gå til "Indstillinger" og skifte stil fra "Midtpunkt" til "Surface".
- Gå til statistik fane i egenskaberne for markerede objekt, skal du vælge den detaljerede fane og den specifikke værdi such som fluorescensintensitet, volumen etc.
- Gennemgå data og kontrollere, at værdierne er forenelige med billederne. For eksempel kan måles to eller flere tilstødende granulater som en større granulat. For at kvantificere den gennemsnitlige kornstørrelse opdele størrelsen af de fusionerede granulatet til det faktiske antal granuler.
- Eksporter de ønskede datasæt til Excel-filer og analysere data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund af den lave transfektionseffektivitet MCS, er det usandsynligt at efterlade en indvirkning på udlæsninger af gennemsnitlig sekretion målt af endogene SGS mediatorer genetiske manipulationer. Men ved at opnå fuldstændig co-ekspression af reportergenet NPY-mRFP og co-transficeret plasmid på de samme celler, overvågning af NPY-mRFP resulterer i udelukkende at overvåge cellepopulation, der udtrykker genet af interesse. Derfor fordel af dette assay sammenlignet med konventionelle metoder er evnen til selektivt at overvåge genetisk manipulerede celler (figur 1).
Faktisk, ved hjælp af dette assay har vi screenet gener der regulerer vesikulær handel, herunder opløselig NSF [N-ethylmaleimid følsomme fusion] fastgørelse protein-receptor (SNARE) proteiner og 44 medlemmer af Rab GTPaser familien. Vi identificerede gener, der regulerer SGsize, nummer, fragt sammensætning og exocytose 23.
We identificeret 30 Rabs der ændres (dvs. inhibere eller stimulere) exocytose i RBL-celler stimuleret med enten Ag eller ved kombination af en Ca2 + ionophor og phorbolester TPA (Ion / TPA) 23. Konfokal billeddannelse afslørede Snares og Rabs der forårsagede dramatiske fænotyper ændrer morfologi cellerne eller SGS 30,32. Konfokal billeddannelse af disse proteiner afslørede 8 Snares og Rabs der forårsagede dramatiske fænotyper på cellerne eller SG morfologi 30,32. Brug af denne protokol var vi i stand til at spore individuelle generalsekretærerne og udfører målinger af deres størrelse, fluorescensintensitet, deres bevægelser og exocytose. For eksempel har vi identificeret Rab5 som en regulator af SG biogenese 30. Rab5 er blevet identificeret som en mester regulator af endocytose og endosomal fusion 24. Vi har vist, at co-ekspression af konstitutivt negative (KN) BNP-låst mutanter af de endogent udtrykt isoformer af Rab5 (Rab5A, Rab5B og Rab5C) eller eXPRESSION af Rab5A / B / C målretning shRNAs, reduceret markant SGS 'størrelse med en samtidig stigning i deres antal 30. Omvendt ekspression af et GTP-låst, konstitutivt aktiv (CA) Rab5A mutant (Rab5A Q79L heri: "CA Rab5A"), som er kendt for at lette homotypisk fusion af tidlige endosomer (EBS) 24, resulterede i dannelsen af gigantiske Rab5A dekoreret vesikler, som vi identificeret som generalsekretærerne baseret på deres indhold af den sekretoriske fragt NPY-mRFP og serotonin, og deres evne til at exocytose på en reguleret måde 30.
Figur 2 viser morfometriske analyser af NPY-mRFP-holdige strain gauges. Den gennemsnitlige SGs volumen i CA Rab5A-udtrykkende celler nåede værdien 44 um 3, som var> 20 gange større end det gennemsnitlige volumen af SGS i kontrolgruppen GFP-udtrykkende celler, mens deres antal blev reduceret med 20-fold (Fig 2A). Det omvendte forholdmellem antallet og størrelsen SGS (figur 2A) foreslog, at Rab5-medierede udvidelse af SGS involverer deres homotypisk fusion. Kæmpen NPY-mRFP indeholdende generalsekretærerne dannet af CA Rab5A tillader konfokal mikroskopi billeddannelse af levende celler i en høj opløsning, som muliggør overvågning SGS i detaljer, der ikke kunne være muligt andet. For eksempel har vi opdaget Rab5A i fusionere generalsekretærerne sideløbende mindre strukturer spredt blandt de gigantiske SGS, mest sandsynligt svarer til endosomer (figur 2B). Derudover har vi vist, at Rab5 transient og fortrinsvis forbinder med nydannede generalsekretærerne tyder på, at den selektive og forbigående sammenslutning af Rab5A med nydannede SGs er kompatibel med en fusogent apparat, hvor kun nyligt genererede granulat har kapacitet til at fusionere med andre strain gauges 30.
Figur 3 viser repræsentative time-lapse billeder af MC giant strain gauges, der blev dannet ved ekspression af CARab5A og kinetik exocytose i løsningen af en enkelt SG efter stimulation. Under MC exocytose, SGS bevæge sig hen imod og fusionere med plasmamembranen. Som følge heraf den sekretoriske ladningen frigives fra cellerne ind i det ekstracellulære rum. I denne eksperimentelle system er NPY-mRFP frigivet fra cellerne og fundet i cellerne supernatanter. Fluorescensen af NPY-mRFP i cellesupernatanterne kan måles ved en fluorescens-læser. Men fordi NPY-mRFP fortyndes i supernatanterne sin fluorescenssignal ikke kan påvises eller visualiseres ved fluorescens mikroskopi,. Frigivelsen af NPY-mRFP fra granulerne under exocytose resulterer i en hurtig og dramatisk nedgang i NPY-mRFP fluorescensintensitet og krympning af NPY-mRFP-holdige SGS deres disappearance.Therefore, live cell imaging af stimulerede celler og målinger af NPY -mRFP fluorescensintensitet eller NPY-mRFP indeholdende SG størrelse giver præcise vurderinger af kinetikken for exocytose afindividuelle granuler. Figur 3B viser fluorescensintensiteterne SGS efter stimulering af cellerne med en Ca2 + ionophor. SGS gennemgår eksocytose på forskellige tidspunkter (dvs. 2, 3, 6 og 11 minutter efter stimulation), mens fluorescensintensiteten af en enkelt SG der ikke fusionere med plasmamembranen forblev konstant.
Figur 1:. Illustration af de vigtigste trin i protokollen RBL celler cotransficeret med NPY-mRFP og et andet gen af interesse eller tilsvarende kontrol plasmid og straks podet på dækglas, 8 brønde kammer borosilikat dækglas-system eller plader med 96 brønde. Næste dag, er billeder af den NPY-mRFP-holdige SGs i hvile og udløste celler erhvervet af konfokal mikroskopi (A). Desuden exocytose af resting og udløste cellsis kvantificeres ved at måle frigivelsen af NPY-mRFP i en 96 brønds plade fluorescenslæser (B).
Figur 2:. Kvantificering af SGS 'størrelse RBL celler blev cotransficeret med NPY-mRFP og enten GFP eller GFP-CA Rab5A og podet på 8 brønde kammer borosilikat dækglas system. 24 timer senere blev 8-brønds kammer placeret i laser konfokalt mikroskop udstyret opvarmet kammer (37 ° C). Z-stack billeder af på hinanden følgende billeder med optiske skiver 0,7 um blev taget med et / 1.4 numerisk mål åbning 63X olie. Billederne blev deconvoluted og tre dimension billeder blev bygget af Imaris software. Mængden af SGS og deres antal blev beregnet under anvendelse af Imaris software (A). En del af NPY-mRFP-holdige Granules synes at være indlejret i Rab5A (pilespidser). Andre er nøgne eller bro med Rab5A (pile). Scale bar = 5 um (B). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. Måling af omfanget og kinetik exocytose i løsningen af en enkelt SG i activatedRBL celler RBL celler blev cotransficeret med NPY-mRFP og GFP-CA Rab5A og podet IN8 brønde kammer borosilikat dækglas system. 24 timer senere IN8 brønde kammer blev anbragt i en laser konfokal mikroskop udstyret med et opvarmet kammer (37 ° C), og cellerne blev udløst med 10 uM Ca2 + ionofor. Billeder blev erhvervet hver 15 sek hjælp a / 1.4 numerisk mål åbning 63X olie. Billedervar deconvoluted og derefter behandlet af Imaris software. Scale bar = 5 um (A). Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af NPY-mRFP indeholdende granulat blev bestemt ved Imaris software og data blev normaliseret i forhold til tid 0 (tidspunkt for tilsætning af Ca2 + ionofor). Pilene repræsenterer tidspunkter, hvor frigivelsen af SGcargo wasnoted (B). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi, der kombinerer kvantificering af MCs exocytose og fire (x, y, z, t) dimension kvantificeringer af tidsforkortet tredimensional billeddannelse af SGS i levende celler under anvendelse af et reportergen for exocytose. Denne teknik gør det muligt for screening af familier af proteiner til deres indvirkning på MC-funktion, såsom overvågning generalsekretærerne starter så tidligt som deres exit fra Golgi gennem deres modning, køb af exocytose kompetence og degranulering. Kombinationen af målinger af exocytose samt morfometriske og kinetiske karakterisering af SGS giver indsigt i de mekanismer, som de testede proteiner medierer MC funktioner. Derfor bruger denne metode, kan genetisk manipulation af målrettede gener afsløre nye molekylære mekanismer, som MC SGs lagre og frigive deres last. Især kan NPY tjene som en reporter for exocytose i andre sekretoriske celler, såsom MCF-7-celler, en cellelinie afledt from et humant brystkirtel adenokarcinom 31, kromaffinceller 34 og pancreatiske β-celler 35.
Genetiske manipulationer er de mest kraftfulde værktøjer i øjeblikket er tilgængelige for at forske funktionelle netværk. Genetiske manipulationer føre til identifikation af essentielle proteiner i hvert netværk, hvis sletning vil håndhæve kollaps af systemet, i modsætning til andre proteiner, hvis sletning vil håndhæve krydstale mellem parallelle net eller ikke har nogen effekt på grund af redundans. Men på grund af den lave transfektionseffektivitet MCS ved måling exocytose af endogene mediatorer kun en lille brøkdel af celler, der udtrykker "manipulere" test-DNA. Derfor, når måling exocytose af endogene mediatorer, bidraget fra de transficerede celler til den samlede udlæsning er mindre. Derfor forsøger at vedtage en sådan tilgang til at udforske de komplekse netværk, der er forbundet med reguleret exocytose i MCs var hampered. Denne teknik overvinder forhindringen ved lave transfektionseffektivitet og giver en enkel måde at observere fænotypiske vekslen af MC SGs forårsaget af overekspression, knockdown og mutagenese af gener af interesse.
Denne teknik kan udvides til undersøgelse hierarkiet og tilstanden af interaktion af funktionelle netværk ved hjælp af forbigående triple-transfektion. Resultaterne vil blive analyseret for at bestemme hvilket gen kan redde en bestemt fænotype; forårsage en mere dramatisk fænotype eller ingen virkning. Baseret på sådanne kombinatoriske transfektionerne kan exocytose netværk konstrueres. For eksempel ved hjælp triple-transfektion var vi i stand til at identificere SNARE protein VAMP8 som en nedstrøms mediator i processen med Rab5-afhængige SG fusion 25.
Denne metode giver mulighed visualisering og kvantificering af exocytose i løsningen af enkelte strain gauges. Faktisk var vi i stand til at vise, at SGS display differentierede svar til stimuli. Grunden til, hvorfor visse generalsekretærerne fusioneret med plasmamembranen, mens andre ikke gjorde, eller årsagen til differentierede kinetik MC SG fusion endnu ikke fastlagt. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af denne eksperimenterende tilgang har potentiale til at besvare disse spørgsmål. For eksempel bør kvantificering af forskellige snarer eller Rabs på individuel SGs og korrelation med exocytose kompetence og kinetik exocytose i løsningen af en enkelt SG afslører nye regulatorer af exocytose.
Den største begrænsning ved denne teknik er den genetiske manipulation, fordi overekspression af et protein kan påvirke cellefunktion eller morfologi. Derfor er det vigtigt at validere resultaterne med komplementære metoder. For eksempel, når overekspression af en konstitutivt aktiv mutant inhiberer exocytose, virkningen af en konstitutiv negativ mutant eller vælte af genet skal testes så godt.
Ved hjælp af denne teknik, vi IDENTIFIED nye regulatorer af MC-funktioner, som påvirker MC exocytose eller ændre SG morfologi. Kombinationen af exocytose målinger sammen med generalsekretærerne morfometrisk karakterisering giver dybere indsigt i funktion og virkningsmekanismer af de testede proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr. U. Ashery for gaven af NPY-mRFP cDNA. Vi takker Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, og Y. Zilberstein for uvurderlig hjælp med mikroskopi og image-analyser. Vi takker også Dr. Joseph Orly til kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Israel Science Foundation, der blev grundlagt af Israel Akademi for Videnskaber (1139-1112 til RS-E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
