Summary
המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.
Abstract
תאי פיטום (MC) הם תאי הפרשה של המערכת החיסונית שלהשיג פונקציות הפיזיולוגיות ופתולוגיים שלהם על ידי שחרור מתווכים אלרגיים, דלקת וimmunoregulatory מראש יצר ומסונתזים חדש. המתווכים 'MCs משפיעים על רקמות ואיברים מרובים שהגיעו לשיא בתגובות אלרגיות וחיסוניות. הסינתזה, האחסון והשחרור של מתווכי MC קבוע בתקנות. המתווכים מראש יצר עמוסים בגרגירי cytoplasmic הפרשה (SG) שלהתמזג עם קרום הפלזמה ולשחרר את התוכן שלהם על ידי exocytosis המוסדר. אנו מציגים פרוטוקול, המבוסס על שיתוף הביטוי של גן של עניין עם גן כתב כי הוא ממוקד לSGS והוא שוחרר באופן מוסדר לצד מתווכי SG אנדוגני. הפרוטוקול מאפשר רזולוציה גבוהה ארבעה confocal ממדי ניתוחים של SGS MC וניטור ציר זמנם מbiogenesis לexocytosis מופעל. לפיכך, שימוש בפרוטוקול זה לסינון גנים של היתרest להשפעה פנוטיפי והפונקציונלית שלהם מאפשר פענוח המנגנונים המולקולריים השולטים בbiogenesis וexocytosis של SGS MC וזיהוי הרגולטורים מעורבים. וכך, תובנות נוספות המנגנונים התאיים שמהווים פונקצית MCs בבריאות ובמחלה צריכה להינתן.
Introduction
תאי פיטום (MC) הם תאים חיסוניים שידועות כי הם הטובים ביותר על מעורבותם בתגובות אלרגיות ודלקתיות כגון דלקת פרקים, אסטמה, דלקת ושט אאוזינופילית, דלקת עור כרונית והלם אנפילקטי 1,2 כמו גם פתולוגיות אחרות, כוללים מחלת לב כלילית 3.5 ו סרטן 3,4. בנוסף, מנחים ממלאים תפקידים חשובים בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות, גם בהגנת מארחת נגד חיידקים וטפילים ועל ידי דיכוי של מערכת חיסונית, למשל גרימת סובלנות שתל 5,6.
מנחי מקורן מח העצם, מתפתח מתאי CD34 pluripotent + / CD117 + 7. אבות MC מח עצם מחויב משתחררים לזרם הדם ונודדים לרקמות היקפי לוקליזציה בעיקר בתוך רקמות חיבור ומשטחי אפיתל 8. הבשלה והתמיינות מסוף מושגות סופו של דבר תחת השפעת of ציטוקינים בתוך 8,9 הסביבה שמסביב.
יכולים להיות מופעלים על ידי מנחים אלרגן (אנטיגן, Ag), מפגש שהסתיים בדור של E אימונוגלובולינים (IgE) הקלד נוגדנים. כריכה של IgE כזה לקולטנים FcεRI של MC, ואחריו cross-linking של תא קשור IgE על חשיפה מחדש לאותו Ag, תוצאות בצבירת FcεRI וייזום מפל איתות שמגיע לשיאו בdegranulation תא [שנסקרו ב10,11] . מנחים גם הופעלו, באופן בלתי תלוי IgE, על ידי נוירו 5,12, רעלי 13, חיידקים ואנטיגנים נגיפיים 14,15, מספר פפטידים בעלי מטען חשמלי חיוביים המכונים ביחד secretagogues הבסיסי, תאים וציטוקינים 5,13,12,16 חיסוניים , 17. מנחים גם מופעלים על ידי רב של המתווכים שלהם שוחררו, אשר עוד להגביר את התגובה הדלקתית.
מנחים הם ארוזים עם גרגירי הפרשה (SGS) המכילים חיסונימתווכי רגולציה, כוללים אמינים vasoactive, כגון היסטמין וסרוטונין (במכרסמים), proteoglycans, פרוטאזות, כגון chymase וtryptase, גורם גדילה של אנדותל כלי דם וכמה ציטוקינים וכמוקינים 8,9. מתווכים אלה הם "מוכנים ללכת" ופעם אחת MCs מופעל על ידי גירוי מתאים, מתווכים אלה משתחררים מהתאים על ידי exocytosis המוסדר (degranulation) בעניין של שניות עד דקות 18,19. אירוע ראשוני זה ואחריו סינתזת דה נובו ושחרורו של מגוון רחב של חומרים ביולוגיים חזקים, כוללים מטבוליטים הארכידונית חומצה, ציטוקינים מרובים וכמוקינים 20,21,22. שחרור של מוצרים מסונתזים חדש מתרחש באופן עצמאי של שחרור SG. באופן קולקטיבי, מתווכים אלה ליזום מוקדמים ושלב מאוחר דלקתי ואלרגי תגובות. לכן, הבנת המנגנונים המהווים הפעלת MC וdegranulation שניהם של שד תיאורטי וקליניortance.
הקושי לתמרן גנטי MCs הראשוני והתרבותי שהקשה על הניסיונות להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס degranulation MC, שנשאר גרוע נפתר. מנחים כדי להתגבר על בעיה זו פיתחנו מבוסס assay כתב ידי, לוקמיה basophilic עכברוש קו תא פיטום ברירית transfecting-שיתוף (RBL) -2H3 (המכונים במסמך זה כלRBL) או מח עצם נגזרים (BMMCs) 30 עם גן של עניין ו Neuropeptide Y (NPY) התמזג RFP monomeric (mRFP), ככתב SG.
NPY הוצג בעבר לשחזר את התנהגותם של סמני SG אנדוגני במערכות אחרות. יתר על כן, מכיוון שקרינת mRFP הוא pH רגיש, ביטוי של NPY-mRFP מאפשר הדמיה של SGS חומציים כמו גם הערכה כמותית של exocytosis באמצעות 96-גם צלחות וקורא צלחת הקרינה. הראינו כי NPY-mRFP מועבר לSGS חומצי של תאי RBL וBMMCs והוא שוחרר מהתאיםבאופן מוסדר לצד מטען SG אנדוגני (כלומר, β-hexosaminidase וסרוטונין) 30, 32. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה המבוססת על הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת גני הקרנה של עניין לפנוטיפי שלהם והשפעה תפקודית על מאפייני SG וdegranulation בתאי RBL 32. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מאפשר מעקב בזמן אמת של MC SGS וכימות של האזור שלהם או גודל נפח, מספרם, קינטיקה של הרכבה, תנועתם לאורך שלד תא התא וההיתוך האולטימטיבי שלהם עם קרום הפלזמה בתנאים שונים. לדוגמא, רגישות התאים עם DNP-הספציפי IgE ומפעיל את התאים עם Ag רב-ערכי (אלבומין בסרום מצומדות DNP) תחת הפרעות שונות (כלומר, מציאה של גנים של עניין, על ביטוי של גני WT או מוטציה, או מניפולציות תרופתיות) ו השוואה לשלוט תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Cell RBL תרבות מדיה
- מערבבים 500 מיליליטר של המדיום של הנשר שונה של גלוקוז הנמוך Dulbecco (DMEM) עם 56 מיליליטר של סרום שור עוברי (זה עושה 10% FBS), ולאחר מכן להוסיף 5.5 מיליליטר של סטרפטומיצין פניצילין (זה עושה דברה ~ 1%).
- סנן את התקשורת באמצעות מסנני אבק בקבוק למעלה 500-1,000 מיליליטר עם גודל הנקבובית 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
2. תרבות של תאי RBL
- לגדל תאי RBL באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס בשתי צלחות או צלוחיות. תאי RBL שגדלים בצלחות 10 סנטימטר צריכים להיות בתוספת 10 מיליליטר בינוני וליצור monolayer ומחוברות של ~ 10 7 תאים / צלחת.
- כאשר שכבת התאים מתקרבת מפגש, replate התרבות בצפיפות נמוכה יותר.
- הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק בעזרת פיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום.
- יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed (37מעלות צלזיוס) 0.25% טריפסין / EDTA המכסה את כל monolayer (הנפח תלוי בגודל של צלחת התרבות / בקבוק; 2 מיליליטר במשך 10 צלחת סנטימטרים). זה לנתק את התאים.
- לחלופין, לשטוף את monolayer התא עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), להסיר את PBS ולהוסיף (37 ° C) טריפסין prewarmed / EDTA. צעד זה מנתק את התאים מהירים יותר.
- מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות).
- בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ האופטי כדי לבדוק אם הם מנותקים. אם התאים לא לנתק אחרי 10 דקות, לטפוח בעדינות על הצלחת / הבקבוק.
- הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של המדיום צריך להיות לפחות פי 2 יותר גדולים מהנפח של פתרון טריפסין).
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 גרם ב 25 ° C.
- Resuspend התאים בינוניים. לדלל את התאים על ידי 01:10 וזרע בצלחת התרבות חדשה. דגירה התאים במשך 48-72 שעות, עד שהם reacמפגש כ -90% h.
- חזור על אותו ההליך (סעיף 2.2.1-2.2.8) לתקופה של עד 3 חודשים (30 קטעים).
3. הכנת Transfection מדיה.
- הכן פתרון 100 מ"מ של K-צינורות pH 7, 1 פתרון מ"מ של אצטט Ca 2 + ו -100 מ"מ פתרון של אצטט Mg 2 +.
- לדלל את הפתרון של pH K-צינורות 7 מ"מ 100 ל -20 מ"מ באמצעות תקשורת DMEM, להוסיף את פתרון 1 מ"מ של אצטט Ca 2 + לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו -100 מ"מ פתרון של אצטט Mg 2 + לריכוז סופי של 2 מ"מ.
- שוקל גלוטמט אשלגן ולהוסיף לפתרון לריכוז סופי של 128 מ"מ, ומערבב היטב ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. שמור את הפתרונות שנותרו (כלומר., K-צינורות, Ca 2 + אצטט, Mg 2 + אצטט) ב -20 ° C.
4. Transfection של תאי RBL
- הסר את מדיום התרבות מהצלחת / הבקבוק באמצעותפיפטה פסטר סטרילי מחוברת לואקום.
- יש לשטוף את monolayer התא עם prewarmed טריפסין (37 מעלות צלזיוס) / EDTA צריך שמכסה את כל השכבה. מניחים את הצלחת / הבקבוק באינקובטור ב 37 ° C (לא יותר מ -10 דקות). בדקו אם התאים יש מנותקים באמצעות מיקרוסקופ האופטי.
- הוסף בינוני לצלחת התרבות / הבקבוק להשעות את התאים (הנפח של התקשורת צריך להיות לפחות 2-גדולים יותר מאשר הנפח של פתרון טריפסין).
- לספור את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
- גלולה 1.5 × 10 7 תאים על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 XG ב 25 ° C. מחק את supernatants ולהוסיף 280 μl של מדיום transfection. העבר את תערובת התגובה ל -4 קובט מ"מ.
- הוסף 20 מיקרוגרם של פלסמיד NPY-mRFP וגם 30 מיקרוגרם של פלסמיד הריק שליטה או פלסמיד נבדק. הנפח הסופי של תערובת התגובה צריך להיות 300 μl.
- מייד מניח על קרח במשך 10 דקות. נגב את קובט ממים וp שיירroceed לelectroporation ב 300 V ל9 msec.
- למדידות של exocytosis, replate התאים באופן מיידי ב -24 מנות בתרבית רקמה המכילות גם 300 בינוני μl. הוסף 8 μl של תערובת התגובה (4 × 10 5 תאים) זה טוב. להוסיף תאי transfected 4 שאינם × 10 5 לבארות נוספות לשליטה. הכן מספיק בארות ליש לפחות לשכפל בארות עבור כל טיפול לכל transfection.
- למיקרוסקופיה זמן לשגות, replate התאים באופן מיידי במערכת coverglass הקאמרית ורוסיליקט 8-היטב המכילה 80 בינוני μl. להוסיף 1.5 μl של תערובת התגובה (7.5 × 10 4 תאים) לכל תא. (נסה להימנע משימוש בתאי בקצה coverglass, התאים במרכז coverglass קלים יותר לתמונה).
הערה: חשוב לציין, שלא כל תאי תגובה להדק ולעתים מיקרוסקופיה הזמן לשגות היא בטלה כתוצאה מאובדן המיקוד וסחיפה של borosi קאמרי 8 היטבמערכת coverglass licate. לכן, להכין לפחות 8 תאים עבור כל טיפול לכל transfection. - לרגישות התאים להפעלה בתיווך FcεRI, להוסיף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של DNP העכבר חד שבטי ספציפיים IgE לתקשורת (דגירה התאים עם IgE לפחות 2 שעות).
- לאחר 18-24 שעות להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שהתאים להביע פלסמידים. אורכי גל העירור ופליטה של הקרינה mRFP הם: 584 λEx, λEm 607 ננומטר. NPY-mRFP אמורה להופיע במבני לפוחי שהמתאימים לSGS. אם הגן השני של עניין הוא התמזגה לתג פלורסנט להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את שיתוף הביטוי של שני פלסמידים באותו התאים. לדוגמא, אם הגן נבדק התמזג GFP, אורכי גל העירור ופליטה של הקרינה GFP הם: 488 λEx, λEm 507 ננומטר. חלבון GFP מתויג אמור להופיע באותו תאים המבטאים NPY-mRFP.
- למדידות exocytosis להמשיך to שלב 5 ולמיקרוסקופיה הזמן לשגות, המשך לשלב 6.
5. מדידת NPY-mRFP Exocytosis
- הכנת חיץ Tyrode:
- הכן פתרון של 54 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgCl 2, 2.74 M NaCl ו -8 מ"מ לאא 2 PO 4 בDDW. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה נועד להכנת 20x חיץ Tyrode.
- הכן פתרון של 20 מ"מ Hepes pH 7, 1.8 מ"מ CaCl 2, 1 מ"ג / מיליליטר BSA, גלוקוז 5.6 מ"מ ו1 עד 20 דילול של Tyrode 20x בDDW ומערבבים היטב. צעד זה נועד להכנת מאגר 1x Tyrode.
- Aliquot מאגר 1x Tyrode ולאחסן ב -20 ° C. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
- הסר את מדיום התרבות מהצלחת גם 24 ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode. הכן תאי unstimulated ידי הוספת חיץ Tyrode 200 μl לשלוט בארות.
- הכן 10 μl / טוב של 20X מרוכז הפעלה מגיב [(למשל 1,000 ng / DNP-BSA מיליליטר או DNP-HSA (Ag), 200 ionophore 2 + מיקרומטר Ca (למשל A23187), ושילוב של 20 מיקרומטר Ca 2 + ionophore ו1,000 ננומטר tetradecanoylphorbol-13-אצטט 12-O- (TPA)]. אם ריאגנטים מאוחסנים בDMSO, לדלל את ריאגנטים ל20x ריכוז במאגר Tyrode המכיל 1% DMSO. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הסר את supernatants של כל טוב בזהירות לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור. (Supernatants מכיל פפטיד chimeric NPY-mRFP ששוחרר מהתאים).
- הוסף 200 μl חיץ Tyrode המכיל 0.5% Triton X-100 זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (שלב זה חשוב להכנת lysates תא המכיל את שנותר מNPY-mRFP שלא שוחרר מהתאים). לאסוף lysates התא ולהעביר לצלחת גם 96, מניח על קרח ולהימנע מהאור.
- למדוד את הקרינה של supernatants התא וlysates תא באמצעות fluorescקורא צלחת ence, באמצעות 590-, 20 ננומטר רוחב פס עירור מסנן ו635-, מסנן פליטת רוחב פס 35 ננומטר.
- לחשב את אחוז NPY-mRFP שוחרר:
הערה: מדד הקרינה קורא יחידות הקרינה שרירותית (עפו). ערכים עפו תלויים במכונה ואת הרגישות שלו ואת יעילות transfection.- הגדר את autofluorescence של תאי RBL nontransfected ריקים. מחלקים את עפו של כל supernatant לקרינה הכוללת (עפו של supernatants + עפו של lysate המקביל) ולהכפיל ב -100.
6. זמן לשגות מיקרוסקופית של Exocytosis
- זרע 7.5 × 10 4 תאים / תא transfected במערכת coverglass קאמרי ורוסיליקט 8 היטב. לאחר 18-24 שעות, להסיר את מדיום התרבות מהתאים ולשטוף 3 פעמים עם חיץ Tyrode
- להוסיף 72 μl של חיץ Tyrode לכל תא. לדלל את ריאגנטים הפעלה במאגר Tyrode ל10x ריכוז. <li> השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal מצויד בחדר מחומם (37 מעלות צלזיוס) ו- CO 2 בקר (4.8%) ואובייקטיבי 40X או 63X. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. ודא שהחדר המחומם הוא בטמפרטורה הנכונה לפני תחילת הניסוי.
- מניחים את החדר בחדר המחומם ולוודא כי התא מותקן בצורה נכונה ויציב.
- להדליק את אור פלואורסצנטי לפי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנה וcytotoxicity. חשוב שהתחום זה יכיל כ 2-3 תאי transfected. תאי transfected צריכים להתפשט גם, אבל לא נוגעים זה בזה.
- להתאים את כוח הלייזר (תלוי במיקרוסקופ) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעילות, ולהגדיר את הרווח לקזז לשנות את יחס האות לרעש. סריקה מהירה באו der כדי למזער את משך חשיפת לייזר (ממוצע 2).
- התאם את גודל חריר למקסימום, זה מאפשר להקטין את כוח הלייזר ולשמור תמונות ממוקדות לתקופה ארוכה של זמן. אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z לשחזר את התמונה בשלוש ממדי סריקה, להתאים את גודל חריר ליחידה אוורירית 1 (AU) שנותן את האות הטוב ביותר יחס רעש ולרכוש רצופה של פרוסות אופטיות confocal דו-ממדיות ב -axes z עם פרוסות אופטיות ≤0.7 מיקרומטר.
- להגדיר את זמן ההפסקה בין כל רכישה 15-30 שניות ומשך הרכישה כוללת של 15 דקות ולהתחיל לרכוש תמונות. לאחר 5 דקות של רכישה להשהות את סדרת הזמן. הוסף 8 μl של ההדק 10x ולהמשיך הרכישה באופן מיידי.
- שמור את התמונות, לבצע deconvolution באמצעות תוכנת deconvolution ולשחזר את הערימות לשלוש תמונות ממדיות ולסרט באמצעות תוכנת Imaris.
s = "jove_title"> 7. ניתוח תמונה
- לייבא נתונים מתמונות סדרת זמן deconvoluted שהתקבלו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לתוכנת Imaris. תוכנה זו קוראת יותר מ -40 קבצי מיקרוסקופיה. אם התוכנה לא יכולה לקרוא את הקבצים; להמיר את הקבצים לקבצים ויבוא tif.
- כדי להוסיף נקודות זמן לסיום עריכה לחץ על Set נתונים פתוח -> הוסף נקודות זמן ולייבא את הנתונים החדשים שנקבעו.
- צור פני השטח של ערוץ mRFP שימוש באפשרות אשף פני השטח. בחר אלגוריתם ברירת המחדל. בחר הערוץ של NPY-mRFP. סמן את אפשרות ההחלקה כדי להפחית את הרעש. כדי למנוע אובדן של פרטים קטנים להפחית את רמת פירוט אזור 0.05 מיקרומטר.
- הגדר את סף העצמה. משטח אפור חדש יוצג. עבור אל "הגדרות" ולעבור את הסגנון מ" נקודת מרכז "עד" Surface ".
- עבור לכרטיסיית נתון במאפיינים של אובייקט שנבחר, בחר בכרטיסייה מפורטת וsuc הערך הספציפיh כעוצמת הקרינה, נפח וכו '
- סקור את הנתונים ולוודא שהערכים תואמים לתמונות. לדוגמא, שתיים או יותר גרגרים סמוכים עשויים להימדד כגרגיר אחד גדול. לכימות גודל הגרגר הממוצע לחלק את גודל הגרגרים הממוזגים למספר האמיתי של גרגרים.
- לייצא את ערכות נתונים הרצויות לקבצי Excel ולנתח את הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בגלל יעילות transfection הנמוכה של MCS, מניפולציות גנטיות צפויים לעזוב השפעה על קריאות של הפרשה ממוצעת שנמדדו על ידי מתווכי SGS אנדוגני. אף על פי כן, על ידי הקמת שיתוף ביטוי מלא של גן הכתב NPY-mRFP ופלסמיד שיתוף transfected באותו התאים, ניטור של תוצאות NPY-mRFP בניטור באופן בלעדי אוכלוסיית התאים המבטאת את הגן של עניין. לכן, היתרון של assay זה בהשוואה לשיטות קונבנציונליות הוא היכולת לנטר באופן סלקטיבי תאי מניפולציות גנטיים (איור 1).
ואכן, באמצעות assay זה יש לנו הוקרן גנים המווסתים סחר לפוחי כולל NSF המסיס קולט חלבון מצורף חלבונים (מלכודת) [היתוך רגיש N-ethylmaleimide] ו -44 בני משפחת GTPases ראב. זיהינו גנים המווסתים SGsize, מספר, הרכב משא וexocytosis 23.
Wהדואר זיהה 30 הראב ששינה (כלומר, לעכב או לעורר) exocytosis בתאי RBL מגורה על ידי שני Ag או על ידי השילוב של ionophore Ca 2 + ואסתר phorbol TPA (יון / TPA) 23. ההדמיה confocal חשפה מלכודות והראב שגרמו פנוטיפים דרמטיים לשנות את המורפולוגיה של תאים או SGS 30,32. ההדמיה confocal של חלבונים אלה חשף 8 מלכודות והראב שגרמו פנוטיפים דרמטיים על התאים או מורפולוגיה SG 30,32. שימוש בפרוטוקול זה היינו יכול לעקוב אחר SGS הבודד ולבצע מדידות של גודלם, עוצמת הקרינה, התנועה וexocytosis. לדוגמא, זיהינו Rab5 כרגולטור של biogenesis SG 30. Rab5 זוהה כרגולטור ראשי של אנדוציטוזה וendosomal היתוך 24. אנחנו הראינו כי שיתוף ביטוי של מוטציות constitutively שליליים (CN)-נעול תמ"ג של isoforms הביע אופן אנדוגני של Rab5 (Rab5A, Rab5B וRab5C), או בדוארXpression של Rab5A / B / C מיקוד shRNAs, צמצם באופן משמעותי את הגודל 'SGS עם גידול מקביל במספרם 30. לעומת זאת, ביטוי של, מוטציה-נעול GTP constitutively-אקטיבית (CA) Rab5A (Rab5A Q79L, להלן: "Rab5A CA"), אשר ידוע כדי להקל על היתוך homotypic של endosomes המוקדם (EES) 24, הביא להיווצרותו של ענק שלפוחית מעוטרת Rab5A, אשר זיהינו כSGS המבוסס על התוכן שלהם מטען הפרשת NPY-mRFP וסרוטונין, והיכולת שלהם exocytose באופן מוסדר 30.
איור 2 מדגים ניתוחי morphometric של SGS NPY-mRFP המכיל. ממוצע נפח SGS בתאים לבטא-Rab5A CA הגיע לערך של 44 מיקרומטר 3, שהיה> 20-לקפל גדולים יותר מממוצע הנפח של SGS בשליטת תאים בעוד מספרם הירד ב 20 פי להביע GFP (איור 2 א). היחס ההפוךבין המספר והגודל של SGS (איור 2 א) הציע כי הגדלת תיווך Rab5 של SGS כרוך היתוך homotypic. NPY-mRFP הענק המכיל SGS שהוקם על ידי Rab5A CA מאפשר הדמיה מיקרוסקופית confocal של תאי חיים ברזולוציה גבוהה המאפשר ניטור SGS בפרטים שלא יכול להיות אפשרי בדרך אחרת. לדוגמא, זיהינו Rab5A בפיוזינג SGS לצד מבנים קטנים יותר מפוזרים בין SGS הענק, ככל הנראה מתאים לendosomes (איור 2). בנוסף, יש לנו הראינו כי Rab5 זמני ורצוי מקורבים עם SGS שהוקם זה עתה מצביע על כך שהעמותה סלקטיבית וחולפת של Rab5A עם SGS שהוקם זה עתה בקנה אחד עם מנגנון fusogenic שבו יש רק גרגירים שנוצרו זה עתה את היכולת להתמזג עם 30 SGS האחר.
איור 3 מראה זמן לשגות תמונות נציג של ענקית SGS MC שנוצרו על ידי ביטוי של CARab5A וקינטיקה של exocytosis ברזולוציה של SG בודד לאחר גירוי. במהלך exocytosis MC, SGS לנוע לעבר ולהתמזג עם קרום הפלזמה. כתוצאה מכך מטען ההפרשה משתחרר מהתאים אל חלל החוץ תאי. במערכת הניסיונית הזה, NPY-mRFP משתחרר מהתאים ונמצא בsupernatants התאים. הקרינה של NPY-mRFP בsupernatants התא ניתן למדוד על ידי קורא הקרינה. עם זאת, מכיוון שNPY-mRFP מדולל בsupernatants אות הקרינה שלה לא ניתן לאתר או דמיין ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שחרורו של NPY-mRFP מהגרגירים בתוצאות exocytosis בירידה מהירה ודרמטית בעוצמת הקרינה NPY-mRFP והצטמקות של SGS NPY-mRFP המכיל וdisappearance.Therefore, ההדמיה תא חי של תאים ומדידות של NPY מגורה עוצמת הקרינה -mRFP או גודל SG מכיל NPY-mRFP לספק הערכות מדויקות של קינטיקה של exocytosis שלגרגרים בודדים. איור 3 מציג את עוצמות הקרינה של SGS לאחר גירוי התאים עם ionophore Ca 2 +. SGS לעבור exocytosis בנקודות זמן שונה (כלומר, 2, 3, 6, ו -11 דקות לאחר גירוי), ואילו עוצמת הקרינה של SG יחיד שלא מתאחה עם קרום הפלזמה נשארה קבועה.
איור 1:. תאי איור של השלבים העיקריים של הפרוטוקול RBL הם cotransfected עם NPY-mRFP וגן שני של עניין או מקביל פלסמיד שליטה וזורעים מייד על coverslips, מערכת coverglass 8-גם תא ורוסיליקט או 96-גם צלחות. למחרת, תמונות של SGS NPY-mRFP המכיל במנוחה ותאים מופעלים נרכשים על ידי מיקרוסקופ confocal (). בנוסף, exocytosis של resting ומופעל cellsis לכמת על ידי מדידת שחרורו של NPY-mRFP בקורא 96 צלחת גם הקרינה (B).
איור 2:. תאי כימות של הגודל 'SGS RBL היו cotransfected עם NPY-mRFP וגם GFP או Rab5A GFP-CA וזורעים על מערכת coverglass קאמרי ורוסיליקט 8 היטב. 24 שעות מאוחר יותר, קאמרי 8-גם הושם בתא מיקרוסקופ confocal הלייזר מצויד מחומם (37 מעלות צלזיוס). תמונות Z-ערימה של תמונות רצופות עם פרוסות אופטיות 0.7 מיקרומטר נתפסו באמצעות / 1.4 מטרת צמצם מספרית 63X שמן. התמונות היו deconvoluted ושלוש תמונות ממד נבנו על ידי תוכנת Imaris. הנפח של SGS ומספרם חושבו באמצעות תוכנת Imaris (). חלק מgranu NPY-mRFP המכילles מופיע להיות מוטבע בתוך Rab5A (ראשי חץ). אחרים הם עירום או לגישור עם Rab5A (חיצים). בר סולם = 5 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. תאי מדידה ברזולוציה של SG יחיד בתאי activatedRBL המידה וקינטיקה של exocytosis RBL היו cotransfected עם NPY-mRFP ומערכת coverglass זורעים in8 היטב קאמרי ורוסיליקט Rab5A וGFP-CA. 24 שעות מאוחר יותר קאמרי in8 היטב הוצב במיקרוסקופ confocal לייזר מצויד בחדר מחומם (37 ° C) והתאים היו מופעלים עם 10 מיקרומטר Ca 2 + ionophore. תמונות נרכשו כל 15 שניות באמצעות / 1.4 מטרת צמצם מספרית 63X שמן. תמונותהיו deconvoluted ולאחר מכן מעובד על ידי תוכנת Imaris. בר סולם = 5 מיקרומטר (A). עוצמת הקרינה הממוצעת של NPY-mRFP הגרגירים המכילים נקבעה על ידי תוכנת Imaris והנתונים היו מנורמלים לפי זמן 0 (זמן של תוספת של Ca 2 + ionophore). החצים מייצגים את נקודות הזמן שבו שחרורו של SGcargo wasnoted (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים אסטרטגיה חדשנית המשלבת כימות של exocytosis המנחים וארבעה (x, y, z, t) quantifications ממד על ידי הדמיה תלת-ממדית-פקע זמן של SGS בתאים חיים באמצעות גן מדווח לexocytosis. טכניקה זו מאפשרת הקרנה של משפחות של חלבונים להשפעתם על תפקוד MC כגון SGS הניטור מתחילות כבר ביציאתם מGolgi דרך התבגרותם, רכישה של מיומנות exocytosis וdegranulation. השילוב של מדידות של exocytosis יחד עם אפיוני morphometric והקינטית של SGS מספק תובנות המנגנונים שבאמצעותם החלבונים נבדקו לתווך פונקציות MC. לכן, שימוש במתודולוגיה זו, מניפולציה גנטית של גנים ממוקדים יכולה לחשוף מנגנונים מולקולריים חדשים שבו החנות וMC SGS לשחרר את מטענם. יש לציין, NPY יכול לשמש ככתב exocytosis בתאי הפרשה אחרים כגון MCF-7 תאים, fr שורת תאים נגזראום אדנוקרצינומה בלוטת החלב אנושית 31, תאי chromaffin 34 וβ-תאי לבלב 35.
מניפולציות גנטיות הם הכלים החזקים ביותר העומדים כיום לחקר רשתות פונקציונליות. מניפולציות גנטיות תאפשר זיהוי של חלבונים חיוניים בכל רשת, מחיקה שתאכוף קריסה של המערכת, בניגוד לחלבונים אחרים, מחיקה שיאכוף crosstalk בין רשתות מקבילות או אין להם השפעה בשל יתירות. עם זאת, בשל יעילות transfection הנמוכה של MCS, כאשר מודדים exocytosis של מתווכי אנדוגני רק חלק קטן של תאים המבטאים את ה- DNA המבחן "מניפולציה". לפיכך, בעת מדידת exocytosis של מתווכי אנדוגני, התרומה של תאי transfected לקריאה הכוללת היא קטין. לכן, מנסים לאמץ גישה כזו כדי לחקור את הרשתות המורכבות הקשורים לexocytosis המוסדר במנחים היה חהmpered. טכניקה זו מתגברת על המכשול של יעילות transfection הנמוכה ומספקת דרך פשוטה לשמור חילופים פנוטיפי של MC SGS שנגרמו על ידי על ביטוי, מציאה וmutagenesis של הגנים של עניין.
טכניקה זו ניתן להרחיב לחקירת ההיררכיה והמצב של אינטראקציה של רשתות פונקציונליות באמצעות משולש transfection החולף. התוצאות תנותח כדי לקבוע אילו גנים יכולים להציל את הפנוטיפ מסוים; לגרום פנוטיפ דרמטי יותר או אין להם השפעה. בהתבסס על transfections קומבינטורית כזה, ניתן לבנות רשתות exocytosis. לדוגמא, באמצעות משולש transfection הצלחנו לזהות את חלבון VAMP8 מלכודת כמתווך במורד הזרם בתהליך של היתוך SG Rab5 תלוי 25.
שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של exocytosis ברזולוציה של SGS היחיד. ואכן הצלחנו להראות כי תגובות ההפרש תצוגת SGS לSTIMUli. הסיבה מדוע SGS מסוים התמזגו עם קרום הפלזמה ואחרים לא, או הסיבה לקינטיקה ההפרש של היתוך SG MC להישאר שתיקבע. יש מחקרים עתידיים באמצעות גישה ניסויית זו יש פוטנציאל לענות על שאלות אלה. לדוגמא, כימות של מלכודות שונות או הראב על SGS פרט ומתאם עם יכולת exocytosis וקינטיקה של exocytosis ברזולוציה של SG אחד צריכה לחשוף רגולטורי רומן של exocytosis.
המגבלה העיקרית של שיטה זו היא המניפולציה הגנטית, כי ביטוי יתר של חלבון עלול להשפיע על תפקוד תא או מורפולוגיה. לכן, זה הכרחי כדי לאמת את התוצאות עם גישות משלימות. לדוגמא, כאשר ביטוי יתר של מוטציה פעילה constitutively מעכב exocytosis, ההשפעה של מוטציה שלילית מכוננת או להפיל של הגן צריך להיבדק גם כן.
שימוש בטכניקה זו, אנו identifרגולטורי רומן IED של פונקציות MC, המשפיעות על exocytosis MC או לשנות את מורפולוגיה SG. השילוב של מדידות exocytosis יחד עם אפיון morphometric SGS מספק תובנות עמוקות יותר לתוך הפונקציה ומנגנוני הפעולה של החלבונים שנבדקו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר א Ashery על המתנה של NPY-mRFP cDNA. אנו מודים בני הזוג. MJ Kofron, ל 'מיטלמן, מ' שרבני, וי 'זילברשטיין לסיוע לא יסולא בפז עם מיקרוסקופ ותמונת ניתוחים. כמו כן, אנו מודים לד"ר יוסף אורלי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע, שנוסד על ידי האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים (1139-1112 לRS-E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
