Summary
Målet med detta protokoll var att utveckla en metod som gör att funktionsgenomiska analyser av mastcellutsöndring. Protokollet bygger på kvantitativ bedömning av frisläppandet av en fluorescerande reporter gen cotrasfected med genen av intresse och realtidsanalyser av den sekretoriska granulat morfologi.
Abstract
Mastceller (MC) är sekretoriska celler i immunsystemet som utföra deras fysiologiska och patologiska funktioner genom att släppa förformade och nysyntetiserade allergiska, inflammatoriska och immunregulatoriska mediatorer. MCS medlare påverka flera vävnader och organ som kulminerar i allergiska och immunsvar. Syntesen, lagring och frisättning av MC medlarna är starkt reglerad. De förformade mediatorer är förpackade i cytoplasmiska sekretoriska granuler (SG) som smälter med plasmamembranet och frigör deras innehåll genom reglerad exocytos. Vi presenterar ett protokoll, baserat på samtidigt uttryck av en gen av intresse med en reporter gen som är riktad till SGS och släpps i ett reglerat sätt vid sidan av de endogena SG medlare. Protokollet möjliggör hög upplösning fyrdimensionell konfokal analyser av MC SGS och övervaka deras tidslinje från biogenes till utlöst exocytos. Således använder detta protokoll för screening gener av interest för deras fenotypiska och funktionella påverkan tillåter dechiffrera de molekylära mekanismer som styr biogenes och exocytos av MC SGS och identifiera de tillsynsmyndigheter som berörs. Därmed bör ytterligare insikter i de cellulära mekanismer som står för MCs funktion i hälsa och sjukdom lämnas.
Introduction
Mastceller (MC) är immunceller som är mest känd för sin medverkan i allergiska och inflammatoriska reaktioner som artrit, astma, eosinofil esofagit, kronisk dermatit och anafylaktisk chock 1,2 samt andra patologier inklusive kranskärlssjukdom 3,5 och cancer 3,4. Dessutom MCs spelar viktiga roller i medfödda och adaptiva immuniteten, både i värd försvar mot bakterier och parasiter och genom undertryckande av immunsvar, exempelvis inducera allograft tolerans 5,6.
MCs härstammar från benmärgen, utvecklas från CD34 + / CD117 + pluripotenta stamceller 7. Engagerat benmärgs MC gångare släpps ut i blodomloppet och migrera in i de perifera vävnaderna lokalisera främst inom bindväv och epitelytor 8. Mognad och terminal differentiering så småningom uppnås under påverkan of cytokiner inom omgivande miljö 8,9.
MCs kan aktiveras av ett allergen (antigen, Ag), vars möte resulterade i generering av immunoglobulin E (IgE) typ antikroppar. Bindning av sådant IgE till MC: s FceRI receptorer, följt av tvärbindning av cellbundet IgE vid återexponering till samma Ag, resultat i FceRI aggregering och initiering av en signalkaskad som kulminerar i cell degranulering [ses över 10,11] . MCs aktiveras också, oberoende av IgE, genom neuropeptider 5,12, toxiner 13, bakteriella och virala antigener 14,15, ett antal positivt laddade peptider kollektivt kallade grundläggande sekretagoger, immunceller och cytokiner 5,13,12,16 , 17. MCs aktiveras också av många av deras egna frigjorda mediatorer, som ytterligare förstärker det inflammatoriska svaret.
MCs är packade med sekretoriska granuler (SGS) som innehåller immunoregulatoriska mediatorer, däribland vasoaktiva aminer, såsom histamin och serotonin (hos gnagare), proteoglykaner, proteaser, såsom chymas och tryptas, vaskulär endotel tillväxtfaktor och flera cytokiner och kemokiner 8,9. Dessa mediatorer är "redo att gå" och en gång MCs aktiveras genom en lämplig stimulans dessa mediatorer frigörs från cellerna genom reglerat exocytos (degranulering) på några sekunder till minuter 18,19. Denna inledande händelse följs av de novo syntes och frisättning av ett stort utbud av biologiskt potenta substanser, inklusive arakidonsyrametaboliter, flera cytokiner och kemokiner 20,21,22. Release av nyligen syntetiserade produkter sker oberoende av SG release. Tillsammans står dessa mediatorer initierar tidiga och sena fasen inflammatoriska och allergiska reaktioner. Därför att förstå de mekanismer som står för MC aktivering och degranulering är både teoretisk och klinisk importance.
Svårigheten att genetiskt manipulera primära och odlade MCs har försvårat försöken att klarlägga mekanismerna bakom MC degranulering, vilket förblev dåligt lösas. För att lösa detta problem som vi utvecklat en reporter baserad analys av samtransfektera den mucosal mastcellinjen, råtta basofila leukemi (RBL) -2H3 (nedan kallade RBL) eller benmärg härledda MCs (BMMCs) 30 med en gen av intresse och neuropeptid Y (NPY) smält till mono RFP (mRFP), som en SG reporter.
NPY har tidigare visat att rekapitulera beteende endogena SG markörer i andra system. Dessutom, på grund mRFP fluorescens är pH-okänsligt, expression av NPY-mRFP möjliggör visualisering av de sura SGs samt kvantitativ bedömning av exocytos genom att använda 96-brunnars plattor och en fluorescensplattläsare. Vi har visat att NPY-mRFP levereras till de sura SGs av RBL-celler och BMMCs och frisätts från cellernapå ett reglerat sätt vid sidan av endogena SG last (dvs, β-hexosaminidas och serotonin) 30, 32. Protokollet ger en högupplöst bildbaserad metod som gör att screening gener av intresse för deras fenotypiska och funktionella effekter på SG egenskaper och degranulering i RBL celler 32. Specifikt ger detta protokoll realtid spårning av MC SGS och kvantifiering av deras område eller volymstorlek, deras antal, kinetik montering, deras rörelse längs cell cytoskelettet och deras slutliga fusion med plasmamembranet under olika förhållanden. Till exempel, sensibilisering cellerna med DNP-specifikt IgE och utlöser cellerna med en flervärd Ag (DNP konjugerat serumalbumin) under olika störningar (dvs, knockdown av gener av intresse, överuttryck av wt eller mutant gener, eller farmakologiska manipulationer) och jämföra med kontrollceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av RBL Cell Culture Media
- Blanda 500 ml låg glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 56 ml fetalbovinserum (detta gör 10% FBS), och sedan lägga 5,5 ml penicillin streptomycin (detta gör ~ 1% PEST).
- Filtrera media med hjälp 500-1000 ml flaska-Top Vakuumfilter med 0,22 ìm porstorlek och förvara vid 4 ° C.
2. Kultur av RBL Cells
- Väx RBL-celler i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C i antingen plattor eller kolvar. RBL-celler som växer i 10 cm plattor bör kompletteras med 10 ml medium och bildar sammanhängande monolager av ~ 10 7 celler / platta.
- När cellskiktet närmar konfluens, förnyad utbredning kulturen vid en lägre densitet.
- Avlägsna odlingsmediet från plattan / kolv med användning av en steril pasteurpipett förbunden med vakuum.
- Skölj encellsskiktet med förvärmd (37° C) 0,25% trypsin / EDTA som täcker hela monolager (volymen beror på storleken på odlingsplattan / kolv, 2 ml för 10 cm platta). Detta kommer att lossa cellerna.
- Alternativt, skölj encellsskiktet med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), ta bort PBS och till förvärmd (37 ° C) trypsin / EDTA. Detta steg lösgör cellerna snabbare.
- Placera plattan / kolv i en inkubator vid 37 ° C (ej mer än 10 min).
- Inspektera celler under optiskt mikroskop för att kontrollera om de har lossnat. Om cellerna inte lossna efter 10 min, knacka försiktigt på plattan / kolv.
- Lägg medium till odlingsplattan / kolven för att suspendera cellerna (volymen av mediet bör vara åtminstone 2-faldigt större än volymen av trypsinlösning).
- Pellets cellerna genom centrifugering under 3 minuter vid 200 g vid 25 ° C.
- Resuspendera cellerna i medium. Späd cellerna genom 1:10 och frö i en ny odlingsskål. Inkubera cellerna i 48-72 timmar, tills de REACh cirka 90% konfluens.
- Upprepa samma procedur (avsnitt 2.2.1-2.2.8) i upp till 3 månader (30 passager).
3. Beredning av Transfection Media.
- Bered en 100 mM lösning av K-Pipes pH 7, 1 mM lösning av Ca 2+ acetat och 100 mM lösning av Mg2 + acetat.
- Späd 100 mM lösning av K-Pipes pH 7 i 20 mM med användning av DMEM-medium, tillsätt 1 mM lösning av Ca 2+ acetat till en slutlig koncentration av 10 | iM och 100 mM lösning av Mg 2+ acetat till en slutlig koncentration av 2 mM.
- Väg Kalium glutamat och lägga till lösningen till en slutlig koncentration av 128 mM, blanda väl och hålla vid 4 ° C fram till användning. Förvara de återstående lösningarna (dvs.., K-Rör, Ca2 + acetat, Mg2 + acetat) vid -20 ° C.
4. Transfektion av RBL celler
- Avlägsna odlingsmediet från plattan / kolv med användning av ensteril pasteurpipett ansluten till vakuum.
- Skölj encellsskiktet med förvärmd (37 ° C) trypsin / EDTA som ska täcka hela monolager. Placera plattan / kolv i en inkubator vid 37 ° C (ej mer än 10 min). Kontrollera om cellerna har lossnat hjälp av optiskt mikroskop.
- Lägg medium till odlingsplattan / kolv att avbryta cellerna (volym medierna bör vara minst 2-större mer än volymen av trypsin lösning).
- Räkna cellen numret med hemocytometer.
- Pellets 1,5 x 10 7 celler genom centrifugering under 3 min vid 200 xg vid 25 ° C. Kasta supernatanterna och lägga 280 pl transfektion medium. Överför reaktionsblandningen i 4 mm kyvett.
- Lägg 20 pg av NPY-mRFP plasmiden och antingen 30 pg av kontroll tomma plasmid eller en testad plasmid. Den slutliga volymen för reaktionsblandningen bör vara 300 | il.
- Placera omedelbart på is under 10 min. Torka kyvetten från resterande vatten och proceed till elektroporering vid 300 V under 9 ms.
- För mätningar av exocytos, förnyad utbredning cellerna omedelbart 24 vävnadsodlingsskålar innehållande 300 pl medium. Lägg 8 ul av reaktionsblandning (4 x 10 5 celler) till varje brunn. Lägg 4 × 10 5 icke transfekterade celler att ytterligare brunnar för kontroll. Bered tillräckligt med brunnar för att ha åtminstone dubbla brunnar för varje behandling för varje transfektion.
- För tid förfaller mikroskopi, förnyad utbredning cellerna omedelbart i en 8-väl kammar borosilikatglas coverglass system innehållande 80 pl medium. Lägg 1,5 ul av reaktionsblandningen (7,5 x 10 4 celler) till varje kammare. (Försök att undvika att använda kamrarna vid kanten av coverglass, kamrarna i mitten av coverglass är lättare att bilden).
OBS: Viktigt inte alla celler svar på en trigger och ibland tidsförlopp mikroskopi upphävs på grund av förlust av fokus och driften av 8 brunnar kammar borosilicate coverglass system. Därför förbereder minst åtta kammare för varje behandling för varje transfektion. - För sensibilisera cellerna för FcsRI förmedlad aktivering, tillsätt 1 | j, g / ml av mus-DNP specifik monoklonal IgE till medierna (inkubera cellerna med IgE om minst 2 h).
- Efter 18-24 h använda ett fluorescensmikroskop för att bekräfta att cellerna uttrycker plasmiderna. De excitations- och emissionsvåglängder av mRFP fluorescens är: Xex 584, λEm 607 nm. NPY-mRFP ska visas i vesikulära strukturer som motsvarar SGS. Om den andra genen av intresse är kondenserad till en fluorescerande markör använda ett fluorescensmikroskop för att bekräfta samuttryck av båda plasmiderna vid samma celler. Till exempel, om det testade genen är fusionerad till GFP, exciterings- och emissionsvåglängder på GFP-fluorescens är: Xex 488, λEm 507 nm. GFP taggade proteinet ska visas på samma celler som uttrycker NPY-mRFP.
- För exocytos mätningar vidare to steg 5 och för tid förfaller mikroskopi, gå vidare till steg 6.
5. Mätning NPY-mRFP Exocytos
- Framställning av Tyrodes buffert:
- Bered en lösning av 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl och 8 mM NaH 2 PO 4 i DDW. Blanda väl och förvara vid 4 ° C. Detta steg är för beredning av 20x Tyrode buffert.
- Bered en lösning av 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM glukos och 1 till 20 utspädning av Tyrode 20x i DDW och blanda väl. Detta steg är för beredning av 1x Tyrode buffert.
- Alikvotera 1x Tyrode buffert och förvara vid -20 ° C. Undvik upprepad frysning och upptining.
- Avlägsna odlingsmedium från 24 brunnar och tvätta 3 gånger med Tyrode buffert. Förbered ostimulerade celler genom att tillsätta 200 | il Tyrodes buffert till kontrollbrunnar.
- Bered 10 pl / brunn av 20X koncentrerad aktiverande reagens [(t.ex. 1000 ng / ml DNP-BSA eller DNP-HSA (Ag), 200 uM Ca 2 + jonofor (t ex A23187), och en kombination av 20 | iM Ca2 + jonofor och 1000 nM 12-O- tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA)]. Om reagensen är lagrade i DMSO, späds reagensen i 20x koncentration i Tyrodes buffert innehållande 1% DMSO. Inkubera vid 37 ° C under 30 minuter.
- Avlägsna supernatanterna från varje brunn försiktigt till en 96 brunnars platta, placera på is och undvika från ljus. (Supernatanterna innehåller den chimära peptiden NPY-mRFP som släpptes från cellerna).
- Lägg 200 | il Tyrodes-buffert innehållande 0,5% Triton X-100 till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 10 min. (Detta steg är viktigt för beredning av cellysat som innehåller återstoden av NPY-mRFP som inte släpptes från cellerna). Samla cellysaten och överför till en 96 brunnar, placera på is och undvika från ljus.
- Mät fluorescensen hos cellsupernatanterna och cellysat med användning av en fluorescerrensplattläsare, med hjälp av en 590-, 20 nm bandbredd excitationsfilter och 635-, 35 nm emissionsbandbreddsfilter.
- Beräkna andelen NPY-mRFP släppt:
OBS! Fluorescensläsare åtgärd godtyckliga fluorescensenheter (AFU). AFU värden beror på maskinen och dess känslighet och transfektionseffektiviteten.- Ställ autofluorescens av icke-transfekterade RBL celler som tomma. Dela upp AFU varje supernatant till den totala fluorescens (AFU av supernatanterna + AFU av motsvarande lysat) och multiplicera med 100.
6. Time-lapse Mikroskopi av Exocytos
- Seed 7,5 x 10 4 av den transfekterade celler / kammare i ett 8-brunnars kammar borsilikat coverglass systemet. Efter 18-24 timmar, ta bort odlingsmediet från kamrarna och tvätta 3 gånger med Tyrode buffert
- Lägg 72 pl av Tyrode buffert till varje kammare. Späd de aktiverande reagens i Tyrodes buffert till 10x koncentration. <li> Använd en konfokalt fluorescensmikroskop utrustad med en uppvärmd kammare (37 ° C) och CO 2 controller (4,8%) och en 40X eller 63X objektiv. Slå på mikroskopsystem: kvicksilverlampa, dator, och lasrar. Se till att den uppvärmda kammaren är vid rätt temperatur innan experimentet.
- Placera kammaren i den uppvärmda kammaren och se till att kammaren är korrekt och stabil installerad.
- Slå på fluorescens ljus enligt den relevanta fluoroforen och visualisera transfekterade celler. Stäng av fluorescens gång en cell av intresse är inom området för att minimera blekning och cytotoxicitet. Det är viktigt att detta område kommer att innehålla cirka 2-3 transfekterade celler. De transfekterade cellerna bör vara väl spridas men inte vidrör varandra.
- Justera lasereffekten (beroende på mikroskopet) för att minimera buller och övermättnad samt toxicitet, och ställa in förstärkningen och offset för att modifiera signalbrusförhållandet. Skanna snabbt i ellerder för att minimera längden på laser utläggning (genomsnitt 2).
- Justera pinhole storlek till ett maximum, Detta möjliggör minskning av lasereffekten och för att bibehålla bilderna fokuserade under en lång tidsperiod. Om så önskas, ställa in parametrarna för Z stacken för att rekonstruera bilden i tredimensionellt, justera pinhole storlek till 1 luftiga enhet (AU) som ger bäst signal-brusförhållande och skaffa successiv scanning av tvådimensionella konfokala optiska skivor i z -axes med optiska skivor ≤0.7 xm.
- Ställ in intervalltiden mellan varje förvärv till 15-30 sek och varaktigheten av den totala förvärvs till 15 min och börja skaffa bilder. Efter 5 min anskaffnings pausa tidsserier. Lägg 8 ul av 10x trigger och fortsätta förvärvet omedelbart.
- Spara bilderna, utför deconvolution använder ett avfaltning programvara och rekonstruera stackarna till tredimensionella bilder och en film med Imaris programvara.
- Importera data från deconvoluted tidsseriebilder som erhållits genom konfokal fluorescensmikroskop till Imaris programvara. Denna programvara läser mer än 40 mikroskope filer. Om programvaran inte kan läsa filerna; konvertera filerna till tif-filer och importera.
- För att lägga till tidpunkter i slutet av en öppen datamängd press edit -> Lägg tidpunkter och importera de nya datauppsättningen.
- Skapa yta av mRFP kanalen med guiden ytan alternativet. Välj standardalgoritmen. Välj kanal för NPY-mRFP. Markera utjämnings alternativet för att minska bullret. För att undvika förlust av små detaljer reducerar området detaljnivån till 0,05 um.
- Ange tröskelintensiteten. Ny grå yta kommer att visas. Gå till "Inställningar" och växla stilen från "Mittpunkt" till "Surface".
- Gå till statistik fliken i egenskaperna för valt objekt, markerar den detaljerade flik och det specifika värdet such såsom fluorescensintensitet, volym etc.
- Granska data och kontrollera att värdena är kompatibla med bilderna. Till exempel kan två eller flera intilliggande granuler mätas som en större granul. För att kvantifiera den genomsnittliga granulstorleken dividera storleken på de sammanslagna granulatet till det faktiska antalet granuler.
- Exportera önskade datauppsättningar till Excel-filer och analysera data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund av den låga transfektionseffektiviteten av MCs, är det osannolikt att lämna en inverkan på avläsning av genomsnittlig sekre mätt genom endogena SGS medlare genetiska manipulationer. Ändå, genom att upprätta fullständig samexpression av reportergenen NPY-mRFP och den samtransfekterade plasmiden vid samma celler, övervakning av NPY-mRFP resultat i övervakningen enbart cellpopulationen som uttrycker genen av intresse. Därför, är fördelen med denna analys jämfört med konventionella metoder för förmågan att selektivt övervaka genetiskt manipulerade celler (Figur 1).
Faktum använder denna analys har vi skärmad gener som reglerar vesikulär människohandel inklusive lösligt NSF [N-etylmaleimid känslig fusions] fästproteinreceptor (Snare) proteiner och 44 medlemmar av Rab GTPaser familjen. Vi identifierade gener som reglerar SGsize, antal, last sammansättning och exocytos 23.
We identifierade 30 Rabs som ändrats (dvs., inhibera eller stimulera) exocytos i RBL-celler stimulerade genom antingen Ag eller genom kombinationen av en Ca2 + jonofor och forbolestern TPA (jon / TPA) 23. Confocal avbildning avslöjade snaror och Rabs som orsakade dramatiska fenotyper förändrar morfologin av cellerna eller SGS 30,32. Konfokal avbildning av dessa proteiner avslöjade åtta snaror och Rabs som orsakade dramatiska fenotyper på cellerna eller SG morfologi 30,32. Med hjälp av detta protokoll kunde vi spåra enskilda SGS och utför mätningar av deras storlek, fluorescensintensitet, deras rörelser och exocytos. Till exempel, identifierade vi Rab5 som en regulator av SG biogenes 30. Rab5 har identifierats som en mästare regulator av endocytos och endosomal fusion 24. Vi har visat att samtidig uttryck av konstitutivt negativa (CN) BNP-låsta mutanter av de endogent uttryckta isoformer av Rab5 (Rab5A, Rab5B och Rab5C) eller eXpression av Rab5A / B / C inriktning shRNAs, minskade signifikant SGS "storlek med en samtidig ökning av deras antal 30. Omvänt, expression av en GTP-låst, konstitutivt aktiv (CA) Rab5A mutanten (Rab5A Q79L, häri: "CA Rab5A"), som är känd för att underlätta homotypisk fusion av tidiga endosomer (Ees) 24, resulterade i bildning av gigantiska Rab5A inredda vesiklar, som vi identifierat som SGs baserat på deras innehåll av sekretoriska last NPY-mRFP och serotonin, samt deras förmåga att exocytose på ett reglerat sätt 30.
Figur 2 visar morfometriska analyser av NPY-mRFP innehållande SGS. Medelvärdet SGs volym i CA Rab5A-uttryckande celler nådde värdet av 44 nm 3, som var> 20 gånger större än den genomsnittliga volymen av SGS i kontroll GFP-uttryckande celler medan deras antal minskade med 20-faldig (Figur 2A). Det omvända sambandetmellan antalet och storleken SGS (Figur 2A) föreslog att Rab5-medierad utvidgningen av SGS involverar deras homotypisk fusion. Jätten NPY-mRFP innehåller SGs bildas av CA Rab5A gör konfokalmikroskopi avbildning av levande celler i en hög upplösning som gör det möjligt att övervaka SGS i detaljer som inte kunde vara möjligt annars. Till exempel, upptäckte vi Rab5A i fusing SGs tillsammans mindre strukturer utspridda bland jätten SGS, troligen motsvarar endosomer (Figur 2B). Dessutom har vi visat att Rab5 gående och helst associerar med nybildade SGs tyder på att selektiva och övergående sammanslutning av Rab5A med nybildade SGS är kompatibel med en fusogent apparat där endast nyligen genererade granulat har kapacitet att smälta samman med andra SGs 30.
Figur 3 visar representativa tidsförlopp bilder av MC jätte SGs som bildats genom uttryck av CARab5A och kinetik exocytos i resolutionen av en enda SG efter stimulering. Under MC exocytos, SGS gå mot och smälta samman med plasmamembranet. Som en konsekvens den sekretoriska lasten frigörs från cellerna in i det extracellulära utrymmet. I detta experimentella system, är NPY-mRFP frisätts från cellerna och fann i cellerna supernatanterna. Fluorescensen av NPY-mRFP i cellsupernatanterna kan mätas med en fluorescensläsare. Men eftersom NPY-mRFP späds i supernatanterna dess fluorescenssignal inte kan upptäckas eller visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Frisläppandet av NPY-mRFP från granulerna under exocytos resulterar i en snabb och dramatisk minskning av NPY-mRFP fluorescensintensitet och krympning av NPY-mRFP innehållande SGS och deras disappearance.Therefore, levande cell imaging av stimulerade celler och mätningar av NPY -mRFP fluorescensintensitet eller NPY-mRFP innehållande SG storlek ger korrekta bedömningar av kinetiken för exocytos avenskilda granulat. Figur 3b visar fluorescensintensiteter SGS efter stimulera cellerna med en Ca2 + jonofor. SGS undergår exocytos vid olika tidpunkter (dvs, två, tre, sex, och 11 min efter stimulering), medan fluorescensintensiteten hos ett enda SG som inte smälta samman med plasmamembranet förblev konstant.
Figur 1:. Illustration av de viktigaste stegen i protokollet RBL celler samtransfekteras med NPY-mRFP och en andra gen av intresse eller motsvarande kontroll plasmid och omedelbart såddes på täck, 8 brunnar kammar borosilikatglas coverglass systemet eller 96-hålsplattor. Nästa dag, Bilder av NPY-mRFP innehållande SGS vilande och utlösta celler förvärvats av konfokalmikroskopi (A). Dessutom exocytos av resting och utlöste cellsis kvantifieras genom att mäta frisättningen av NPY-mRFP i en 96 brunnars platta fluorescensläsare (B).
Figur 2:. Kvantifiering av SGS "storlek RBL-celler samtransfekterades med NPY-mRFP och antingen GFP eller GFP-CA Rab5A och såddes på 8 brunnar kammar borosilikat coverglass systemet. 24 h senare var 8-brunnars kammare placerad i laser konfokalmikroskop utrustad uppvärmd kammare (37 ° C). Z-stack bilder av successiva bilder med optiska skivor 0.7 um fångades med hjälp av en 63x olja / 1.4 numeriska mål bländare. Bilderna deconvoluted och tre dimensionsbilder byggdes av Imaris programvaran. Volymen av SGS och deras antal beräknades med hjälp av Imaris programvara (A). En del av NPY-mRFP innehållande Granules verkar vara inbäddade i Rab5A (pilspetsar). Andra är naken eller överbryggas med Rab5A (pilar). Skala bar = 5 pm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Att mäta omfattningen och kinetik exocytos i lösningen av ett enda SG i activatedRBL celler RBL-celler samtransfekterades med NPY-mRFP och GFP-CA Rab5A och seedade IN8 brunnar kammar borosilikat coverglass systemet. 24 h senare IN8 brunnar kammare placerades i en laser konfokalt mikroskop utrustat med en uppvärmd kammare (37 ° C) och cellerna utlöstes med 10 | iM Ca2 + jonofor. Bilder förvärvades var 15 sekund med hjälp av en 63x olja / 1.4 numeriska mål bländare. Bildervar deconvoluted och behandlas sedan av Imaris programvaran. Skalstreck = 5 ^ m (A). Den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos NPY-mRFP innehåller granulat bestämdes av Imaris programvara och data normaliserades efter tid 0 (tid för tillsättning av Ca2 + jonoforen). Pilarna representerar tidpunkter vid vilka frisättning av SGcargo wasnoted (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi som kombinerar kvantifiering av MCs exocytos och fyra (x, y, z, t) dimensions kvantifieringar av tids förfallit tre-dimensionell avbildning av SGS i levande celler med användning av en reportergen för exocytos. Denna teknik möjliggör screening av familjer av proteiner för deras inverkan på MC-funktion såsom övervaknings SGs börjar så tidigt som deras utträde ur Golgi genom deras mognad, förvärv av exocytos kompetens och degranulering. Kombinationen av mätningar av exocytos tillsammans med morfometriska och kinetiska karakteriseringar av SGS ger insikter i de mekanismer genom vilka de testade proteiner förmedlar MC-funktioner. Därför använder denna metod, kan genetisk manipulation av riktade gener presentera nya molekylära mekanismer genom vilka MC SGs butik och släpper sin last. Noterbart kan NPY tjäna som en reporter för exocytos i andra sekretoriska celler såsom MCF-7-celler, en cellinje härledd frabout en mänsklig bröstkörtel adenokarcinom 31 kromaffinceller 34 och pankreas β-celler 35.
Genetiska manipulationer är de mest kraftfulla verktygen finns för närvarande för att forska funktionella nätverk. Genetiska manipulationer möjliggöra identifiering av viktiga proteiner i varje nätverk, vars radering kommer driva kollaps av systemet, till skillnad från andra proteiner, vars radering kommer driva överhörning mellan parallella nätverk eller har ingen effekt på grund av arbetsbrist. Men på grund av den låga transfektionseffektiviteten av MCs, vid mätning exocytos av endogena mediatorer endast en liten fraktion av celler som uttrycker "manipulera" test-DNA. Därför, när man mäter exocytos av endogena mediatorer, är mindre bidrag de transfekterade cellerna till den totala avläsning. Därför att försöka anta sådan strategi utforska de komplexa nätverk i samband med reglerad exocytos i MCs var hektarmpered. Denna teknik övervinner hindret för den låga transfektionseffektiviteten och ger ett enkelt sätt att observera fenotypiska växlingar av MC SGs orsakas av överuttryck, knockdown och mutagenes av gener av intresse.
Denna teknik kan förlängas för att undersöka hierarkin och läget av interaktion av funktionella nätverk som använder gående trippel-transfektion. Resultaten kommer att analyseras för att avgöra vilken gen kan rädda en viss fenotyp; orsaka en mer dramatisk fenotyp eller har någon effekt. Baserat på sådana kombi transfektioner kan exocytos näten byggas. Till exempel använder trippel-transfektion kunde vi identifiera SNARE protein VAMP8 som nedströms medlare i processen för Rab5 beroende SG fusion 25.
Denna metod medger visualisering och kvantifiering av exocytos i resolutionen av enstaka SGS. Faktiskt kunde vi visa att SGS display differentialsvar till Stimuli. Anledningen till varför vissa SGs smält med plasmamembranet, medan andra inte gjorde det eller orsaken till differential kinetik MC SG fusion återstår att fastställa. Framtida studier med denna experimentella tillvägagångssätt har potential att besvara dessa frågor. Till exempel bör kvantifiering av olika snaror eller Rabs enligt individuella SGS och korrelation med exocytos kompetens och kinetik exocytos i resolutionen av en enda SG avslöjar nya regulatorer av exocytos.
Den största begränsningen med denna teknik är genmanipulation eftersom överuttryck av ett protein kan påverka cellernas funktion eller morfologi. Därför är det avgörande för att validera resultaten med kompletterande metoder. Till exempel när överuttryck av en konstitutivt aktiv mutant hämmar exocytos, effekten av en konstitutiv negativ mutant eller slå ner av genen bör testas också.
Med användning av denna teknik, vi identifIED nya regulatorer av MC-funktioner, som påverkar MC exocytos eller förändra SG morfologi. Kombinationen av exocytos mätningar tillsammans med SGs morfometrisk karakterisering ger djupare insikter i funktion och verkningsmekanismer av de testade proteinerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dr U. Ashery för gåvan av NPY-mRFP cDNA. Vi tackar Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani och Y. Zilberstein för ovärderlig hjälp med mikroskopi och bildanalyser. Vi tackar även Dr Joseph Orly för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Israel Science Foundation, som grundades av Israel akademin för Sciences (1139-1112 till RS-E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
