Neuroscience

בהדמיה ^{2 +} Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Published: January 29, 2015 doi: 10.3791/52506

¹Department of Physiology, Michigan State University

Introduction

מערכת העצבים enteric (ENS) מאורגנת בשני plexuses ganglionated המוטבע בקיר של מערכת עיכול ^1. מעגלים עצביים לשריר אלה, מקלעת myenteric (MP) ומקלעת submucosal (SMP), מורכבים מתאי עצב וגליה enteric (איור 1) ^2. MP וSMP להסדיר עיכול פונקציות (GI) כגון תנועתיות מעיים וספיגת אפיתל והפרשה, בהתאמה ^3. גליה מעיים נמצאות בסמיכות לתאי עצב בתוך הגרעינים אבל אוכלוסיות של גליה enteric גם קיימות בתוך מקשר קטעי סיבים וחלקים נוספים-ganglionic של קיר בטן ^3,4. גליה מעיים האמינו במקור כדי לספק תמיכה תזונתית רק לתאי עצב. עם זאת, מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך שנוירון, גליה אינטראקציות חיוניות לENS מתפקד ^5,6. לדוגמא, הנתונים מראים כי גליה enteric "להקשיב" לפעילות עצבית ⁷ולווסת את המעגלים עצביים ^6,8, להגן על תאי עצב enteric מלחץ חמצוני ⁹ והם מסוגלים לייצר תאי עצב חדשים enteric בתגובה לפציעה ^10,11. הפרוטוקול המובא בסקירה טכנית זו מספק שיטה פשוטה וחזקה כדי לבחון את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי עצב וגליה enteric באמצעות הדמיה Ca ^{2 +} תאית אתרו.

Ca ^{2 +} הוא מולקולת איתות בכל מקום בתאים להתרגש וממלא תפקיד חיוני באירועי איתות הסינפטי במערכת העצבים ^12. עירור של תאי עצב או גליה enteric מעורר העלאה בריכוז Ca ^{2 +} cytoplasmic או על ידי זרם דרך Ca ^{2 +} ערוצי -permeable או Ca ^{2 +} שחרור מחנויות סידן תוך תאי. ההדמיה Ca ^{2 +} ארעיים בתאי עצב וגליה עם צבעי ניאון הוא הוקם וטכניקה בשימוש נרחבת כדי ללמוד את הארגון ואת הדינמיקה של תפקודיים^13-17 ENS. ההדמיה Ca ^{2 +} הוכח להיות כלי חשוב בלימוד קטעי רקמה במערכת העיכול ללא פגע על מנת להבהיר את ההתפשטות של רגישות באמצעות רשתות ICC קוצב לב ¹⁸ ושריר חלק במעי ^19,20. זה מאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של פרמטרים פיסיולוגיים ומספק מידע על שתי הפריסה המרחבית שלהם ודינמיקה זמנית. תאים יכולים להיות מוכתמים ביעילות באופן פולשנית ידי שימוש באינדיקטורים ניאון קרום חדיר ופרוטוקולים מכתים מותאמים ^21. זה מציע הזדמנות לעקוב אחר מספר גדול של תאי עצב וגליה enteric בהכנות השתמרו תפקודי ^14-16,22, כמו גם in vivo ^23. הכנות רקמת הר-שלמות הן בתפזורת עמוסה Ca ^{2 +} צבע מחוון גבוהה זיקה כגון Fluo-4, המגבירה הקרינה שלה כאשר חייב Ca ^{2 +.} שינויים בקרינה נרשמים על ידי מצלמת CCD וanaדיגיטלי ⁶ lyzed. כניסתו של Ca ^{2 +} סיפקה את ההזדמנות כדי לפקח על אינטראקציות תא עצב ותאי גליה, היענות לגירויים שונים, ומעורבותם של סוגי התאים בתהליכי עיכול בזמן אמת.

באתר ההדמיה Ca ^{2 +} הניבה תובנה גדולה לתוך מנגנוני האיתות של תאי עצב וגליה enteric ובעל כמה יתרונות ברורים על פני דגמי תרבית תאים ^6,24. ראשית, באתר הכנות לשמור על סביבת מטריצת יליד נוירונים וגליה ולהשאיר את חלק הארי של הקשרים שלהם כדי למקד את הרקמה שלמה. שנית, הגנטיקה והמורפולוגיה של גליה enteric בתרבית באופן משמעותי בהשוואה לשינו in vivo ^6,24. שלישית, אינטראקציות רבות heterotypic הולכים לאיבוד בתרבית תאים ראשוני וזה מגביל הערכת אינטראקציות תא-תא. למרות שתאים בתרבית מתאימים גם לחקירה של תכונות בסיסיות, usefulness לחקר אינטראקציות מורכבות בין גליה ונוירונים enteric מוגבל. גומלין נוירון, גליה חוקר באמצעות באתר גישה הוא יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמסלולים הסינפטי נותרו על כנן ^25. בהשוואה לגישות תרבית תאים, בגישה באתר מציע תנאים משופרים לשיטתיים הבנת האינטראקציות המורכבות בין תאי עצב וגליה enteric. יתר על כן, הארגון מישוריים של מקלעת ganglionated בהכנות כל הר הוא אידיאלי עבור הדמיה ניאון של Ca ^{2 +} ארעיים תאיים וטכניקה זו מספקת גישה פשוטה להערכת פעילות נוירון, גליה בENS.

Protocol

הערה: ההליכים הבאים הכרוכים ברקמה מחיות מעבדה עולים בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים 2013 ואושרו מראש על ידי IACUC אוניברסיטת מדינת מישיגן.

1. רקמות הכנה

להרדים בעלי חיים מחקר בתא המכיל isoflurane 2.5% בחמצן או על ידי הצבת 3-5 מיליליטר של נוזל על isoflurane חומר סופג על הרצפה של החדר, על מנת להבטיח כי מכשול פיזי מונע מבעלי חיים מגע ישיר עם isoflurane. מבחן לעומק הרדמה על ידי צובט את השודד.
הערה: עומק ההרדמה נחשב מתאים כאשר אין רפלקס נסיגה של הגפיים האחורי. ברגע שהרדים כראוי, להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם
מניחים את החיה במצב שכיבה ולנקות את עור בטן עם אתנול 70%. שימוש במלקחיים לצבוט עור בטן בקו האמצע ולהשתמש במספריים כירורגית כדי להפוך את תקשורת 6 סנטימטרחתך l לאורך alba linea לחשוף איברי עיכול פנימיים.
שימוש במלקחיים בוטים לאתר ולחשוף את המעי בתוך הצפק. חותך את לפדר ileal / מעי גס עם מספריים ולהתחיל לפרום את המעי.
ברגע שאורכו של המעי נפרם כראוי, לחתוך את דיסטלי המעי אל הקיבה והפרוקסימלי לcecum להכנת מעי. להכנת מעי גסה, לחתוך את דיסטלי המעי הגס לcecum והפרוקסימלי לפי הטבעת.
להסיר במהירות את קטע המעי ולמקם אותו בכוס עם תקשורת DMEM / F12 בתוספת hydrochloride nicardipine 3 מיקרומטר ו1 מיקרומטר hydrochloride scopolamine (המכונה "תקשורת" להלן) על קרח. התוספת של מעכבים אלו, מסייעת microdissection והדמיה לאחר מכן על ידי משתק את שריר החלק במעי.
קטע Cut של עניין (למשל, מעי ריק, מעי, מעי גס דיסטלי או הפרוקסימלי) המבוסס על סמנים אנטומיים הוקמו. בדרך כלל utilizרקמת דואר מהמעי הדיסטלי או המעי הגס דיסטלי. עם זאת, להשתמש באותו ההליך בסיסי לבודד, הנוירונים myenteric עומס ותמונה וגליה בכל האזורים במעי.
הסר קטע קטן (4-6 סנטימטר) של קטע מעי רצוי ומניחים בצלחת פטרי מצופה Sylgard מלאה תקשורת מצוננת.
Secure הפרוקסימלי וקצוות מרוחקים של קטע המעי עם סיכות חרקים ולפתוח את צינור המעיים על ידי ביצוע ישר, חתך לאורכו לאורך גבול mesenteric.
רקמת פין שטוחה תחת מתח אור עם צד רירית וזהירות לנתח משם שכבה רירית באמצעות מלקחיים עדינים (מס '5 ו# 5/45 עבודה הטובה ביותר) ומספריים באביב יפים מאוד.
הערה: הסרת הרירית יכולה להיות די טראומטית עבור ENS אם לא נעשה כראוי. להכנות איכות, דואגים להגביל ההסרה פתאומית של הרירית על ידי קילוף או גירוד. התרגול הטוב ביותר הוא להסיר את הרירית ולחתוך עם מספריים מתחת קנס.
חותך את הרקמה לתוך הכנה קטנהs (כ 0.5 סנטימטר ²⁾ וסיכה לתוך מנות הדמיה (4 פינות עם שכבת שריר מעגלית כלפי מעלה) הניחה על קרח עם תקשורת טרי.
בזהירות לנתח את שריר מעגלי על ידי מתגרה בנפרד עם פינצטה בסדר לחשוף את מקלעת myenteric. הימנע ממתיחה מוגזמת.
מניחים צלחת הדמיה חזרה על פתרון קרח ושינוי עם תקשורת טרי.
להכין 2 מיליליטר של תערובת אנזים לכל צלחת [Dispase 1 U / ml (4.48 מ"ג / 8 מיליליטר), Collagenase סוג II 150 U / ml (5.45 מ"ג / 8 מיליליטר) בתקשורת].
הסר מנות מהקרח ולהוסיף את תערובת האנזים מהצעד 1.13.
דגירה מנות ב RT למשך 15 דקות עם 5% CO _2/95% אוויר.
הכנות רקמות לשטוף עם תקשורת 3 פעמים ובפינות מחדש פינים.

2. טוען Fluo-4 Dye

הערה: הימנע photobleaching ידי עבודה עם אור מוגבל בזמן טיפול צבעי ניאון ורקמה עמוס צבעי מחוון.

הכן 4 פתרון טעינת Fluo-4 מיקרומטר.
1. להוסיף 1.5 מיליליטר תקשורת ו -1.2 μl של מניית probenecid 250 מ"מ לaliquot 1.5 μl של 4 מ"מ מניית Fluo-4. 4 מ"מ מניית Fluo-4 הוא הוכן על ידי הוספת 11.4 μl של F-127 pluronic (20% בDMSO; בתוספת 0.25% cremaphor-EL) 50 מיקרוגרם של Fluo-4, בבוקר.
דגירה preps בפתרון טעינת Fluo-4 במשך 45 דקות בחממה כהה על 37 מעלות צלזיוס.
הסר מן החממה ולשטוף הכנות עם תקשורת 3 פעמים.
תקשורת תמורת מדיה המכילה 200 מיקרומטר probenecid דגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.
הערה: probenecid הוא תרופה מעכבת מובילי התנגדות multidrug בתאי עצב. תוספת של תרופה זו מעכבת את היכולת של תאי עצב כדי למתוח צבעים ומשפרת תיוג עצבי. תפזורת-טעינה של Ca ^{2 +} צבעי מחוון בהעדר probenecid מייצרת טעינת תא בעיקר גליה. התוספת של probenecid מאפשרת הדמיה של תגובות עצביות וגליה.
הכן השתנה Kreמאגר BS.
1. הפוך חיץ קרבס שונה כך שהריכוזים הסופיים (מ"מ) של הרכיבים הם אחריו כמו: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl _2, 1.2 MgCl _2, 1.2 לאא ₂ PO _4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO _3, pyruvic 1 חומצה ו -8 גלוקוז (pH מותאם ל7.4 עם NaOH). הוסף 3 nicardipine מיקרומטר וscopolamine 1 מיקרומטר לעכב התכווצויות שרירים במהלך Ca ^{2 +} הדמיה וכל הר והניתוחים.

3. הדמיה וניתוח

הערה: השתמש לפחות מתקן הדמיה בסיסי עם מקור אור ניאון, מיקרוסקופ, מצלמת CCD באיכות ותוכנת רכישה מתאימה. להשתנות בתוספת רכיבים אחרים בהתאם למקור האור ויישום ספציפי. גלגל לסנן ותריס יש להשתמש במקור אור קשת קסנון מסורתי. עם זאת, מקורות אור LED ומערכות תאורה לא דורשים רכיבים אלה.

מקם את recOrding תא מתחת למיקרוסקופ ובאמצעות מערכת הזרימה זלוף הכבידה עם מאגרי מזרק מחוממים מרובים להקים שיעור זלוף רציף של 2-3 מיליליטר / דקה 37 ° C חיץ קרבס. ודא כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בשתי שורת הקלט והיניקה מחוברת למלכודת ואקום.
להביא את המקלעת הרצויה אל מוקד תחת תאורה בשדה בהירה. הימנע overexposing רקמה, דבר שעלול להוביל להלבנת תמונה.
בדוק את טעינת Fluo-4 בתוך הגרעינים ובחר הגרעינים בריאים הדמיה. הגרעינים לא בריאים / פגומים יפגינו מורפולוגיה autofluorescence או punctate ולא אמור לשמש להדמיה.
ברגע שגנגליון נבחר, להסיט את נתיב אור למצלמה ולקבל תמונת חיה עם תוכנת רכישת תמונה. ודא גנגליון שהוא בזמני מיקוד וקצב רכישת תמונה מוגדר וחשיפה.
הערה: שיעורי רכישת תמונה וזמנים משתנים בהתאם לאירועי חוקרים רוצים להקליט. עבור רוב הניסויים, תמונותנרכשים באופן מסורתי ב0.5-1 הרץ לתאי גלייה ועד 2-10 הרץ לנוירונים כי Ca ^{2 +} תגובות גליה אינן מהירות כמו Ca ^{2 +} ארעיים בתאי עצב.
להתחיל בניסוי ולהקים פעילות בסיסית למשך 30 שניות.
החל תרופות מחוממות מראש של עניין, כגון אגוניסטים לקולטן ואת יריבים באמצעות מערכת זלוף זרימת כוח הכבידה בשיעור של 2-3 מיליליטר / דקה. עקוב יישום של אגוניסטים / יריבים על ידי חזרה לזלוף של חיץ רגיל ולאפשר תקופת לשטוף / התאוששות של לפחות 10 דקות.
הערה: זמני יישום התרופה ישתנו בהתאם למתחם הפרט ותכנון ניסויים. באופן כללי, יישום 20-30 שניות של אגוניסט מספיק להפעלת הקולטנים בשילוב G-חלבון בתאי עצב ותאי גליה. עם זאת, תעלות יונים מגודרת ליגנד (כגון קולטני אצטילכולין ניקוטינית) דורשות פעמים יישום של לא יותר מ 5-10 שניות. חשיפות משך נוספות תגרום תעלות יונים יגנד מגודרות למהירות את אלהnsitize. יריבים צריכים להיות מיושמים על כ 3-15 דקות כדי להבטיח מצור של מסלולי קולט מלא. עם זאת, מדובר בהכללה גסה וחוקרים תמיד צריכים לייעל את כל תרופה ניסיונית בפרדיגמה המסוימת שלהם.
להפסיק סרט הזמן לשגות הקלטה ותצוגה של הניסוי. אזורים נבחרים בקפידה של עניין (של ROI) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה המתאימה.
להשתמש בתוכנה כדי לנרמל ולהשוות עוצמת ניאון ROI נגד ערך ניאון בסיס הראשוני שלה. שינויים בקרינה מנורמלת הם ביחס ישר לשינויים ב[ Ca ^{2 +].}
1. השתמש בשינוי של שיטה שתואר קודם לכן ²⁶ באמצעות ΔF / F = ((F ₁ - F ₀₎ / F ₀₎ ROI - ((F ₁ - F ₀₎ / F ₀₎ רקע, שבו F1 הוא הקרינה בכל רגע נתון נקודה וF0 הוא הקרינה תחילת המחקר, כדי לשפר את דיוק ההערכה. עזרי שינוי זהבהפחתת רעש משינויי הקרינה בהכנות רקמה שמפגינים תנועה של שכבת שריר בסיס מקלעת myenteric.

Representative Results

שימוש נכון בטכניקה זו מאפשרת לחוקרים למדוד במדויק Ca ^{2 +} _i תאית ארעיים [Ca ^{2 +]} בנוירונים enteric וגליה בכל הר הכנות רקמות. דוגמא מייצגת של ^{2 +} תגובות Ca העורר אגוניסט בגליה בתוך הגנגליון myenteric מהמעי גס העכבר מוצגת בוידאו 1. התוצאות הבאות נועדו כדי להמחיש כמה תוצאות נציג השגנו בשיטה זו. ראשית, איור 2 מדגים את התוצאות של ניסוי מדידת גליה enteric [Ca ^{2 +]} _i שינויים בתגובה לגירוי על ידי ATP בהכנות שפן ניסיונות הגס מקלעת שריר myenteric אורכית (LMMP). באופן ספציפי, נתון זה מראה את השיטה לניתוח נכון של פרוטוקול הניסוי המפורט לעיל כולל את קווי המתאר של גנגליון myenteric ניתח וכוכביות מציין את המיקום של נוירונים enteric. תוצאות אלו גם illustrate המינון האופטימלי של ה- ATP מאה מייקרו על הגיוס של חזיר ים _אני בגליה myenteric [Ca ^{2 +].} תגובה זו יכולה לשמש כדי לכייל את גירוי גליה enteric ולנרמל את התגובות לגירויים לבדוק. בשלב הבא, איור 3 מבהיר כיצד לבחור כראוי אזורים של העניין (ROIs) המקיף את תאי גליה, מוצג עם סובבי עיגולים צהובים. תוצאות אלו מראות גם הרצויות שינויי הקרינה בתנאים בסיסיים ובתגובה לגירויים תרופתיים. לבסוף, איור 4 מדגים את השיקולים מרחביים לבחירת גליה ונוירונים enteric לi תגובות ^{[2 +} Ca] בהכנות כל הר.

איור 1. ארגון של ENS. ENS מכיל שני plexuses ganglionated גדול. מקלעת myenteric ממוקמת בין lשכבות שרירים ongitudinal ומעגליות. מקלעת submucosal ממוקמת בין הרירית ושכבת השריר המעגלית. ENS מורכב אך ורק של תאי עצב וגליה enteric. שטחי סיבי עצב להתחבר הגרעינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. גליה מעיים במגיבים מקלעת myenteric המעי הגס שפן הניסיונות לATP באתר. Fluo-4 הקרינה בגנגליון myenteric (א) (שתואר על ידי קו מקווקו) בתנאים בסיסיים. חיצים מצביעים על קטעי סיבי interganglionic עבים. (ב) על הגירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה, אבל לא תאי עצב, להגדיל במהירות Fluo-4 הקרינה המצביעה על עלייה ב[ Ca ^{2 +]} (C) להגיב לATP באופן תלוי-מינון עם mmol 1 / L לעורר תגובות מקסימליים ^24. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. Murine S-100-GFP תאים + במגיב מקלעת myenteric המעי הגס לATP באתר. () S-100-GFP + תאי גליה (ירוקה) בגנגליון myenteric מעי הגס עכבר (שתואר על ידי קו מקווקו). שישה אזורים של עניין (ROIs) המקיף את תאי גליה בתוך הגרעינים מוצגים כעיגולים צהובים. חצים מצביעים על קטעי סיבים עבים המובילים לגנגליון. ד כוכביותמיקום enote של 2 נוירונים enteric. אותו גנגליון מראה Rhod-2 הקרינה בתנאים בסיסיים (B). (ג) בעקבות גירוי עם ATP / L 100 μmol, תאי גלייה להגיב בגדלו [Ca ^{2 +]} _i, כפי שמוצגת על ידי Rhod- המוגבר 2 הקרינה. (ד) עקבות המתאימות לכל אחד את ההחזר על ההשקעה שמוצגת ב- C. (E) בממוצע תגובה (ממוצע ± SEM) של ROIs 6 הראתה ב ^-24 D. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. בהדמיה באתרו של תקשורת נוירון לגליה enteric. (א) נציג תמונות (pseudocolored) מניסוי הדמיה Ca ^{2 +} שבו כל הרהכנת מקלעת myenteric אותגרה עם אגוניסט העצבי קולט P2X7 BzATP (100 מיקרומטר, 30 שניות). שים לב שאגוניסט העצבי גורם לעלייה בקרינת Fluo4 בנוירון (א ') לפני התאים המקיפים את מעי גליה ("). (ב) ניתוח השינוי בקרינה לאורך זמן בגליה (הכחול) ותאי עצב (אדום ) לאחר יישום של אגוניסט העצבי, BzATP. (C) העצבית ותגובות גליה לBzATP במאגר רגיל (קווים מוצקים) ובמאגר המכיל Ca ^{2 +} הנמוך וMg ^{2 +} (קווים מקווקווים) להגברת קולטנים עצביים P2X7 ^13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

וידאו 1. תגובת Ca ^{2 +} עורר אגוניסט בגליה enteric באתרם. סרט זה מראה גנגליון myenteric מהמעי גס דיסטלי העכבר עמוס צבע המחוון ^{2 +} Ca, Fluo-4. אגוניסט תא גליה, ADP, מתווסף לאמבטיה כאשר הצביעו. ADP מעורר עלייה בCa ^{2 +} תאיים בגליה enteric כפי שנצפה על ידי ההעלאה החולפת בFluo-4 הקרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BubbleStop Syringe Heater	AutoMate Scientific	10-4-35-G
CaCl₂	Sigma	C3306
Collagenase, Type II, powder	Gibco	17101-015
Dispase	Sigma-Aldrich	42613-33-2
Dissection tools	Roboz
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Fixed-stage microscope	Olympus	BX51WI
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
Insect pins	Fine Science Tools	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
KCl	Sigma	P3911
MgCl₂	Sigma	M9272
NaCl	Sigma	S9888
NaH₂PO₄	Sigma	S8282
NaHCO₃	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Perfusion chamber	Custom
Peristaltic pump	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molecular Probes	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C