Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

تقييم التجريبية من الفأر المؤانسة باستخدام الآلي صورة نهج المعالجة

Published: May 15, 2016 doi: 10.3791/52508

Summary

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس مؤانسة الماوس. وتصويرها بالفيديو الفئران لأنها تتحرك وتتفاعل في قفص خاص. معالجة الفيلم يسمح لتقدير الآلي للمؤانسة مع دقة ممتازة والموثوقية.

Abstract

الفأر هو كائن النموذج المفضل لاختبار الأدوية المصممة لزيادة مؤانسة. نقدم طريقة لتحديد مؤانسة الماوس التي وضعت الماوس اختبار في جهاز موحد ويتم تقييم السلوكيات ذات الصلة في ثلاث جلسات مختلفة (الدورة يسمى الأول والثاني، والثالث).

الجهاز له ثلاث مقصورات (انظر الشكل 1)، المقصورات اليسار واليمين تحتوي على كوب مقلوب الذي يتسع الماوس (وتسمى "الماوس التحفيز").

في الجلسة الأولى، يتم وضع الماوس اختبار في القفص ويتميز التنقل من قبل عدد من التحولات التي أجريت بين المقصورات. في الجلسة الثانية، يتم وضع الماوس التحفيز تحت واحدة من كوب مقلوب وكميا مؤانسة من الفأرة اختبار من المبالغ الوقت الذي تنفق بالقرب من الكأس الذي يحتوي على الماوس التحفيز المغلقة مقابل فنجان مقلوب فارغة. في الجلسة الثالثة، يتم إزالة أكواب مقلوب ل د كل من الفئران تتفاعل بحرية. وكميا مؤانسة من الفأرة اختبار في جلسة الثالث من قبل عدد من النهج الاجتماعية يجعل نحو الماوس التحفيز وعدد المرات أنه يتجنب نهج الاجتماعي عن طريق الماوس التحفيز.

التقييم الآلي للفيلم يكشف الأنف من الفأرة اختبار، والذي يسمح بتحديد جميع التدابير مؤانسة وصفها في جلسة الأول والثاني (في الجلسة الثالثة، يتم تحديد النهج تلقائيا ولكن تصنف يدويا). العثور على الأنف، وصورة من قفص فارغ وطرح رقميا من كل إطار من الفيلم وbinarized الصورة الناتجة لتحديد بكسل الماوس. تتم إزالة ذيل الماوس تلقائيا ويتم تحديد اثنين من أبعد نقطة من الفأرة المتبقية. وهذه هي قريبة إلى الأنف وقاعدة الذيل. من خلال تحليل حركة الماوس واستخدام الحجج الاستمرارية، يتم التعرف على الأنف.

</ HTML"الشكل 1" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
الشكل 1. تقييم المؤانسة خلال 3 جلسات الجلسة الأولى (أعلى):.. التأقلم اختبار الماوس إلى قفص الجلسة الثانية (وسط): اختبار الماوس تتحرك بحرية في قفص بينما يتم وضع الماوس التحفيز في كأس مقلوب الجلسة الثالثة كلاهما مسموح الماوس اختبار والفأر التحفيز على التحرك بحرية وتتفاعل مع بعضها البعض: (القاع).

Introduction

مؤانسة ضعف هي واحدة من المجالات أعراض الأولية في مجموعة من الاضطرابات العصبية النمائية، بما في ذلك اضطرابات طيف التوحد (أي إس دي إس) 1،2. وهو يحد بشدة من قدرة المرضى على تطوير العلاقات وتؤثر بشكل كبير المرضى والأسر ومقدمي الرعاية 2،3.

في محاولة لفهم أفضل لآلية الكامنة مؤانسة واختلال في وتطوير علاجات، وقد تم دراسة عدة نماذج الماوس 1،4-9. واحدة من هذه السلالة هو BALB / ج الماوس، سلالة الفطرية التي يسلك مؤانسة منخفضة لافت للنظر، تشبه ملامح ينظر في المرضى الذين يعانون من ASD5 8-12. على سبيل المثال، يعرض BALB / ج الماوس أدنى تردد النهج الاجتماعية وردا عادة سلبية على النهج الاجتماعية عن طريق الماوس التحفيز (على سبيل المثال، وتجنب الاجتماعي) من مقارنة سلالة بستر السويسري 10.

لاختبار ما إذا كان العلاج المقترح هو الفعاليهه في زيادة مؤانسة، هناك حاجة إلى معايير موضوعية. إطار مقبولة على نطاق واسع هو تحليل مؤانسة في جهاز موحد الذي يحتوي على ثلاث مقصورات (انظر الشكل 1).

المقصورات اليسار واليمين كل تحتوي على كوب الأسلاك المقلوب الذي يضم الماوس التحفيز البارزة اجتماعيا. يتم تحرير الماوس اختبار في الجهاز لمدة ثلاث فترات من 10 دقيقة (جلسات I-III)؛ جلسة أنا يقيم النشاط الحركي للفأرة الاختبار، في حين الدورات الثانية والثالثة تقييم الجوانب المختلفة للمؤانسة الماوس الاختبار.

في الجلسة الأولى، ولا يسمح للفأر اختبار ليتأقلم مع الجهاز. في هذه الدورة، يتم قياس عدد من التحولات التي تجعل الماوس اختبار بين مقصورات مختلفة. الأهم من ذلك، التدابير مؤانسة التي تم الحصول عليها في معيار جهاز ثلاث حجرات وتعتمد على النشاط الحركي، وانخفاض النشاط الحركي يمكن أن يربك تفسير SOCIالبيانات القدرة.

في الجلسة الثانية، والماوس اختبار تتحرك بحرية ويتم وضع الماوس التحفيز تحت واحدة من كوب مقلوب (موازنة). الفئران التحفيز هي مدة 4 أسابيع من العمر الأباعد ذكر النواب الفئران، العمر وللفئران اختبار المطابقة الجنس. يتم وضع الماوس التحفيز في كأس مقلوب في الجانب تسمى حجرة الاجتماعية، ويوضع كوب مقلوب فارغة في الجانب تسمى حجرة الغير اجتماعية. في الجلسة الثانية، وكميا مؤانسة من الفأرة اختبار بمقارنة الوقت الذي تنفق بالقرب من "الاجتماعي" فنجان مقلوب (أقل من 2 سم بعيدا) مقابل الوقت الذي تنفق بالقرب من "الغير اجتماعية" فنجان مقلوب، وبحلول الوقت تنفقها في المقصورة الاجتماعية مقابل الوقت الذي ينفق في المقصورة الغير اجتماعية. وبستر السويسرية الفئران مقارنة تنفق مزيدا من الوقت في حجرة الاجتماعية وبالقرب من كوب مقلوب الاجتماعي مقارنة BALB / ج الفئران التي لا تظهر أي تفضيل كبير لالاجتماعيةفنجان مقلوب أو مقصورة الاجتماعية 12.

في الجلسة الثالثة، يسمح للاختبار والتحفيز الفئران للتفاعل بحرية (يتم إزالة أكواب المقلوب). ويتم الحصول على تدابير مؤانسة والسلوكيات النمطية والانتقال بين الأجزاء بشكل صحيح في الدورة 10 دقيقة الثالثة من التفاعل الحر بين الاختبار والفئران التحفيز وتحليلها. في هذا التقرير، وكميا مؤانسة من الفأرة اختبار عن طريق اثنين من التدابير ما يلي: 1) عدد من النهج الاجتماعية يجعل نحو الماوس التحفيز، حيث يتم تعريف نهج الاجتماعي الذي تتحرك إلى الأمام (الأنف أولا) نحو الماوس التحفيز حتى يتسنى لل الأنف هو أقل من 2 سم بعيدا عن الماوس التحفيز. 2) عدد الاجتناب النهج الاجتماعية عن طريق الماوس التحفيز. يعتبر الماوس اختبار ليتم تجنب النهج إذا ما تبين أو يتحرك بعيدا عن الماوس التحفيز، أو إذا توقف مؤقتا المتحركة ( "تجميد السلوك") بعد الماوس التحفيز قد اقترب الماوس الاختبار. BALB /وتشير ج الفئران انخفاضا في عدد من النهج الاجتماعية المحرز نحو الماوس التحفيز وزيادة في عدد الردود السلبية إلى النهج الاجتماعية عن طريق الماوس التحفيز، مقارنة مقارنة سلالة بستر السويسري 10.

وقد جرت العادة على القيام بتقييم الأفلام السلوكية يدويا، أي من خلال مشاهدة الفيلم بعناية (وربما بسرعة منخفضة) وتفعيل الوقف للمرة الماوس تنفق في حجرة معينة أو بالقرب منها واحدة من أكواب مقلوب 10. يتطلب هذا الأسلوب مشاهدة الفيلم مرارا وهو، بالتالي، تستغرق وقتا طويلا جدا. أيضا، دقة محدودة من الوقت رد فعل المقيم لالقياسات ساعة توقيت والقدرة على إدراك ما إذا كان الماوس على بعد 2 سم من كوب مقلوب. في الأعمال الأخيرة، مجمعين، وقد ثبت (D-سيرين وD-سيكلوسيرين) فعالة في استعادة مؤانسة في BALB / ج الفئران 9،10،12. ومن المعروف أن كلا من مكونات MODUفي وقت متأخر من مستقبلات NMDA، والذي يعرف للعب دور مركزي في السلوك الاجتماعي 2،12. ومن المعروف أن مجموعة كبيرة من المركبات لتعديل NMDA نشاط مستقبلات في مجموعة متنوعة من الطرق واضحة المعالم، واحتمال حدوث طفرة في علاج التوحد يجعل تقييم المعجل من هذه المركبات أولوية وطريقة تلقائي سريع لتقييم مرغوب فيه للغاية.

هو موضح أدناه هو إجراء التحليل الآلي المتقدمة لتقييم مؤانسة الماوس. ويستخدم أساليب معالجة الصور على جميع الأطر من الأفلام الماوس لتحديد الموقف من الماوس أو الفئران. في الجلستين الأولى والثانية، يكشف مزيد من موقف الأنف ويستخدم لحساب التدابير مؤانسة. في الجلسة الثالثة، فإنه تلقائيا بالكشف عن النهج، ولكن مطلوب تصنيف اليدوي (النهج الاجتماعي، وتجنب الاجتماعي، أو غيرها).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم تقسيم بروتوكول لسهولة الشرح إلى أجزاء 2: 1) إجراء التجارب و2) التحليل الآلي. تم علاج جميع الحيوانات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 15، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. الإجراءات التجريبية

  1. إعداد قفص، وهي سوداء زجاجي غير عاكس مربع مستطيل (52 × 25 × 23 سم 3) مقسمة إلى ثلاث مقصورات: الاجتماعية، الغير اجتماعية، وحجرة الأوسط محايد (الشكل 1). وضع كوب الأسلاك مقلوب في كل من المقصورات نهاية خلال الجلستين الأولى والثانية (التي تناقش أدناه)، وإيواء الماوس التحفيز خلال الجلسة الثانية.
  2. إعداد الكاميرا بطريقة أن القفص تملأ مجال الرؤية. منذ الإضاءة يمكن أن تتداخل مع سلوك الماوس، والحفاظ على الإنارة لا تزيد عن 3.5 لوكس داخل القفص، قادمة من الضوء غير المباشر منلمبة ضوء ساطع ويقاس على أرضية القفص في الاتجاه الصعودي. أيضا استخدام مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء، التي الفئران لا يمكن الشعور ولكن يمكن للكاميرا كشف. تسجيل جميع الأفلام في 720 × 480 تعريف موحد.
  3. تسجيل إطار واحد من قفص فارغ لمعالجة الصور في وقت لاحق (تسمى "الإطار المرجعي") وحفظ كصورة ذات درجات الرمادي.
  4. الجلسة الأولى: إدخال اختبار الماوس في قفص وموجة تسليم القفص، مما يدل على بداية الدورة (مقارنة تحليل الآلي). فيلم سجل لمدة 10 دقيقة. في نهاية مدة 10 دقيقة، ووضع الماوس مرة أخرى في قفص الأصلي.
  5. الجلسة الثانية: ضع الماوس التحفيز تحت واحدة من كوب مقلوب (موازنة).
  6. استخدام الزر أو "اليسار الاجتماعي" "الحق الاجتماعي" لتحديد ما إذا كان الماوس التحفيز في كوب مقلوب على اليسار أو في فنجان مقلوب على الحق.
    ملاحظة: كأس مقلوب مع الماوس التحفيز يسمى "كأس الاجتماعي"، في حين أن البعضكوب "كأس الغير اجتماعية". المقصورة التي تسمى الكأس الاجتماعي يقع مقصورة الاجتماعية، مقصورة مع كوب الغير اجتماعية هي مقصورة الغير اجتماعية، والمقصورة الوسطى هي "مقصورة محايدة".
  7. تعريف الماوس اختبار في قفص. ومن ناحية موجة فوق القفص للدلالة على بداية الدورة. فيلم سجل لمدة 10 دقيقة. الأهم، والحفاظ على الفئران في الجهاز مؤانسة قبل إزالة كوب مقلوب للبدء الجلسة الثالثة.
  8. الجلسة الثالثة: إزالة كوب مقلوب، والإفراج عن كل من الفئران والسماح للاختبار والتحفيز الفئران للتفاعل بحرية مع بعضها البعض. ومن ناحية موجة فوق القفص للدلالة على بداية الدورة. فيلم سجل لمدة 10 دقيقة. في نهاية مدة 10 دقيقة، وضعت كل من الفئران مرة أخرى في أقفاص كل منهما.

2. تحليل الآلي

ملاحظة: يتم إصدار الأوامر في القسم 2 عن طريق واجهة المستخدم الرسومية (انظر الشكل 2) أن يخدعمفاتيح التحكم برنامجنا. نحن هنا شرح تجهيز خطوة بخطوة أن يسمح برنامجنا. هذا البرنامج هو أيضا قادرة على أداء التحليل في دفعة واسطة دون تدخل من المستخدم.

  1. لكل فيلم، وتنفيذ خطوات المعالجة التالية:
    1. فيلم تحميل (انقر على زر تحميل).
    2. حدد التكوين القفص، الذي يحكي برنامج تحليل الموقع من حدود القفص، حدود المقصورة، ومواقع الكأس. اختيار واحد من أربعة تكوينات المحفوظة أو يدويا ضبط جميع الإحداثيات.
      ملاحظة: تكوين عادة لا يغير من تجربة واحدة إلى أخرى، وبالتالي يمكن إعادة استخدامها.
    3. لكل إطار من الفيلم، نفذ الخطوات المعالجة التالية (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. تحويل الإطار إلى الرمادي عن طريق النقر على زر "درجات الرمادي".
      2. رقميا طرح إطار الرمادي المرجعية (راجع الخطوة 1.3) عن طريق النقر على زر "طرح". ملاحظة: إن الهدف من هذه الخطوة هو جعل فا بكسلالزهرى الإطار قريبة جدا من الصفر في كل مكان باستثناء موضع الماوس.
      3. Binarize إطار عن طريق وضع كل بكسل أقل من مستوى عتبة معينة إلى الأسود، كل بكسل فوق هذا المستوى إلى الأبيض (انقر على زر "Binarize").
        ملاحظة: والفكرة هي أنه منذ بكسل الماوس عموما القيم أعلى من بكسل المتبقية، بكسل الماوس سوف تصبح بيضاء وكل بكسل الأخرى سوداء. يعتمد مستوى عتبة الأمثل في حالة الإضاءة ويمكن تحديد وتقييم شكل الماوس في جميع أنحاء الفيلم. إذا تم اختيار عتبة منخفضة للغاية، يظهر الماوس كبير جدا، وبكسل التي لا تنتمي إلى الماوس يمكن أن تكون ملونة بيضاء. إذا كانت عتبة مرتفعة جدا، والماوس يصبح صغيرة، ويمكن أن تتفكك إلى أجزاء منفصلة. في الأفلام المسجلة، كانت عتبة المثلى دائما ما بين 20 و 35 (على مقياس من 0 إلى 255).
      4. تآكل 13 مرات الصورة الإلكترونية binarized، ثم تمدد 13 2E مرات، ثم EROدي مرة ثانية الإلكترونية، عن طريق الضغط على زر "EROD / ديل".
        ملاحظة: الغرض من هذا الإجراء هو إزالة الذيل. للقرار (720 × 480) التي تم استخدامها، ه = 3 يعمل في جميع الظروف.
        ملاحظة: البرنامج بالتحقق تلقائيا من وجود يد في الصورة (أثناء تسجيل الأفلام، ولوح أيدي من خلال الصورة للدلالة على بداية جلسة). لو ان يدا موجودة، سيكون هناك العديد من على غير العادة بكسل البيضاء في إطار binarized لأن اليد هي أكبر بكثير من الماوس. في حالة وجود يد هي أن هناك أكثر من 10000 بكسل البيضاء في إطار binarized. برنامج يحدد بدايات جلسات الأول والثاني، والثالث، عن طريق الكشف عن مجموعة من الأطر التي تحدث فيها حركات اليد.
  2. في الجلستين الأولى والثانية، والاستمرار على النحو التالي:
    1. الكشف عن أكبر املوصل من مجموعة بكسل البيضاء (اضغط على "LComp"). ملاحظة: الغرض سو هذه الخطوة هي للقضاء بكسل البيضاء التي لا تنتمي إلى الماوس، على سبيل المثال، والناجمة عن حركة الماوس التحفيز في الجلسة الثانية. أكبر املوصل هو تقريبا في جميع الأطر الماوس.
    2. تحديد اثنين من وحدات البكسل الأبيض الأكثر بعدا (وتسمى "الغايات" من الفأرة) بالنقر على "البحث ينتهي".
      ملاحظة: البرنامج ينص على استمرارية طرفي، أي لكل من طرفي في الإطار الأول إلى أي من طرفي في إطارات اللاحقة ينتمون إليها. الفكرة العامة هي أنه منذ تسجل إطارات في ارتفاع معدل، وينتهي لا يستطيع السفر بعيدا عن إطار واحد إلى آخر، بحيث لاستمرار الصحيح من نهايات من إطار واحد إلى أخرى هو الذي يقلل من مجموع المسافات التي نهايات تتحرك. انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل.
    3. تحديد نهاية الماوس هو الأنف.
      1. تحديد الاتجاه الذي يتحرك الماوس عن طريق مراقبة كيفية مركز الجاذبية (ترس)التغييرات من إطار إلى إطار (حركة ترس هو اقتراح من مجموع كل بكسل الماوس).
        ملاحظة: ترس من مجموعة من بكسل ص ...، ص ن مع إحداثيات س ..، ويعرف س ن من قبل:
        المعادلة 1
        عادة ما تتحرك الفئران إلى الأمام (أي نحو الأنف). في قسم من عدة مئات من الإطارات، وهناك دائما ثقة عالية جدا في كشف رئيس / الذيل.
        ملاحظة: البرنامج يحدد تلقائيا نحو أي من الكشف ينتهي الماوس يتحرك. يتم تحديد هذه الغاية كما الأنف ووضع علامة مع دائرة حمراء في الفيلم. عندما يتم وضع علامة على الأنف الكشف مع دائرة حمراء في كل إطار، يمكن للمستخدم التحقق من نوعية الكشف.
  3. في الجلسة الثالثة، لا تزال على النحو التالي:
    1. كشف اثنين من أكبر مكونات بكسل البيضاء.
      1. إذا كان كلاهما من حجم مقبول لصباحا[أوس] ومراكزها الجاذبية (التروس) متوافقة مع التروس الماوس من الإطار السابق، والنظر في هذين العنصرين الفئران اثنين.
      2. النظر الماوس أحجام مقبولة إن لم تكن قد تغيرت بأكثر من 20٪ منذ الإطار السابق، والنظر في تكلفة المبيعات من إطارين متتالية ومتوافقة إذا فارق بهم ليست أكبر من المسافة الماوس يمكن السفر في الوقت بين الإطارات (هذه المسافة يتبع من الحد الأقصى للسرعة الماوس، والذي يمكن تحديده كجزء من الاستعدادات لسلسلة التجربة من خلال تحليل حركة العديد من الفئران الفردية (كما في الجلستين الأولى والثانية).
        ملاحظة: إذا كان اثنان من أكبر مكونات أحجام غير مقبولة للفأرة، أو التروس مختلفة جدا عن تلك الموجودة في الإطار السابق، البرنامج يزيد تلقائيا عتبة binarization حتى اثنين من أكبر مكونات ذات حجم مقبول والتروس الخاصة متوافقة مع تلك من الإطار السابق.
    2. انقر بزر الفأرة الأيمن اختبار فيالإطار الأول. استخدام التحليل في 2.3.1 التعرف على كل اختبار والفأر التحفيز في كل إطار الدورة الثالثة.
    3. تحديد الأطر في الجلسة الثالثة التي الماوس واحد يقترب اجتماعيا من جهة أخرى. ملاحظة: البرنامج ينفذ هذه الخطوة عن طريق فحص تلقائيا أن المسافة بين الفئران هو أقل من المسافة التفاعل نموذجية من الفئران (نستخدم 2 سم).
    4. عندما يلعب البرنامج قطعة قصيرة من الفيلم مع اقتراب الكشف للمستخدم، انقر فوق الزر لبيان ما إذا كان هذا النهج مؤهلا كنهج الاجتماعي عن طريق الماوس الاختبار، وتجنب الاجتماعي عن طريق الماوس اختبار، أو لا.
      ملاحظة: الخطوة 2.3.4 يمكن المؤتمتة إذا فمن المعروف الذي الماوس هو الفأر الاختبار. منذ يحصل على هذه المعلومات المفقودة عند الحصول على الفئران قريبة جدا من بعضها البعض (أو تسلق فوق بعضها البعض)، ونظرا لأننا لم يجد بعد طريقه لتسمية الفئران في الطريقة التي يمكن أن يتم الكشف بشكل موثوق به من قبل برنامجنا ويفعل لن يؤثر على سلوكهم، ونحن قد عادت لتصنيف اليدوي في الوقت الراهن.
  4. لتقييم الأفلام معالجتها، فيلم تحميل باستخدام زر التحميل.
    1. انقر على بداية جلسة 1 إلى عرض الإطار الأول من الجلسة 1 (أو بدء الدورة 2 لعرض الإطار الأول من الجلسة 2).
    2. انقر على تشغيل / إيقاف لوالتوقف عن لعب الأفلام.
      ملاحظة: إن الأفلام معالجتها عرض الفأر مع الرأس والذيل ملحوظ مع دوائر ملونة مختلفة. يتم عرض جميع التدابير مؤانسة على الشاشة وتحديثها كما يلعب الفيلم.
    3. تصدير البيانات مؤانسة في تنسيق Excel بالنقر على "تصدير".
    4. انقر على "بيانات ترجمة" لتجميع كافة البيانات من جميع الأفلام في مجلد في ملف اكسل واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 3 لون الإطار من فيلم السلوكي مع قفص فارغ. لم يتم عرض الفأر في قفص حتى الان. وفرضه موقف الكؤوس، (الاجتماعية والغير اجتماعية) وحدود المقصورة. يتم تحويل لون الإطار من قفص فارغ إلى 8 بت الرمادي كما هو مبين في الشكل (4) وتستخدم كإطار مرجعي. يتم طرح الإطار المرجعي من كل إطار آخر من الفيلم القبض عليه.

ويبين الشكل 5 واحدة من الإطارات من الفيلم خلال الجلسة الأولى، مرة أخرى مع حدود حجرة والمواقف كوب فرضه. يتم طرح الإطار المرجعي من إطار العينة ونتيجة لذلك، دعا إطار الفرق، هو مبين في الشكل (6).

الرقم 7 هو نسخة binarized الإطار الفرق. (انظر القسم 2.1.3.3). يوضح الشكل أيضا موقف الأنف (الدائرة الحمراء)، وقاعدة تاايل (الدائرة الرمادية)، كما هو محدد في القسم 2.2.4).

وبمجرد إنشاء موقف الأنف عن كل إطار من الفيلم، مسار الماوس ويمكن تحليل بأي شكل من الأشكال المطلوبة الشكل 8 يظهر مواقف الأنف الماوس (الدوائر البيضاء) لجزء من الفيلم الذي يغطي حوالي 1000 إطارات (~ 30 ثانية).

ويبين الشكل 9 نتيجة تحليل مؤانسة للجلسة الأولى ويستخدم عدد من التحولات بين المقصورات القفص بمثابة مقياس للنشاط الحركي (في المثال المبين، 59 التحولات في 10 دقيقة تشير إلى النشاط الحركي الطبيعي). الوقت الذي يقضيه في أجزاء مختلفة من القفص بمثابة الأساس للحكم تفضيل لمقصورة الاجتماعي / كوب في الجلسة الثانية.

ويبين الشكل (10) ونتيجة التحليل مؤانسة للجلسة الثانية. ذات أهمية خاصة هي الأوقات قضى بالقرب من كوب الاجتماعي مقابل الغير اجتماعية (في إكساء معروضةmple 230.8 مقابل 72.3 ثانية) والاجتماعية مقابل المقصورات محايدة والغير اجتماعية (314.7 مقابل 109.4 مقابل 185.5 ثانية). وتحيز واضح نحو الكأس الاجتماعي والمقصورة هي نموذجية للالسيطرة على الفئران، والمقارنة مع بيانات من جلسة الأول (الشكل 9) يدل بوضوح على أن التحيز هو في الحقيقة نتيجة وجود الماوس التحفيز.

ويبين الشكل (11) ونتيجة التحليل مؤانسة للجلسة الثالثة. ارتفاع عدد النهج الاجتماعية (35 في 10 دقيقة)، وكذلك ردود إيجابية للغاية لنهج الاجتماعية عن طريق الماوس التحفيز (9/10) ونموذجي من الفئران مع مؤانسة طبيعية.

الشكل 2
الشكل 2. الرسومية واجهة المستخدم. يرجى جلعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. قفص الخالي. ويستخدم هذا كإطار مرجعي بعد التحويل إلى اللون الرمادي الحجم. تظهر دائرة حمراء موقف كوب الاجتماعي والكأس الغير اجتماعية في الجانب المقابل. خطوط بيضاء عمودية تقسم القفص إلى أقسام مختلفة، ويظهر مستطيل الحدود الداخلية للقفص.

الشكل (4)
الشكل 4. درجات الرمادي إصدار الرقم 3.

الرقم 5
الرقم 5. الإطار الأصلي. يؤطر الفيلم في شكل الرمادي. يتم وضع علامة على اسطوانة الاجتماعية من خلال دائرة بيضاء، وويوجه دائرة رمادية إضافية مع دائرة نصف قطرها 2 سم أكبر من أن الاسطوانة الاجتماعية لترسيم المنطقة التي تعتبر الماوس اختبار "وثيقة" لاسطوانة الاجتماعية. في الزاوية المقابلة، يتم وضع علامة على اسطوانة الغير اجتماعية من قبل الدائرة الرمادية، ومرة ​​أخرى، دائرة إضافية مع 2 سم ويوجه دائرة نصف قطرها أكبر لترسيم المنطقة التي تعتبر مقربة من اسطوانة الغير اجتماعية. خطوط بيضاء عمودية تقسم القفص إلى أقسام مختلفة، ويظهر مستطيل الحدود الداخلية للقفص.

الشكل (6)
الرقم 6. الفرق صورة. الصورة التي تم الحصول عليها عن طريق طرح الإطار المرجعي من إطار العينة.

الرقم 7
الرقم 7. Binarized صورة. بكسل في ديتعتبر صورة fference التي تتجاوز عتبة معينة (30 في هذا المثال) بكسل الماوس وتظهر بيضاء. دائرة حمراء تدل على الأنف ودائرة بيضاء هي الذيل.

الرقم 8
الرقم 8. ماوس مسار المنحنى، ودوائر بيضاء صغيرة تظهر في موقع من الأنف من بداية جلسة الأولى حتى تم القبض على هذا الإطار.

الرقم 9
الرقم 9. نتائج التحليل المؤانسة للدورة الأولى. والأرقام المذكورة أعلاه المقصورات قفص منها تشير إلى أضعاف الماوس قضى فيها (في هذه الحالة 254.3 ثانية في المقصورة اليسرى، 155.2 ثانية في مقصورة محايدة، و237.0 ثانية في حق مقصورة). الأرقام داخل الدوائر تشير إلى أضعاف الماوس قضى على مقربة من الدقةpective كوب (يعني "إغلاق" أقل من 2 سم بعيدا، أو داخل الخارجي من الدائرتين): 140.0 ثانية على مقربة من فنجان اليسار، و105.6 ثانية على مقربة من كوب الصحيح. الرقم في مركز القاع يشير إلى عدد المرات التي انتقلت الماوس بين مقصورات مختلفة من القفص (59 مرات في المثال).

الرقم 10
الرقم 10. نتائج التحليل المؤانسة للدورة الثانية. والأرقام المذكورة أعلاه المقصورات وداخل وتشير الاوساط مرات قضى في جزء مختلف من القفص كما في الشكل 9 / جلسة أولا لاحظ أن في الجلسة الثانية، هناك الماوس التحفيز في واحد من كؤوس مقلوب (اليسار واحد في هذه الحالة)، بحيث يصبح هذا الكأس الكأس "الاجتماعي". وبالإضافة إلى التدابير الدورة الأولى، في الوقت الذي الماوس يستغرق الاختبار للحصول على مقربة (في حدود 2 سم) إلى اسطوانة الاجتماعية لليعطى مرة الأولىفي أسفل يمين الوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 11
الرقم 11. نتائج التحليل المؤانسة للدورة الثالثة. الرقم بعد "نهج" ينص على عدد من المناهج الاجتماعية التي أدلى بها الماوس الاختبار، وأرقام بعد "نقاط البيع. التركيب. "و" NEG. التركيب. "دولة عدد الردود الإيجابية والسلبية عن طريق الماوس اختبار لنهج الاجتماعية عن طريق الماوس التحفيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من خلال الجمع بين بتصوير الفئران وتحليل الفيلم التلقائي، لقد أنشأنا وموثوقة عالية الإنتاجية تقنية فحص بأسعار معقولة.

وتمت مقارنة دقة التحليل الآلي مع نتائج التحليل اليدوي لأكثر من 100 فيلم. في الغالبية العظمى من الإطارات (> 99٪) من الإطارات، ويتم التعرف على الأنف من الفأرة مع دقة جيدة. أكثر من (الحصر) misdetections يكون له تأثير على التدابير مؤانسة، لذلك أن حوالي 80٪ من الأفلام لا تتطلب أية تصحيحات.

في تلك الأفلام التي لا تحتوي على misdetections، إلى حد بعيد المشكلة الأكثر شيوعا هو أن الرأس والذيل يتم الخلط بين، لذلك أدرجنا في البرنامج طريقة بسيطة للتبديل الرأس والذيل لشريحة الفيلم. حتى لو كان ينظر إلى الأفلام للتحقق من وتصحيح كل misdetections، ويمكن أن يتم هذا الاختيار في حوالي 3 مرات سرعة في الوقت الحقيقي، بحيث لا يبقى الوقت تقييم قصير جدا. المقاطع من الفيلمالذي الماوس ليست قريبة إلى واحدة من اسطوانات ويمكن الاطلاع على سرعة أعلى من ذلك.

اتفاق بين جميع التدابير مؤانسة تحدد تلقائيا ويدويا ممتاز (على افتراض أن تم تصحيح misdetections ممكن). في الواقع، فإن نوعية الإجراءات مؤانسة تحدد تلقائيا متفوقة على تحديد يدويا منها، لأنه يتم استخدام معايير موضوعية باستمرار لتحديد المسافات والأوقات، في حين يعاني تقييم اليدوي من حدود الإدراك البشري وفترة رد الفعل. تصبح هذه الحدود أشد مع سرعات العرض العليا، التي تكون مرغوبة للحد من وقت التقييم.

مذكرة بشأن خطوة 2.2.2: يتم تنفيذ هذا الروتين عن طريق الحد من مجموعة من وحدات البكسل البيضاء على حدودها باستخدام أدوات معالجة الصور القياسية 14 وحساب المسافة بين أي اثنين بكسل الحدود. العثور على أبعد نقطة مفيد لأن الأنف وقاعدة الذيلتميل إلى أن تكون قريبة جدا من هذه طرفي.

للتأكد من اكتمالها، وصفت تنفيذ استمرارية نهايات (الخطوة 2.3.4) أدناه. في إطار معين مع نهايات ج، د والإطار السابق مع نهايات أ و ب، سواء ج ينتمي إلى ود إلى b أو c ينتمي إلى b و d ل(انظر الشكل 12).

الرقم 12
الرقم 12. استمرارية تحديد. ماوس في اللون الرمادي الفاتح مع الأنف والذيل وضع علامة أ و ب على التوالي هو الموقف المبدئي. الماوس باللون الأبيض مع ذيل الأنف ملحوظ ج، د على التوالي هو موقف الماوس في الإطار التالي.

الفكرة العامة هي أن لاستمرار الصحيح، ومجموع المسافات التي يقطعها نهايات أصغر من استمرار صحيح، لأن الماوس يسافر أقل من طول الخاص بها من إطار واحد إلى آخر. في المثال (الشكل 2 δ 1 = | ج - ل|، δ 2 = | د - بΔ 1 = | ج - بوΔ 2 = | د - ل|، وأقول ذلك لأن δ 1 + δ 2 1 + Δ واستمرار الصحيح هوج و بد. مقياس جيد للثقة لمثل هذا القرار هو نسبة ص = ماكس 1 + δ Δ 1 + Δ 2) / دقيقة 1 + δ Δ 1 + Δ 2)، الذي يصف كيف أكثر من ذلك بكثير سوف ينتهي السفر في الاستمراريه واحدن مقابل الآخر. بحكم التعريف، ص أكبر أو يساوي 1. للحصول على الأشكال الماوس ممدود، ص هو عادة أكبر من 10، إلا إذا أصبح شكل الماوس أكثر دائرية (على سبيل المثال، لأن الماوس يقف على رجليه الخلفيتين)، ص يمكن الحصول على مقربة من واحد واستمرار لا يمكن الاعتماد عليها. لاستمرار موثوق بها، وقد استخدمت عتبة ص> 2.5. مع هذه العتبة، وأجزاء من الأطر على التي أنشئت استمرارية الغايات، ويتراوح عادة من مئات الآلاف من الإطارات. لكل قسم، وتحديد اتجاه الذي ينتهي الماوس يتحرك داخل القسم. وبمجرد إنشاء الاستمرارية في القسم، و "مركز الثقل" (ترس، متوسط ​​إحداثيات كل بكسل الماوس) يتم تحديد لكل إطار في هذا الباب. الفرق في ترس من إطار واحد إلى آخر يحدد سرعة الماوس بين إطارين. ومن المتوقع أن هذا سرعة على ناقلات الذي يربط طرفي لمعرفة ما إذا وكم الماوس تتحرك السحبARDS الأول أو في نهاية الثانية. الحركة الإجمالية (والذي هو إما نحو الأول أو نهاية الثانية) هو الجمع من الاقتراحات من جميع الأطر.

هذا البروتوكول يمكن تعديلها في عدة طرق لمعالجة احتياجات تجريبية مختلفة. إذا جوانب مختلفة من حركة الماوس، (على سبيل المثال، فإن متوسط ​​السرعة) هي من الفائدة، وهذه يمكن استخلاصها من مسار الماوس محسوب. إذا كانت ظروف الإضاءة تختلف كثيرا عن تلك التي وصفها هنا، وعتبة في خطوة binarization أن تعطي بكسل الماوس يمكن تعديلها. حتى التغيرات مثل شكل قفص مختلفة يمكن تنفيذها عن طريق تعديل لدينا الحالي روتين التكوين القفص.

البرنامج الموصوف يخلط أحيانا الرأس والذيل (في أقل من 20٪ من الأفلام، وهناك حاجة لتصحيح لأن الوجه الرأس / ذيل من شأنه أن يؤثر تقييمنا). كتبنا أداة مريحة التي تسمح للمستخدم لتحديد أول وTHالبريد الإطار الأخير من الفترة التي الرأس والذيل الحاجة إلى أن انقلبت وثم تنفيذ هذا التصحيح مع ضغطة واحدة. وكان عدد قليل جدا من الأفلام (بنسبة قليلة) مشاكل أخرى من الوجه الرأس / الذيل، هذه التي قطعناها على أنفسنا أداة تصحيح أكثر العامة التي تسمح للمستخدم لتحديد في أي جزء من القفص الأنف اختبار الماوس خلال أي فترة. لاحظ أن الحاجة إلى تصحيح يحدث ذلك نادرا ما أثر في الوقت المحدد التقييم هو صغير.

ملحقات المخطط للبروتوكول هي أيضا للكشف عن أكثر اجتماعيا السلوكيات ذات الصلة، مثل السعي والشرجية التناسلية استنشاق (التي يمكن الكشف عنها من خلال رصد المسافة من الأنف من الفأرة اختبار للجسم وفتحة الشرج من الفأرة التحفيز، على التوالي). قد تكون السلوكيات النمطية أيضا كشفها، على سبيل المثال تربية، والتي يمكن الكشف عن التغير في شكل الماوس. تمديد آخر للاهتمام هو استخدام الفئران من ألوان مختلفة، والتي ينبغي أن تكون واضحة طالما لون اختبار لد التحفيز الماوس يكون النقيض جيدة مع لون الجدران قفص وأرضية القفص.

وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة له التجريبية وجزءا معالجة الصور. في الجزء التجربة، وأهم الخطوات هي للتحقق من الإضاءة وتحديد المواقع من القفص ثم لتسجيل سلوك الماوس خلال ثلاث دورات (الأول: وحيدا في القفص، والثاني: مع الماوس التحفيز المحصورة، الثالث: التفاعل بحرية مع التحفيز الماوس). في الجزء التحليل، هي خطوات حاسمة لتحميل التكوين فيلم والقفص، لتنفيذ معالجة الصورة على كل إطار الفيلم لتحديد مواقع الأنف والذيل ثم لحساب الإحصاءات اللازمة لتحديد مؤانسة من الأنف والذيل مسارات.

وجود قيود على طريقة وصفها هو الذي تم اختباره فقط بالنسبة للفئران مع الفراء الأبيض. ومن المنطقي أن التحليل الآلي ستعمل ايضا على قدم المساواة مع ألوان الفراء أخرى طالما جدران أجهزة والطابق توفرتباين قوي مع لون الفراء، ولكن لم يثبت هذا حتى الان.

الحد آخر هو عدم وجود أتمتة تقييم الدورة الثالثة. وتكمن الصعوبة الرئيسية بالنسبة لنا، وجماعات أخرى، هو تتبع التي الفأرة الماوس الاختبار والتي الماوس التحفيز خلال لقاءات قريبة متكررة من الفئران. لقد وجدنا أن نتمكن من حل هذه المشكلة مع علامات مثل النقاط الملونة بين آذان الفئران، ولكن كل الطرق بمناسبة التي حاولنا حتى يكون بعيدا غضب جزء على الأقل من الفئران وتغيير سلوكهم إلى حد كبير. لذلك، لدينا تحليل الحالي للجلسة الثالثة تلقائيا بالكشف عن النهج ولكن يتطلب تصنيف اليدوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل منح التمويل من مجلس البحوث الصحية كومنولث فرجينيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plexiglas cage Norva Plastics, Norfolk, VA custom made Dimensions and layout described in manuscript,
can be adjusted according to needs.
Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups Kitchen plus 315 Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera SONY HDR-PJ790 Can be replaced by any camera with
Comparable specifications
OpenCV (Image processing library) Willow Garage N/A Any modern image processing library
can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brodkin, E. S. BALB/c mice: Low sociability and other phenotypes that may be relevant to autism. Behavioural Brain Research. 176, 53-65 (2007).
  2. Deutsch, S. I., Burket, J. A., Urbano, M. R., Herndon, A. L., Winebarger, E. E. Impaired sociability of the BALB/c mouse, an animal model of autism spectrum disorders, is attenuated by NMDA receptor agonist interventions: clinical implications. Comprehensive Book on Autism Spectrum Disorders. Mohammadi, M. A. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-book-on-autism-spectrum-disorders/impaired-sociability-of-the-balb-c-mouse-an-animal-model-of-autism-spectrum-disorders-is-attenuated 323-342 (2011).
  3. Dunn, M. E., Burbine, T., Bowers, C. A., Tantleff-Dunn, S. Moderators of stress in parents of children with autism. Community Mental Health Journal. 37, 39-52 (2001).
  4. Babineau, B. A., Yang, M., Berman, R. F., Crawley, J. N. Low home cage social behaviors in BTBR T+tf/J mice during juvenile development. Physiology & Behavior. 114-115, 49-54 (2013).
  5. Benson, A. D., Burket, J. A., Deutsch, S. I. BALB/c mice treated with d-cycloserine arouse increased social interest in conspecifics. Brain Research Bulletin. 99, 95-99 (2013).
  6. Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. Rapamycin improves sociability in the BTBR T(+)Itpr3(tf)/J mouse model of autism spectrum disorders. Brain Research Bulletin. 100, 70-75 (2014).
  7. Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. D-Cycloserine improves sociability in the BTBR T+ Itpr3tf/J mouse model of autism spectrum disorders with altered Ras/Raf/ERK1/2 signaling. Brain Research Bulletin. 96, 62-70 (2013).
  8. Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. Locomotor activity of the genetically inbred BALB/c mouse strain is suppressed by a socially salient stimulus. Brain Research Bulletin. 83, 255-256 (2010).
  9. Deutsch, S. I., et al. D-cycloserine improves sociability and spontaneous typic behaviors in 4-week old mice. Brain Research. 1439, 96-107 (2012).
  10. Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. Genetically inbred BALB/c mice differ from outbred Swiss Webster mice on discrete measures of sociability: relevance to a genetic mouse model of autism spectrum disorders. Autism Research. 4, 393-400 (2011).
  11. Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Cannon, W. R., Deutsch, S. I. D-serine improves dimensions of the sociability deficit of the genetically-inbred BALB/c mouse strain. Brain Research Bulletin. 84, 12-16 (2011).
  12. Deutsch, S. I., Burket, J. A., Jacome, L. F., Cannon, W. R., Herndon, A. L. D-Cycloserine improves the impaired sociability of the BALB/c mouse. Brain Research Bulletin. 84, 8-11 (2011).
  13. Shih, F. Y. Image Processing and Mathematical Morphology: Fundamentals and Applications. , CRC Press. (2009).
  14. Nixon, M. Feature Extraction & Image Processing. , Academic Press. (2008).
  15. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , Eighth Edition, The National Academic Press. (2011).

Tags

السلوك، العدد 111، الفأر، مؤانسة، ASD، الآلي، البرمجيات، والإنتاجية العالية، وفحص
تقييم التجريبية من الفأر المؤانسة باستخدام الآلي صورة نهج المعالجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Varghese, F., Burket, J. A., Benson, More

Varghese, F., Burket, J. A., Benson, A. D., Deutsch, S. I., Zemlin, C. W. Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach. J. Vis. Exp. (111), e52508, doi:10.3791/52508 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter