使用自动图像处理方法鼠标社交性的实验评估

Summary

本协议描述的量化鼠标社交性的方法。因为它们移动和在一个特殊的笼相互作用小鼠录像。电影处理允许社交性具有优良的准确性和可靠性的自动化定量。

Abstract

鼠标是检验药物设计，增加社交性的首选模式生物。我们提出量化小鼠社交性其中试验小鼠被放置在一个标准化的装置和相关的行为在三个不同的会话评估（称为会话I，II和III）的方法。

该装置具有三个隔室（参见图1），左和右室含有一个倒置的杯，可容纳一个鼠标（称为“刺激小鼠”）。

在会话我，测试小鼠被放置在笼和其移动性的特征在于舱室之间进行转换的数量。第二场会议，刺激老鼠置于倒杯之一的，测试鼠标的社交性是由一次花费近包含封闭刺激鼠标与空倒杯杯的数额量化。在会话III，倒杯卸下了 ð两个小鼠自由互动。在会议III测试鼠标的社交性是由它使向着刺激老鼠的社会方式的数量和次数它避免受了刺激鼠标一个社会的办法量化。

影片的自动评估检测测试鼠标，它允许会话I和II的所有描述社交性措施的决心鼻子（会话III，方法被自动识别，但手动分类）。找到鼻，一个空的保持器的图像被数字从影片的每一帧中减去，所得的图像进行二值化，以识别鼠标像素。小鼠尾部被自动删除，剩余的小鼠的两个最远点被确定;这些都是接近机头和机尾的基地。通过分析鼠标的移动和使用的连续性参数，鼻子识别。

“图1”的src =“/文件/ ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg”/>
图1.社交性的评估期间3届 会议我 （上）：测试鼠标的驯化笼子第二节 （中）：当鼠标刺激被封闭在一个倒杯测试鼠标在笼子里自由移动的第三场 （下图）：两种测试鼠标和鼠标刺激允许自由移动和互动与对方。

Introduction

受损社交性是在一系列神经发育障碍，包括孤独症谱系障碍（自闭症^）1,2的主要症状域之一。这严重限制了患者的发展关系的能力，并极大地影响了病人，家属和护理人员^2,3。

在为了更好地理解受损社交性背后的机理和开发治疗，几种小鼠模型进行了研究^1,4-9。一个这样的菌株是BALB / c小鼠，表现出显着低社交性，类似于患者ASD5 ^8-12可见特征的近交系。例如，BALB / c小鼠显示社会的方法和通过刺激老鼠（ 例如，社交回避）超过瑞士韦伯斯特比较¹⁰株对社会的办法通常是一个否定的答复较低的频率。

为了测试提出的治疗是否有效实现了在增加社交E，需要客观的措施。一种广泛接受的框架是分析在具有三个隔室的标准化装置社交性（ 见图1）。

左，右室都包含一个倒线杯里面有一个突出的社会刺激鼠标。测试小鼠被释放到装置的10分钟三个区间（会话Ⅰ-Ⅲ）;会话我评估测试小鼠的运动活性，而会话II和III评估测试小鼠的社交性的不同方面。

在会话我，测试鼠标使其适应该装置。在此会话，测量该测试鼠标使得不同区室之间的转变的数目。重要的是，在标准的三隔室装置得到社交性措施取决于运动活性，并降低了运动活性可混淆的SOCI解释能力数据。

第二场会议，测试鼠标自由移动，并刺激鼠标倒置一只杯子之下（平衡）。刺激小鼠4周龄远系繁殖雄性ICR小鼠，年龄和性别相匹配的测试小鼠。刺激小鼠被封闭在指定为社会隔室侧的倒置的杯，和一个空的倒置的杯被放置在指定为非社会隔室的一侧。第二场会议，测试鼠标的社交性是通过比较其花费附近的“社会”倒杯（小于2厘米的距离） 与它花费附近的“非社会”倒杯时的时间量化，并通过时间它花费在社交车厢与它在非社会隔间花费的时间。瑞士韦伯斯特比较小鼠花费显著更多的时间在社会隔室和邻近相比BALB / c小鼠，显示没有显著偏爱社会社会倒杯倒杯或社会舱^12。

在会话III，测试和刺激小鼠被允许自由互动（倒杯被删除）。车厢之间的社交性措施，刻板行为和过渡的测试和刺激小鼠和分析之间的自由互动的第三10分钟会话中获得可靠。在这份报告中，测试鼠标的社交性通过两个措施量化：1）它使向着刺激鼠标，在一个社会的方式被定义为向着刺激鼠标前进（鼻第一）的社交方式号码，这样的鼻子是从刺激小鼠小于2厘米的距离; 2）由刺激小鼠社会方法忌的数量。测试鼠标被认为是避免方法，如果事实证明或刺激鼠标移开，或者如果它的刺激后鼠标会暂时停止移动（“冻结行为”），已接近测试鼠标。 BALB /c小鼠显示在朝向刺激小鼠和增加的由刺激小鼠社会办法否定答复的号码进行社会的方法数量的减少，相比于瑞士韦伯斯特比较应变^10。

行为电影的评价历来手工完成， 即通过（可能以较低的速度），仔细观看电影和激活秒表的鼠标在某车厢或接近倒杯¹⁰的一个花费的时间。这种方法需要重复的电影的观看，因此是非常耗时。另外，精度由评价者的反应时间为秒表测量和能力的限制来感知鼠标是否为2cm倒杯内。在最近的工作中，两种化合物（D-丝氨酸和D-环丝氨酸）已被证明有效，在BALB / c小鼠^9,10,12恢复社交性。已知的是两种成分MODU迟NMDA受体，这是众所周知的社会行为^2,12发挥中心作用。化合物的大阵列已知调节在各种良好定义的方式NMDA受体活性，而对于在ASD治疗的突破的潜力，使这些化合物优先将评价高度期望快速自动方法的加速评估。

下面描述的是用于小鼠社交性的评估开发了一种自动分析过程。它使用鼠标电影的所有帧的图像处理方法来确定鼠标或小鼠的位置。在会话I和II，它进一步检测鼻子的位置，并使用它来计算社交性的措施。在会议第三，它会自动检测所有的方法，但需要人工分类（社会的方式，社交回避，或其他）。

Protocol

为便于说明的协议已被划分成两部分：1）实验步骤和2）的自动分析。所有的动物都根据指南实验动物¹⁵的护理和使用治疗，所有手续由机构动物护理和使用委员会批准。

1.实验步骤

1. 设置保持架，这是一个黑色的无反射有机玻璃矩形箱（52×25×23 ^毫升 ）分成三个室：社会，非社会，和中性中间隔间（ 图1）。放置在会议期间在各端隔室的倒置丝杯I和II（下文讨论）和会话第二期间容纳所述刺激小鼠。
2. 设置摄像机，所述笼填充的视场的方式。由于照明可以用鼠标行为干预，维持在笼子里面不超过3.5勒克斯的照度，从间接光从未来白炽灯泡和在向上方向上的笼底测量。也使用红外光源，小鼠无法感知但相机可检测。记录所有电影720×480标清。
3. 录制后图像处理的空笼（称为“参照系”）的一帧，并保存为灰度图像。
4. 第一节：介绍测试鼠标放到笼子里和波拱手笼，表明会话的开始（比较自动分析）。影片记录了10分钟。在10分钟结束时，把鼠标放回原来的笼子里。
5. 议题二：把鼠标刺激倒杯之一的（平衡）。
6. 使用“社会左”或“社会权利”按钮，选择刺激的鼠标是否是在左侧还是在右侧的倒杯的倒杯。
   注：与刺激鼠标倒杯被称为“社会的杯具”，而其他杯“非社会茶杯”。其中社会杯位于被称为社会隔室的隔室，与非社会杯隔室是非社会隔室，中间室是“中性隔室”。
7. 引进试验老鼠入笼。波拱手笼指示会话的开始。影片记录了10分钟。重要的是，保持社交性设备移除老鼠倒杯开始第三场之前。
8. 议题三：删除倒杯，松开小鼠和允许测试和刺激老鼠相互自由交互。波拱手笼指示会话的开始。影片记录了10分钟。在10分钟结束时，把老鼠都回到各自的笼子里。

2.自动分析

注：在第2的命令经由图形用户界面发出（参见图2），该CONtrols我们的软件。在这里我们讲解一步一步的处理，我们的软件允许;该软件还能够在无用户输入执行批处理模式的分析。

1. 对于每部电影，请执行以下处理步骤：
   1. 负载电影（点击Load按钮）。
   2. 选择笼构成，它告诉分析程序笼边界，隔室的边界，和杯位置的位置。选择四个保存的配置中的一种或手动调整所有坐标。
      注：配置通常不改变从一个实验到下一个，因此可以重复使用。
   3. 为电影的每一帧，执行以下的处理步骤（2.1.3.1-2.1.3.6）。
      1. 转换帧通过点击“灰度”按钮灰度。
      2. 通过点击“减去”按钮，数字减去灰度参考框架（见步骤1.3）。注意：该步骤的目的是使像素VA框架非常接近的梅毒到处为零，除了鼠标的位置。
      3. 通过设置低于某个阈值电平为黑色的所有像素二值化的帧，高于该水平的白色所有像素（点击“二值化”按钮）。
         注意：我们的想法是，由于鼠标象素通常具有较高的值比剩余像素，鼠标像素将变成白色，所有其他像素黑色。最佳阈值电平取决于照明条件，并且可以通过在整个电影评估鼠标形状来确定。如果选择阈值太低，则鼠标出现过大，以及不属于鼠标像素可被着色为白色。如果阈值太高，鼠标变小，并且可以分裂成断开件。在记录的电影，最佳阈值总是20和35之间（从0到255的范围）。
      4. 侵蚀¹³二进制图像e时代，那么¹³扩张2E次，然后ERO德再次e时代，按下按钮“EROD /语”。
         注意：目的此过程是删除尾部。对于已使用的分辨率（720×480），E = 3在所有情况下工作。
         注：该软件的手在画面中存在自动检查（动画的录制过程中，手都通过图片摆手示意会话的开始）。如果手存在，就会有在二值化的帧异常许多白色像素，因为手是比鼠标大得多。一只手的存在的条件是，有在二值化的帧超过10000白色像素。该软件I，II和III，通过检测其手部动作发生的帧的范围确定会议的开端。
2. 在会话I和II，继续如下：
   1. 检测组白色像素的最大连接组件（点击“LCOMP”）。注：目的ØF该步骤是为了消除该不属于鼠标， 例如 ，引起刺激小鼠的会话第二运动白色像素。最大的连接组件是在几乎所有帧的鼠标。
   2. 通过点击“查找完”确定了两个最遥远的白色像素（称为鼠标的“目的”）。
      注意：软件建立的两端， 即的连续性，对于每个在第一帧的端部到在它们所属的后续帧的端部。总的想法是，由于帧以高速率记录中，端部可以不远处一帧行进到下一个，使得用于从一帧到下一的端部的正确延续是该距离的总和最小化两端移动。见讨论更多细节。
   3. 确定哪些鼠标到底是鼻子。
      1. 确定的方向，其中通过观察一个移动鼠标如何重心（COG）从帧变为帧（焦炉煤气的动议是所有小鼠像素的总和的运动）。
         注意：一组象素P ₁的COG，...，坐标P _{N×1，...，×n个}被定义为：
         
         鼠标通常向前（ 即往自己的鼻子）。在几百帧的部分，总是有很高可信度的头部/尾部的检测。
         注意：软件自动确定作为所检测到结束鼠标移动;为此被识别为鼻和标有在电影的红色圆圈。当检测到的鼻子被标记在每一个帧中的红色圆圈，用户可以检查该检测的质量。
3. 在会议第三，继续如下：
   1. 检测两个最大的白色像素组件。
      1. 如果两者都为上午可接受大小的乌斯和其重心（COGS）是与前一帧的鼠标COGS，考虑这两个部件的两只小鼠兼容。
      2. 考虑鼠标尺寸上可接受的，如果他们不超过20％，因为前一帧改变，并且考虑连续两帧为兼容的嵌齿，如果它们的差值不大于鼠标可以在帧之间的时间移动的距离越大（在此距离如下从最大鼠标速度，这可以通过分析多个单独的小鼠的运动被确定为一个实验系列的制剂的一部分（如在会话I和II）。
         注意：如果最大的两个组成部分是一个鼠标不能接受尺寸或嵌齿是从那些在先前帧过于不同，直到最大的两个组成部分是可接受的大小的软件自动增加二值化阈值，并且它们的齿轮与兼容那些先前帧。
   2. 点击测试鼠标第一帧。在使用2.3.1分析会议III的每一帧识别测试和刺激鼠标。
   3. 确定会议III，其中一个鼠标社会接近其他的帧。注意：软件实现此步骤通过自动检查的小鼠之间的距离小于小鼠的典型相互作用距离（我们使用2个厘米）。
   4. 当软件播放影片与所检测的方式向用户的一个短段，点击一个按钮，以指示该方法是否符合由测​​试小鼠，社交回避由测试鼠标，或既不是社会的方法。
      注意：步骤2.3.4能，如果它是已知的鼠标是测试鼠标自动化。由于当小鼠太靠近彼此此信息丢失（或爬在彼此的顶部），而不是因为我们还没有发现一种方法来标记的小鼠中，可以可靠地通过我们的软件进行检测并执行的方式不会影响他们的行为，我们已经恢复了人工分类现在。
4. 要使用Load按钮评估处理电影，电影负荷。
   1. 点击开始会话1显示会话1的第一帧（或开始第二节，显示会话2的第一帧）。
   2. 点击播放/停止播放和停止影片。
      注：处理影片将显示鼠标的头部和尾部标有不同颜色的圆圈。显示在屏幕上的所有社交措施和更新的影片播放。
   3. 通过点击“导出”导出社交性Excel格式的数据。
   4. 点击“编译数据”编译文件夹中的所有影片中所有的数据到一个单一的Excel文件。

Representative Results

图3示出一个行为电影的与空笼一个彩色帧。鼠标还没有被引入笼子里呢。的杯子，（社会和非社会）以及隔室边界的位置重叠。 如图4和用作基准帧的空笼的彩色帧被转换为8位灰度。基准帧被从捕获的电影的每隔一帧中减去。

图5显示从电影会话我在帧中的一个，再次叠加隔间边界和杯子的位置。参照帧是从样本帧，其结果，所谓的差分帧中减去，示于图6。

图7是差分帧的二进制化版本。 （见2.1.3.3）。该图还示出了鼻（红圈）的位置和所述TA的基金正日（灰色圆圈），如第2.2.4节确定）。

一旦鼻部位置建立为电影的每一帧，鼠标的轨迹可以以任何期望的方式进行分析。 图8显示了小鼠鼻为电影的一部分，覆盖大约1000帧的位置（白色圆圈） （〜30秒）。

图9示出了用于会话I.一个社交性分析笼室之间的转变的数目被用作运动活性的量度的结果（在所示的例子中，在10分钟内59转换表示正常运动活性）。在笼子里的不同部分所花费的时间作为基准来判断偏爱在第二届社会舱/杯。

图10示出了用于会话二社交性分析的结果。特别感兴趣的是邻近的社会与非社会杯花（在所示的EXA时代mple 230.8 VS 72.3秒）和社会对中性和非社会车厢（314.7 主场迎战 主场迎战 109.4 185.5秒）。朝向社会杯隔室中的明确偏压是典型的对照小鼠，并与来自会话我（ 图9）的数据比较清楚地表明，偏压确实是一种刺激老鼠的存在的结果。

图11示出了用于会话三社交性分析的结果。高数的社会途径（35，10分钟），以及通过刺激老鼠（9/10）社会办法非常积极的反应是典型的与正常小鼠社交性的。

图2.图形用户界面。 请Ç舔此处查看该图的放大版本。

图3.空笼，这被用作参考帧转换后灰度。红色圆圈显示在另一侧的社会杯和非社会杯的位置。垂直白线划分笼成不同的隔室和所述矩形显示保持器的内边界。

图4 图3的灰度版本。

图5.原始帧中灰度格式的视频画面。社交圆筒由一个白圈标记，和具有半径大于社会气缸的大2厘米额外灰色圆圈绘制标定其中试验鼠被认为“接近”的社会气缸的区域。在对面的角落中，非社会圆筒用灰色圆圈，并再次，用2厘米的半径画划定被认为接近非社会缸面积额外的圆圈标记。垂直白线划分笼成不同的隔室和所述矩形显示保持器的内边界。

图6.差分图象 。图像减去从样品架参考帧获得。

图7.二值图像。在迪像素超过（在本实施例30）的特定阈fference图像被认为是小鼠像素和显示白色。红色圆圈表示的鼻子和白色圆圈是尾。

图8.鼠标轨迹，白色的小圆圈显示我直到这架被抓获的鼻子从会议开始时的位置。

会话一社交性分析图9.结果上述各笼室中的数字表示次鼠标在他们花费（在这种情况下，254.3秒在左隔室，在中性隔间155.2秒，并在正确的237.0秒车厢）。圆圈内的数字表示该次鼠标花费接近RESpective杯（“亲密”是指小于2厘米的地方，或者两个圆的外内）：140.0秒接近左杯和105.6秒靠近右杯。在底部中央的数字表示鼠标笼的不同区室（在实施例59次）之间的频率转换。

图10.第二场社交性分析结果。上面的隔间和内部的圆表示在笼的不同部分所用的时间， 如图9 /会话一注的数字，在会话第二，存在一个刺激小鼠倒置杯（在左边的一个在这种情况下），所以这杯变为“社会”杯。除了会话我的措施后，测试时间鼠标才能到达接近社会气缸（在2厘米）首次给出在该中心的右下方。 请点击此处查看该图的放大版本。

图11.第三场社交性分析的结果。“办法”后，一些国家由测试鼠标做社会的临近，“波什后数数。 RESP“和”负值。 RESP“状态的被测试鼠标由刺激小鼠社会办法肯定和否定响应次数。

Discussion

通过结合偷拍小鼠和自动电影的分析，我们已经创建了一个经济实惠，可靠的高通量筛选技术。

自动分析的准确度为100多部电影手工分析的结果进行比较。在帧的绝大多数帧（> 99％），鼠标的鼻部被识别以良好的精度。大部分的（少数）误检测的对社交性措施没有效果，因此，电影的80％左右，不需要任何校正。

在那些确实包含错误检测，是迄今为止最常见的问题是，头部和尾部都搞不清楚，所以我们在软件已经包括一种简单的方法来切换的头部和尾部的电影片段的电影。即使电影观看，检查并纠正一切错误检测，这个检查可在约3倍的实时速度完成，因此，评估时间仍然很短。电影的部分在该小鼠不靠近气缸中的一个可在更高的速度进行查看。

全部自动和手动确定社交措施之间的协议是优秀的（假设可能错误检测已被纠正）。事实上，自动确定社交性措施的质量优于人工确定的人，因为客观标准一致地用于确定距离和时间，同时人工评估从人类感知和反应时间的限制缺点。这些限制变得具有更高的观看的速度，这是希望限制评估时间更加严重。

关于步骤2.2.2注：这一程序由使用标准的图像处理工具¹⁴降低了组白色像素的其边界和计算任何两个边界象素之间的距离来实现。发现最远处点是有用的，因为鼻子和尾部的基往往是非常接近这两个目的。

为了完整起见，端部的连续性（步骤2.3.4）的执行进行说明。在与端部c和d，并与端部A和B的前一帧给定的帧，是否Ç属于a和d到b或c属于B和D向（ 见图12）。

图12.连续性测定。小鼠在浅灰色的颜色与鼻子和尾部标记为a和b分别是初始位置。小鼠在白色的鼻尾标记c和d分别是小鼠的在下一帧中的位置。

总的想法是，对于正确的延续，通过端部行进的距离的总和大于为不正确的延续更小，因为鼠标行进小于其自身的长度从一帧到下一帧。在实施例（ 图2 _δ1 = | C - 一个 _|，δ2 = | D - B _|，Δ1 = | C - B |和_Δ2 = | D - 一个 |，并说，因为_δ1 +δ _{2 <Δ1 +Δ2，}正确的延续，是A→C和b→D的。对于这样的确定的置信度良好量度是比r = 最大 _{（δ1 +δ2，Δ1 +Δ2）/} 分钟 _{（δ1 +δ2，Δ1 +Δ2），}其中描述了如何更两端将前往一个待续N对其他。根据定义，r是大于或等于1。对于细长鼠标形状，r是通常大于10，只有当鼠 ​​标形状变得更圆（ 例如，因为鼠标是站在其后腿）中，r可以得到接近一个和延续，是不可靠的。为可靠延续，R> 2.5的阈值已被使用。与此阈值，在其上建立的端部的连续性的帧的部分，通常为数百至数千帧。对于每一个部分，确定朝向结束鼠标是一款内移动。一旦在一个部分的连续性被建立，“重心”（COG，所有小鼠像素的平均坐标）在部分中的每个帧被确定。在COG从一帧到下一帧的差定义了​​两帧之间的鼠标的速度。这个速度被投影在该两端连接，以查看是否和鼠标多少移动丝束的矢量ARDS第一或朝向第二端。总运动（其或者朝向第一或第二端）是所有帧的运动的总和。

本协议可以以多种方式来解决不同的实验需要进行修改。如果鼠标的运动（ 例如 ，平均速度）的不同方面的兴趣，这些都可以从所计算的鼠标的轨迹中提取。如果光照条件不同于这里描述非常不同，在二值化步骤中产生的鼠标像素阈值可以被调整。即使是像一个笼子里不同形状的变化可以通过修改我们目前笼配置程序来实现。

所描述的软件偶尔混淆头尾（在电影的不到20％，有必要进行校正，因为头部/尾部翻转会影响我们的评估）。我们写了一个方便的工具，它允许用户识别所述第一和第其中头部和尾部需要被翻转，然后点击执行该修正的时间间隔电子最后一帧。极少数的电影（百分之几）具有比头/尾翻转其他的问题，对于这​​些问题，我们提出一个更一般的矫正工具，其允许用户指定在其中轿厢的一部分的试验鼠鼻是任何间隔期间。需要注意的是，需要校正时所以很少上评估时间的影响小。

该协议的计划扩展也检测到更多的社会有关的行为，如追求和肛门生殖器（分别可以通过从测试鼠标的鼻子身体和刺激老鼠的肛门监控的距离来检测）嗅探。刻板行为也可以是可检测的，例如饲养，这可以从在小鼠形状的变化来检测。另一个有趣的扩展是使用不同颜色的小鼠，应只要直接了当测试一个的颜色ð刺激小鼠有笼壁和笼地板的颜色对比度好。

总之，所描述的协议具有一个实验性和图像处理部。在实验的一部分，最重要的步骤是检查灯光和笼子的位置，然后在三次会议记录鼠标行为（我：一个人在笼子里，II：用密闭刺激鼠标，III：自由与刺激的互动老鼠）。在分析部分中，关键的步骤是加载电影和笼构造，每个影片帧执行图像处理以确定鼻子和尾部的位置，然后计算所必需的数据进行量化从鼻子和尾部轨迹社交性。

所描述的方法的局限性在于它仅被用于白毛老鼠进行测试。按理说，该自动分析将与其他毛皮颜色，只要设备的墙壁和地板提供同样出色的工作与毛发颜色对比强烈，但尚未确定。

另一个限制是缺乏会话III的评价自动化。对我们来说，最大的困难，对于其他群体，是跟踪，其中鼠标在鼠标的频繁亲密接触测试鼠标和刺激鼠标。我们已经发现，我们可以解决这个问题，标记，如老鼠的耳朵之间的彩色圆点，但所有我们已经尝试过的标记方法迄今小鼠激怒至少一部分并实质性改变他​​们的行为。因此，我们当前的会话III的分析，自动检测所有的方法，但需要手动分类。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.