Summary
Bu protokol Fare sosyallik ölçmek için bir yöntemi anlatmaktadır. onlar hareket ve özel kafese etkileşim olarak fareler videoya. Film işleme mükemmel doğruluk ve güvenilirlik sosyallik otomatik ölçümü için izin verir.
Abstract
Fare sosyallik artırmak için tasarlanmış ilaçların test etmek için tercih edilen bir model organizmadır. Biz Test fare standart aparat yerleştirilir ve ilgili davranışlar üç farklı oturumlarda (denilen oturum I, II, III ve) değerlendirildiği fare sosyallik ölçmek için bir yöntem mevcut.
Cihaz üç bölmeleri (Şekil 1) sahiptir, sol ve sağ bölmeleri ( "uyaran fare" olarak adlandırılır) bir fare evi olabilir ters fincan içerir.
Oturum, test, fare kafesine yerleştirilir ve hareket bölmeleri arasında yapılan geçişlerin sayısı ile karakterize edilir. Oturumda II, bir uyarıcı fare ters bardak birinin altında yerleştirilir ve test fare sosyallik boş ters fincan vs kapalı uyaran fare içeren fincan yakın harcadığı zamanın miktarı ile ölçülür. oturumda III, ters bardak kaldırılır bir d Her iki fareler serbestçe etkileşimde. oturumda III test fare sosyallik o uyaran fare doğru yapan sosyal yaklaşımların sayısına göre ve teşvik fare ile bir sosyal yaklaşım önler kez sayısına göre belirlenir.
Filmin otomatik değerlendirme oturumu I ve II tüm açıklanan sosyallik önlemlerinin belirlenmesini sağlar test fare, burun algılar (oturumunda III, yaklaşımlar otomatik olarak tanımlanır ama elle sınıflandırılır). burnu bulmak için, boş bir kafes görüntüsü dijital film her çerçeve çıkarılır ve elde edilen görüntü fare pikselleri tespit çiftlendirildi edilir. fare kuyruğu otomatik olarak kaldırılır ve kalan farenin iki en uzak noktaları belirlenir; Bu burun ve kuyruk tabanına yakın. fare hareketi analiz ve süreklilik argümanlar kullanarak, burun tanımlanır.
"Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
3 seans sırasında Sosyallik Şekil 1. Değerlendirme Oturum (üst):.. Kafesine Test fare Acclimation Oturum II (orta):. Uyaran fare ters fincan içine ise test fare kafes içinde serbestçe hareket Oturum III (alt): Test fare ve uyarıcı fare Hem birbirleri ile serbestçe hareket ve etkileşim için izin verilir.
Introduction
Bozulmuş sosyallik otizm spektrum bozukluğu (ASD'ler) 1,2 dahil olmak üzere nöro bozuklukları, bir dizi ana semptomu etki biridir. Bu ciddi ilişkileri geliştirmek için hastaların yeteneğini sınırlar ve büyük ölçüde hastaları, aileleri ve bakıcıları 2,3 etkiler.
Daha iyi tedaviler engelli sosyallik altında yatan mekanizma anlamak ve geliştirmek için bir çaba, birkaç fare modelleri 1,4-9 çalışılmıştır. Böyle bir suş BALB / c fare, ASD5 8-12 hastalarda görülen özellikler andıran çarpıcı düşük sosyallik sergileyen bir kendilenmiş türdür. Örneğin, BALB / c fare sosyal yaklaşımlar ve İsviçre Webster karşılaştırma suşu 10 daha uyaran fare (örneğin, sosyal kaçınma) tarafından sosyal yaklaşımlara bir çoğunlukla olumsuz yanıt düşük bir frekansı gösterir.
önerilen tedavi effectiv olup olmadığını test etmeksosyallik artan e nesnel ölçütler ihtiyaç vardır. Yaygın olarak kabul görmüş bir çerçeve, üç bölmeye sahip standart bir cihaz içinde sosyallik analiz etmek (bakınız Şekil 1).
sol ve sağ bölmeler her bir sosyal belirgin uyarıcı fare barındıran bir ters tel fincan içerir. test faresi, üç, 10 dakika aralıklarla (oturumları I-III) aygıt içine salınır; oturumları II ve III testi farenin sosyallik farklı yönlerini değerlendirmek ederken oturumu I test fare lokomotor aktivitesini değerlendirir.
Oturum, test, fare cihazının gelmesini bırakılır. Bu oturumda, test fare farklı bölmeleri arasında kılan geçişler sayısı ölçülür. Önemlisi, sosyallik önlemleri standart üç bölmeli tertibatında lokomotor aktivite bağımlı elde edilen ve azaltılmış lokomotor aktivite sosyo yanlış yorumlanmasına neden olabiliryeteneği veri.
oturumda II, test fare serbestçe hareket ediyor ve bir uyarıcı fare ters bardak birinin altında yerleştirilir (denge). uyaran fareler 4 haftalık outbred erkek ICR fareleri yaş ve cinsiyet uyumlu testi farelere vardır. uyaran fare sosyal bölmesi olarak belirlenen yan ters fincan içine alınır ve boş bir ters fincan nonsocial bölmesi olarak belirlenen tarafına yerleştirilir. Oturumda II, test fare sosyallik o (en az 2 cm uzakta) o "nonsocial" ters fincan yakın geçirdiği zaman karşı "sosyal" ters fincan yakın geçirdiği zamanı karşılaştırılması ile ölçülebilir ve zamana göre bir o nonsocial bölmesinde geçirdiği süre vs sosyal bölmeye geçirir. İsviçre Webster karşılaştırma farenin sosyal bölmesine ve sosyal için önemli bir tercih gösteren, BALB / c farelerine göre sosyal ters fincan yakınındaki önemli ölçüde daha fazla vakitters fincan ya da sosyal bölme 12.
oturumda III, test ve uyarıcı fareler (ters bardak kaldırılır) serbestçe etkileşime izin verilir. bölmeleri arasında sosyallik ölçüleri, stereotipik davranışlar ve geçişler güvenilir test ve uyarıcı fare ve analiz arasındaki serbest etkileşimin üçüncü 10 dakika oturumunda elde edilir. Bu raporda, test farenin sosyallik iki tedbirlerle ölçülür: Bir sosyal yaklaşım uyaran fare doğru (burun önce) ileriye doğru hareket olarak tanımlanan uyarıcı fare, doğru yapar, sosyal yaklaşımların 1) sayısı, böylece burun az 2 cm uzakta uyaran fare olduğu; 2) uyaran fare sosyal yaklaşımlar uzaklaşma sayısı. o açar veya uyarıcı fare uzaklaştığı ya da geçici olarak uyaran fare sonra ( "davranışı donma") hareket durursa Test fare yaklaşmıştır sınama fare yaklaşımını kaçınarak olarak kabul edilir. BALB /c fareleri, İsviçre Webster kıyaslama soyu 10 göre uyaran fare ve uyaran fare sosyal yaklaşımlar negatif tepkilerin sayısının artmasına doğru yapılan sosyal yaklaşımlar sayısında bir azalma göstermektedir.
Davranışsal filmlerin değerlendirilmesi, geleneksel olarak (muhtemelen düşük hızda) dikkatli film izlerken ve fare belli bir bölmede veya ters bardak 10 birinin yakınında geçirdiği süre stopwatches aktive ederek, yani elle yapılmıştır. Bu yöntem, bu nedenle, sürekli film izlerken gerektirir ve çok zaman alır. Ayrıca, doğruluk fare ters fincan 2 cm olup olmadığını algılamaya kronometre ölçümleri ve yeteneği değerlendirici en reaksiyon süresi ile sınırlıdır. Son çalışma, iki bileşiğin, (D-serin D-sikloserinin), BALB / c farelerinde 9,10,12 sosyallik düzeltmede etkili olduğu kanıtlanmıştır. Her iki bileşeni modu bilinmektedirGeç bilinen NMDA reseptörü, sosyal davranış 2,12 merkezi bir rol oynamaktadır. Bileşiklerin büyük bir dizi iyi-tanımlanmış çeşitli şekillerde NMDA reseptör aktivitesini modüle etmek için bilinen ve ASD tedavisinde önemli bir hamle potansiyeli, bu bileşiklerin bir öncelik ve son derece arzu edilen bir değerlendirme için hızlı bir otomatik yöntem hızlandırılmış bir değerlendirme yapar.
Aşağıda tarif edilen fare sosyallik değerlendirilmesi için geliştirilmiş bir otomatik analiz işlemdir. Bu fare veya farelerin konumunu belirlemek için fare filmlerin tüm kareleri görüntü işleme yöntemlerini kullanır. I ve II oturumlarında, daha fazla burun konumunu algılar ve sosyallik önlemleri hesaplamak için kullanır. oturumda III, otomatik olarak tüm yaklaşımları algılar, ancak manuel sınıflandırma (sosyal yaklaşım, sosyal kaçınma, ya da diğer) gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) Deney prosedürü ve 2) Otomatik analiz: açıklama kolaylığı için protokol 2 bölüme ayrılmıştır. Bütün hayvanlar Laboratuar Hayvanlarının 15 Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre tedavi edildi ve tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1. Deneysel Prosedür
- Nonsocial sosyal ve nötr orta bölmesi (Şekil 1): siyah yansıtıcı olmayan pleksiglas dikdörtgen kutu üç bölmeye ayrılmıştır (52 x 25 x 23 cm 3) 'dir kafesi, ayarlayın. oturumları sırasında uç bölümlerinde her ters tel bardak yerleştirin I ve (aşağıda açıklanmıştır) II ve seans II sırasında uyaran fare ev.
- Kafes görüş alanını doldurur şekilde kamerayı ayarlayın. aydınlatma fare davranışı ile karışabilir olduğundan, dolaylı ışık gelen kafes içinde en fazla 3.5 lux bir parlaklık korumakBir akkor ampul ve yukarıya doğru kafesin ölçülmüştür. Ayrıca anlamda değil ancak kamera tespit edebilir fareler bir kızılötesi ışık kaynağı kullanın. 720 x 480 standart tanımlı tüm film kaydetmek.
- ( "Referans çerçevesi" olarak adlandırılır), daha sonra görüntü işleme için boş bir kafes tek bir kare kaydetmek ve gri tonlu görüntü olarak kaydedin.
- I. Oturum: kafesin içine Test fare tanıtmak ve oturumun başlangıç (Otomatik Analizi karşılaştırın) gösteren, kafes üzerinde el sallamak. 10 dakika boyunca rekor filmi. 10 dakika sonunda, özgün kafesin içine geri fare koymak.
- Oturum II: ters bardak birinin altına uyaran fare koyun (denge).
- uyaran fare solda veya sağda ters fincan ters fincan olup olmadığını belirlemek için "Sosyal sol" ya da "Sosyal sağ" düğmesini kullanın.
NOT: uyaran fare ile ters fincan diğer ise "toplumsal fincan" denirfincan "nonsocial fincan". bulunduğu sosyal fincan sosyal bölme denir kompartman, nonsocial fincan bölme nonsocial bölmesi ve orta bölme "nötr bölme" dir. - kafesin içine Test fare tanıtın. kafes üzerinde dalga El oturumunun başladığını göstermek için. 10 dakika boyunca rekor filmi. Önemlisi, Oturum III başlamak için ters bardak çıkarmadan önce sosyallik aparatı fareler tutmak.
- Oturum III: ters bardak çıkarın hem fareler bırakın ve test ve uyarıcı fareler birbiriyle serbestçe etkileşim sağlar. kafes üzerinde dalga El oturumunun başladığını göstermek için. 10 dakika boyunca rekor filmi. 10 dakika sonunda, tekrar kendi kafeslerine iki fareler koydu.
2. Otomatik Analizi
Not: Bölüm 2 komutları bir grafik kullanıcı arabirimi üzerinden verilen o con (bakınız Şekil 2)Bizim yazılım Trols. Burada bizim yazılım izin verir adım adım işleme açıklamak; Yazılım, aynı zamanda, kullanıcı girişi kesikli modda analiz gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.
- her film için aşağıdaki işlem adımlarını yürütün:
- Yük film (Yük düğmesini tıklatın).
- Analiz programı kafes sınırları, bölme sınırları ve kupa yerleri konumunu söyler kafes yapılandırmasını seçin. Dört kaydedilmiş yapılandırmaların birini seçin ya da manuel tüm koordinatları ayarlayın.
NOT: Yapılandırma genellikle bir deneyden sonraki değişmez ve bu nedenle tekrar kullanılabilir. - Filmin her kare için, aşağıdaki işlem adımlarını (2.1.3.1-2.1.3.6) gerçekleştirin.
- "Grayscale" butonuna tıklayarak gri tonlamaya çerçeve dönüştürün.
- Dijital "Çıkart" düğmesini tıklayarak gri tonlama referans çerçevesi (adım 1.3) çıkarın. NOT: Bu adımın amacı piksel va yapmaktırçok yakın çerçevenin lues fare pozisyon haricinde her yerde sıfır.
- siyah belli bir eşik düzeyin altındaki tüm pikselleri ayarlayarak çerçeveyi binarize, beyaz bu seviyenin üzerindeki tüm pikseller ( "binarize" düğmesine tıklayın).
Not: Fikir fare piksel genellikle kalan pikselden daha yüksek değerlere sahip olduğundan, fare piksel beyaz ve diğer tüm pikseller siyah olacak olmasıdır. en uygun eşik seviyesi aydınlatma durumuna bağlıdır ve bir film boyunca fare şeklini değerlendirerek tespit edilebilir. eşiği çok düşük seçilirse, fare çok büyük görünür ve fare ait olmayan pikseller beyaz renkli olabilir. eşik çok yüksek ise, fare küçük olur ve bağlantısız parçalara parçalanır olabilir. Kaydedilen Film, en uygun eşik 20 ve 35 arasında (0 ile 255 arasında bir ölçekte) her zaman oldu. - Ero çiftlendirildi resim e süreleri, daha sonra, 13 2e kez dilate 13 aşındırmakde yine e kere, lütfen "EROD / Dil" iterek.
Not: Bu prosedür amacı kuyruk kaldırmaktır. kullanılan çözünürlük (x 480 720), e = 3 her koşulda çalıştı.
Not: Yazılım resimde bir elin varlığı için otomatik olarak kontrol eder (film kayıt sırasında, eller bir oturumun başladığını belirtmek için resmin içinden el salladı edilir). bir el varsa elden bir fare daha büyük olduğu için, ikilileştirilmiş çerçevede alışılmadık sayıda beyaz piksel olacak. bir el varlığı koşulu çiftlendirildi çerçevede 10.000'den fazla beyaz piksel olmasıdır. Yazılım I, II ve III, el hareketleri meydana geldiği kare aralığını tespit ederek oturumların başlangıçlar belirler.
- aşağıdaki gibi oturumlarda I ve II, devam:
- beyaz piksel kümesi büyük bağlı bileşen Algılama ( "LComp" tıklayın). Not: Amaç of Bu adım fare, örneğin oturumda II uyaran fare hareketinden kaynaklanan ait olmayan beyaz pikseller ortadan kaldırmaktır. en büyük bağlantılı bileşen neredeyse tüm kareleri faredir.
- "Ends Find" tıklayarak (fare "biter" de denir) iki en uzak beyaz pikseller belirleyin.
Not: Yazılım ilk karede uçların her biri için, yani iki uç, devamlılığını tesis ait oldukları daha sonra dilimlerinde uçlarının olduğu. Genel bir fikir çerçeveleri yüksek hızında kaydedilir beri, uçları sonraki bir çerçeveden uzak seyahat edemez ki, böylece sonraki bir çerçeveden uçların doğru sürdürülmesi için uzaklığın toplamını en aza indirir olduğunu çok uçları hareket ettirin. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakın. - burun fare hangi sonu belirleyin.
- yönünü belirlemek hangi gözlemleyerek bir fare hareket nasıl ağırlık merkezi (COG)çerçeveden değişiklikler (COG en hareket tüm fare piksellerin toplamı hareket olduğunu) çerçeveye.
Not: piksel p 1 bir dizi COG, ..., koordinatları p n, 1, .., X, N ile tanımlanır X:
Fareler genellikle (kendi burnuna doğru, yani) ileriye taşımak. birkaç yüz kare bir bölümünde, baş / kuyruk tespiti çok yüksek güven her zaman vardır.
Not: Yazılımın otomatik olarak algılanan hangi doğru fare hareket ediyor biter belirler; Bu uç burun olarak tanımlanan ve filmde kırmızı bir daire ile işaretlenir. tespit edilen burun her karede kırmızı bir daire ile işaretlenmiş, kullanıcı algılama kalitesini kontrol edebilirsiniz.
- yönünü belirlemek hangi gözlemleyerek bir fare hareket nasıl ağırlık merkezi (COG)çerçeveden değişiklikler (COG en hareket tüm fare piksellerin toplamı hareket olduğunu) çerçeveye.
- aşağıdaki gibi oturumda III, devam:
- beyaz piksel en büyük iki bileşeni algılar.
- Her iki am için kabul edilebilir boyutta iseouse ve ağırlık onların merkezleri (SMM) bir önceki kareye fare dişleri, bu iki bileşenleri iki fareler dikkate uyumludur.
- Bu mesafe izler (önceki çerçeve beri% 20'den fazla tarafından değiştirilmiş değil varsa fare kabul boyutlarını düşünün ve onların fark fare kareler arasındaki zaman içinde seyahat edebilirsiniz mesafeden daha büyük olmayan ise uyumlu olarak iki ardışık kare dişleri dikkate birkaç tek tek farelerin hareketini izleyerek bir deney serisi preparatlar bir parçası olarak belirlenmiş olan maksimum fare hızı, gelen (I ve II oturumları olduğu gibi).
Not: En büyük iki bileşenleri bir fare için kabul edilemez boyutlarda, ya da cogs önceki çerçevede olanlardan çok farklı ise, en büyük iki bileşenler kabul edilebilir boyutta kadar yazılım otomatik olarak çiftleme eşiğini yükselttiği ve SMM ile uyumludur bir önceki çerçevenin olanlar.
- test fareyi tıklayınİlk kare. oturumun III her karede testi ve uyarıcı fare hem belirlemek için 2.3.1 analiz kullanın.
- bir fare sosyal diğer yaklaşımları hangi oturumda III kareleri belirleyin. Not: Yazılım otomatik olarak fareler arasındaki mesafe farelerin tipik etkileşim mesafesinden daha az olduğunu kontrol ederek bu adımı uygulayan (biz 2 cm kullanın).
- Yazılım kullanıcıya algılanan yaklaşımı ile film kısa bir segment çalarken, bu yaklaşım testi fare ya da ne test fare, sosyal kaçınma ile bir sosyal yaklaşım olarak nitelendirir olup olmadığını belirtmek için bir düğmesini tıklatın.
Not: Test fare hangi fare biliniyorsa Adım 2.3.4 automatized edilebilir. Bu bilgiler fareler birbirlerine çok yakın olsun kaybolur (ya da birbirinin üstüne tırmanmaya) ve biz var çünkü henüz bizim yazılım tarafından güvenilir bir şekilde tespit VE yapar edilebilir bir şekilde fareler etiketlemek için bir yol bulmuş değil alır çünkü onların davranışını etkilemez, biz geri intikal etmişŞimdilik manuel sınıflandırılması.
- beyaz piksel en büyük iki bileşeni algılar.
- Yükle düğmesini kullanarak işlenmiş filmleri, yük film değerlendirmek.
- oturumun 1 ilk kareyi görüntülemek için Başlat Oturum 1 tıklayın (veya oturum 2'nin ilk kareyi görüntülemek için Oturum 2 Başlat).
- filmleri oynatmak ve durdurmak için Çal / Durdur üzerine tıklayın.
Not: İşlenmiş filmler farklı renkli çevreleri ile işaretlenmiş baş ve kuyruk ile fare gösterecektir. Tüm sosyallik önlemleri ekranda görüntülenir ve film oynar gibi güncellenir. - "Export" tıklayarak Excel formatında ihracat sosyallik verileri.
- Tek bir excel dosyası içine bir klasördeki tüm filmlerin tüm verileri derlemek için "Derleme Veri" tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3 boş bir kafes ile davranışsal filmin bir renk çerçeve gösterir. Fare henüz kafese girmiş değil. (Sosyal ve nonsocial) bardak ve bölme sınırları pozisyonu üst üste. Şekil 4'te gösterilen ve bir referans çerçevesi olarak kullanılan boş bir kafes rengi çerçevesi 8 bit gri ölçekli dönüştürülür. referans çerçevesi Çekilen filmin diğer her çerçeveden çıkarılır.
Şekil 5 bindirilmiş bölme sınırları ve kupa pozisyonları ile tekrar oturum I sırasında filmden kare birini göstermektedir. Referans çerçevesi farkı çerçeve denilen örnek çerçevesi ve sonucu çıkarılır, Şekil 6'da gösterilmiştir.
Şekil 7 fark çerçevesinin ikilileştirilmiş sürümüdür. (Bölüm 2.1.3.3 bakınız). Şekil aynı zamanda burun (kırmızı daire) konumunu ve ta tabanını gösteriril (gri daire),) bölümünde 2.2.4 belirlenen.
Burun pozisyon filmin her karesinde için kurulduktan sonra, fare yörünge Şekil 8. Istenilen şekilde analiz yaklaşık 1.000 kare kapsayan filmin bir parçası için fare burun konumlarını (beyaz daireler) gösterir edilebilir (~ 30 sn).
Şekil 9, kafes bölmeler arasındaki geçişlerin sayısını lokomotor aktivitesinin bir ölçüsü olarak kullanılır oturum I'in bir sosyallik analizin (gösterilen örnekte, 10 dakika içinde 59 geçiş, normal lokomotor aktivitesi gösterir) göstermektedir. kafesin farklı yerlerinde harcanan zaman oturumunda II sosyal bölmesi / fincan için tercih yargılamak için bir temel olarak hizmet vermektedir.
Şekil 10, oturum II sosyallik analizinin sonucunu göstermektedir. özel ilgi gösterilen EXA içinde (nonsocial vs sosyal fincan yakın harcanan zamanlarmple 230.8 vs 72.3 sn) ve nötr ve nonsocial bölmeleri (314,7 vs 109.4 vs 185.5 sn) karşı sosyal. Sosyal fincan ve bölmeye doğru açık önyargı kontrol farelerinden için tipik ve seans I (Şekil 9) elde edilen veriler ile karşılaştırılması açıkça önyargı gerçekten bir uyarıcı fare varlığının bir sonucu olduğunu göstermektedir.
Şekil 11, oturum III sosyallik analizinin sonucunu göstermektedir. sosyal yaklaşımlar (35 dk 10) yanı sıra uyaran fare (9/10) tarafından sosyal yaklaşımlara son derece olumlu tepkiler çok sayıda, normal sosyallik farelerin tipiktir.
Şekil 2. Grafik Kullanıcı Arayüzü. Lütfen cBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak.
Şekil 3. Boş Cage. Bu gri skala dönüşüm sonra bir referans çerçevesi olarak kullanılır. Kırmızı daire karşı tarafında sosyal fincan ve fincan nonsocial konumunu gösterir. dikey beyaz çizgiler farklı bölmelere kafes bölmek ve dikdörtgen kafesin iç sınırını gösterir.
Şekil 4. Şekil 3'ün Grayscale sürümü.
5. Orijinal Çerçeve Şekil. Gri tonlama biçimde bir film karesini. sosyal silindir beyaz bir daire ile işaretlenmiş vetoplumsal silindirin daha 2 cm daha büyük bir çapa sahip bir ek gri daire testi fare sosyal silindire "yakın" olarak kabul edildiği bölgeyi ayırmak için çizilir. ters köşede, nonsocial silindir yine gri bir daire ve geniş açılı bir yakın nonsocial silindire kabul edilir bölgeyi ayırmak çizilir 2 cm ek daire ile işaretlenir. dikey beyaz çizgiler farklı bölmelere kafes bölmek ve dikdörtgen kafesin iç sınırını gösterir.
6. Fark Resmi rakam. Görüntü örnek çerçevesinden referans çerçevesini çıkarılmasıyla elde.
Şekil 7. ikilileştirilmiş Görüntüsü. Di piksel(Bu örnekte 30), belirli bir eşiği aşan fference görüntü fare piksel olarak kabul edilir ve beyaz bir gösterilmiştir. Kırmızı daire burun gösterir ve beyaz bir daire kuyruk.
Şekil 8. Fare Yörünge. Küçük beyaz daireler bu çerçeve ele geçirildi Ben kadar oturumun başlangıcında burun yerini göstermek.
Oturum I için Sosyallik Analiz Şekil 9. Sonuçlar, ilgili kafes bölmeleri üzerinde numaralar kez işaret (bu durumda onlara harcanan fare sol bölmesindeki 254,3 sn, nötr bölmeye 155.2 sn ve sağ 237.0 sn bölme). çevrelerin içindeki sayılar kez fare res yakın geçirdi gösteriyorprospektif fincan ( "yakın" uzakta az 2 cm demektir, ya da iki çevrelerin dış içinde): yakın sol bardak 140.0 sn ve yakın sağ fincan 105.6 sn. alt orta sayı fare kafesinin farklı bölümlerinde (örneğin 59 kez) arasında geçiş ne sıklıkta gösterir.
Oturum II Sosyallik Analiz Şekil 10. sonuçları. Oturumda II, birinde bir uyarıcı fare bölümlerinde üstünde ve çevreler Şekil 9 / oturum I. Not olarak kafesin farklı bir parçası geçirdiği süreleri işaret içindeki sayılar olduğunu ters bardak (bu durumda sol bir), bu nedenle bu kupa "sosyal" fincan olur. İlk kez verilir için oturum I önlemlerine ek olarak, zaman testi fare sosyal silindire (2 cm) yakın almak için gerekenmerkezin sağ alt. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Oturum III Sosyallik Analiz Şekil 11. sonuçları. "Yaklaşımı" sonra sayı testi fare tarafından yapılan sosyal yaklaşımlar, Pos "sonra sayıların sayısını belirtmektedir. Resp. "Ve" Neg. Solunum. "Devlet teşvik fare ile sosyal yaklaşımlara Test fare tarafından olumlu ve olumsuz yanıtların sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
videoya fareler ve otomatik film analizi birleştirerek, uygun fiyatlı, güvenilir, yüksek verimli tarama tekniğini oluşturduk.
otomatik analiz doğruluğu 100'den filmler için el ile analiz sonuçları karşılaştırılmıştır. kare kare ezici çoğunluğu (>% 99), fare burun iyi hassasiyetle tanımlanır. Filmlerin yaklaşık% 80'i herhangi bir düzeltme gerekmez böylece (birkaç) misdetections çoğu sosyallik tedbirler üzerinde hiçbir etkiye sahip.
bugüne kadar en yaygın sorun baş ve kuyruk karıştı, bu yüzden yazılım bir film kesimi için baş ve kuyruk geçmek için basit bir yol dahil olmasıdır, misdetections içeriyor yapmak o filmlerde. filmler için kontrol edin ve tüm misdetections düzeltmek için inceledi bile değerlendirme süresi çok kısa kalır, böylece bu onay, yaklaşık 3 kat gerçek zamanlı hızında yapılabilir. filmin bölümleriSilindir biri bile yüksek hızda izlenebilir hangi fare yakın değildir.
Tüm otomatik ve manuel belirlenen sosyallik tedbirler arasındaki anlaşma (mümkünse misdetections düzeltildi varsayarak) mükemmel. Aslında, otomatik olarak belirlenen sosyallik önlemlerin kalitesi nesnel ölçütler sürekli mesafeleri ve sürelerini belirlemek için kullanılan çünkü manuel değerlendirme insan algısı ve reaksiyon süresi sınırları muzdarip iken elle, olanları tespit üstündür. Bu sınırlar değerlendirme zamanı sınırlamak için arzu edilir yüksek görüntüleme hızları, daha ağır hale gelir.
Adım 2.2.2 ile ilgili Not .: Bu rutin standart görüntü işleme araçları 14 kullanarak sınırına beyaz piksel kümesi azaltılması ve herhangi iki sınır piksel arasındaki mesafeyi bilgisayar tarafından yürütülmektedir. en uzak noktaları bulma yararlıdır, çünkü burun ve kuyruk tabanıBu iki ucuna yakın olma eğilimindedir.
Bütünlüğü sağlamak için, uçların sürekliliği (aşama 2.3.4) uygulanması, aşağıda tarif edilmektedir. Uçları c ve d ve uçları a ve b ile bir önceki çerçeve ile belirli bir çerçevede, c olsun b a ve d ait veya c (Şekil 12) a b ve d aittir.
Şekil 12. Süreklilik belirlenmesi. Fare açık gri renkte burun ve kuyruk bir olarak işaretlenmiş ve b sırasıyla ilk konumdur. burun kuyruk beyaz renkte Fare c işaretli d sırasıyla sonraki karede fare konumudur.
Genel bir fikir fare tek bir karede diğerine kendi uzunluğundan daha az hareket çünkü doğru devam edebilmesi için, uçları tarafından katedilen mesafelerin toplamı, yanlış devamı için daha küçük olmasıdır. Örnekte (Şekil 2 δ 1 = | c - a |, δ 2 = | d - b |, Δ 1 = | c - b | ve Δ 2 = | d - a | ve demek ki, çünkü δ 1 + δ 2 <Δ 1 + Δ 2, doğru devam bir → c ve b → d. Böyle bir kararlılık güven için iyi bir ölçü oranı r = max (δ + δ 2, Δ 1 + Δ 2 1) / dk (δ 1 + δ 2, Δ 1 + Δ 2), daha ne kadar açıklar uçları bir continuatio içinde seyahat ediyorumdiğer karşı n. Tanım olarak, r uzatılmış fare şekilleri için 1'e eşit veya büyük, r (fare arka ayakları üzerinde duran, çünkü örneğin) fare şekil, r yakın alabilirsiniz daha yuvarlak hale yalnızca, 10'dan genellikle büyüktür bir ve devamı güvenilmez. Güvenilir devamı için r> 2.5 bir eşik kullanılmıştır. Bu eşik değeri ile, uçların sürekliliği gerçekleşmesi üzerinden çerçeve bölümleri, yüzlerce binlerce kare tipik değişmektedir. Her bölüm için, hangi doğru fare bir bölüm içinde hareket sona belirler. Bir bölümde süreklilik kurulduktan sonra, "ağırlık merkezi" (COG, tüm fare piksellerin ortalama koordinatları) bölümünde her çerçeve için belirlenir. sonraki bir çerçeveden COG farkı iki kare arasındaki fare hızını tanımlar. Bu hız olsun ve fare yedekte hareket ne kadar görmek için iki ucunu bağlayan vektör üzerinde tahmin edilmektedirBirinci veya ikinci sonuna doğru ARDS. (Birinci veya ikinci ucuna doğru olan) tüm çerçevelerin hareketlerinin toplamıdır toplam hareket.
Mevcut protokol farklı deneysel ihtiyaçlarını karşılamak için çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Fare hareketi (örneğin, ortalama hız) farklı yönleri ilgi varsa, bu bilgisayarlı fare yörünge elde edilebilir. aydınlatma koşulları burada tarif edilenlerden çok farklı ise, fare piksel verir çiftleme adımda eşik ayarlanabilir. Farklı bir kafes şekli gibi hatta değişiklikler mevcut kafes yapılandırma rutin değiştirerek uygulanabilir.
açıklanan yazılım bazen baş ve kuyruk (film az% 20, baş / kuyruk çevirme bizim değerlendirmesini etkileyecek çünkü düzeltilmesi için bir ihtiyaç vardır) karıştırır. Biz kullanıcı ilk tespit ve inci sağlayan kullanışlı bir aracı yazdıBaş ve kuyruk ihtiyacı saygısız ve daha sonra tek bir tıklama ile bu düzeltme yürütmek için hangi aralığının e son kare. Çok az film (birkaç si) bunlar için kullanım testi fare burun herhangi bir zaman aralığı sırasında kafesin hangi bölümüne belirlemenizi sağlar daha genel bir düzeltme aracı yaptı, kafa / kuyruk çevirme dışındaki sorunları vardı. düzeltmeye gerek çok nadiren değerlendirme süresi üzerindeki etkisi küçük olduğu ortaya çıkar unutmayın.
protokol Planlanan uzantılar aynı zamanda daha sosyal böyle takip ve anogenital (sırasıyla, vücuda test fare burun ve uyarıcı fare anüs mesafe gözlenerek tespit edilebilir) koklama gibi ilgili davranışları tespit etmek vardır. Stereotip davranışları aynı zamanda fare şekil değişikliği tespit edilebilir, örneğin yetiştiriciliği için, tespit edilebilir. Diğer ilginç bir uzantısı testi renk sürece basit olmalıdır farklı renkte farelerin kullanımı,d uyaran fare kafes duvarlar ve kafes zemin rengi ile iyi kontrast var.
Özetle, açıklanan protokol deneysel ve bir görüntü işleme parçası vardır. sınırlı uyaran fare ile, III: serbestçe uyaran ile etkileşim II, tek başına kafese: Deney bölümünde, en önemli adımlar aydınlatma ve kafesin konumunu kontrol etmek ve daha sonra (üç oturumları sırasında I fare davranışını kaydetmek için vardır fare). Analiz kısmında, kritik adımlar, bir film ve kafes yapılandırması yüklemek için burun ve kuyruk yörüngeleri gelen sosyallik ölçmek için gerekli istatistikleri hesaplamak için daha sonra burun ve kuyruk pozisyonları belirlemek için her film karede görüntü işlem gerçekleştirmek ve vardır.
tarif edilen yöntemin bir sınırlama yalnızca beyaz tüylü fareler için test edilmiş olmasıdır. Bu otomatik analiz sürece cihaz duvarlar ve zemin sağlamak gibi diğer kürk renkleri ile aynı zamanda çalışacak bu nedenle duruyorGüçlü kürk rengi ile kontrast, ancak bu henüz kurulmamıştır.
Başka bir sınırlama oturumu III değerlendirilmesi otomasyon eksikliğidir. Bizim için en önemli zorluk, diğer gruplar için olduğu gibi, fare farelerin sık yakın karşılaşmalar sırasında Test fare ve hangi uyarıcı fare olduğu takip etmektir. Biz böyle farelerin kulakları arasında renkli noktalar olarak işaretleri ile bu sorunu çözebilir bulduk, ama biz denedim tüm işaretleme yöntemleri bugüne kadar farelerin tahriş en azından bir kısmını ve büyük ölçüde onların davranışlarını değiştirdi. Bu nedenle, oturumun III güncel analiz otomatik olarak tüm yaklaşımları algılar ancak manuel sınıflandırılarak gösterilmesini gerektirmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Virginia'nın Commonwealth Sağlık Araştırma Kurulu hibe finansmanı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas cage | Norva Plastics, Norfolk, VA | custom made | Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing |
| Wire cups | Kitchen plus | 315 | Use one to house stimulus mouse, one empty |
| Video camera | SONY | HDR-PJ790 | Can be replaced by any camera with Comparable specifications |
| OpenCV (Image processing library) | Willow Garage | N/A | Any modern image processing library can be used. |
References
- Brodkin, E. S. BALB/c mice: Low sociability and other phenotypes that may be relevant to autism. Behavioural Brain Research. 176, 53-65 (2007).
- Deutsch, S. I., Burket, J. A., Urbano, M. R., Herndon, A. L., Winebarger, E. E. Impaired sociability of the BALB/c mouse, an animal model of autism spectrum disorders, is attenuated by NMDA receptor agonist interventions: clinical implications. Comprehensive Book on Autism Spectrum Disorders. Mohammadi, M. A. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-book-on-autism-spectrum-disorders/impaired-sociability-of-the-balb-c-mouse-an-animal-model-of-autism-spectrum-disorders-is-attenuated 323-342 (2011).
- Dunn, M. E., Burbine, T., Bowers, C. A., Tantleff-Dunn, S. Moderators of stress in parents of children with autism. Community Mental Health Journal. 37, 39-52 (2001).
- Babineau, B. A., Yang, M., Berman, R. F., Crawley, J. N. Low home cage social behaviors in BTBR T+tf/J mice during juvenile development. Physiology & Behavior. 114-115, 49-54 (2013).
- Benson, A. D., Burket, J. A., Deutsch, S. I. BALB/c mice treated with d-cycloserine arouse increased social interest in conspecifics. Brain Research Bulletin. 99, 95-99 (2013).
- Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. Rapamycin improves sociability in the BTBR T(+)Itpr3(tf)/J mouse model of autism spectrum disorders. Brain Research Bulletin. 100, 70-75 (2014).
- Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. D-Cycloserine improves sociability in the BTBR T+ Itpr3tf/J mouse model of autism spectrum disorders with altered Ras/Raf/ERK1/2 signaling. Brain Research Bulletin. 96, 62-70 (2013).
- Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. Locomotor activity of the genetically inbred BALB/c mouse strain is suppressed by a socially salient stimulus. Brain Research Bulletin. 83, 255-256 (2010).
- Deutsch, S. I., et al. D-cycloserine improves sociability and spontaneous typic behaviors in 4-week old mice. Brain Research. 1439, 96-107 (2012).
- Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. Genetically inbred BALB/c mice differ from outbred Swiss Webster mice on discrete measures of sociability: relevance to a genetic mouse model of autism spectrum disorders. Autism Research. 4, 393-400 (2011).
- Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Cannon, W. R., Deutsch, S. I. D-serine improves dimensions of the sociability deficit of the genetically-inbred BALB/c mouse strain. Brain Research Bulletin. 84, 12-16 (2011).
- Deutsch, S. I., Burket, J. A., Jacome, L. F., Cannon, W. R., Herndon, A. L. D-Cycloserine improves the impaired sociability of the BALB/c mouse. Brain Research Bulletin. 84, 8-11 (2011).
- Shih, F. Y. Image Processing and Mathematical Morphology: Fundamentals and Applications. , CRC Press. (2009).
- Nixon, M. Feature Extraction & Image Processing. , Academic Press. (2008).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , Eighth Edition, The National Academic Press. (2011).
