Introduction
Die Plasmamembranen sowie die zahlreichen intrazellulären Membranen dienen als Barrieren zwischen zwei wässrigen Kompartimenten. Im Fall der Plasmamembran, ist die Trennung zwischen der Außenseite und der Innenseite der Zelle; für intrazelluläre Organellen ist zwischen dem Zytoplasma und dem Organell Lumen. Zum Beispiel, das Endoplasmatische Retikulum (ER) Membran trennt eine oxidierende Umgebung in dem Lumen des ER aus einer zytosolischen reduzierende Umgebung 1. Membranproteine sind für ER-assoziierten Ribosomen synthetisiert und erreichen ihre endgültige Topologie in der ER-Membran 2. Die Übernahme von geeigneten Membranorientierung und Topologie für Proteine ist entscheidend für ihre normale Funktion. Korrekte Topologie ermöglicht relevanten Domänen von Membranproteinen mit ihren Bindungspartnern zu interagieren, kann es entscheidend posttranslationale Modifikationen auftreten, und im Fall von Plasmamembranproteinen, ermöglicht die Zelle zu interagieren und reagieren to seiner Umgebung. Um die Funktion des Membranproteins bewusst zu werden, ist es natürlich unbedingt wissen, wie das Protein wird mit Bezug auf die Membran in dem sie sich befindet, dh seine Membrantopologie orientiert. Zusätzlich zur Übernahme von wissenschaftlicher Grundlagenforschung, das Verständnis der Topologie eines Membranproteins und welche Aspekte einer Proteinoberfläche an unterschiedliche Umgebungen ausgesetzt hat klinische Implikationen gekennzeichnet, da Membranproteine umfassen die Mehrheit der pharmakologische Targets 3. Bis vor kurzem Ansätze zur Bestimmung der Membranprotein-Topologie haben erhebliche Investitionen in Zeit und Geld erforderlich oder haben Reagenzien, die schwer zu bekommen sind erforderlich.
Sowohl experimentelle und in silico Ansätze wurden verwendet, um die Membrantopologie von Proteinen, die sich innerhalb der Plasmamembran bestimmen. Da die ersten Vorhersagen der Membran-überspannende Domänen auf der Grundlage der Auswertung Hydrophobizität indiviDual Aminosäuren 3, zahlreiche Vorhersagealgorithmen sind jetzt im Internet verfügbar und einfach Wissen um Aminosäuresequenz des Proteins erfordern. Allerdings sind Annahmen oft von zentraler Bedeutung für eine solche Modellierungsprogramme, Annahmen, die zu falschen Zuordnungen der Topologie 4,5 führen kann. Hinzu kommt, dass diese Computer-basierten Vorhersagen versuchsmembranüberspannenden Regionen zuzuordnen, aber nicht immer, ob die Amino- oder Carboxy-Termini von Proteinen im Zytoplasma oder Zellorganelle Lumens außen. Selbst bei erhöhter Rechenleistung und die Verwendung von Maschinenlernalgorithmen 6, wie Daten noch ein Modell, und müssen mit experimentell ermittelten Daten validiert werden. Direkte experimentelle Bestimmung der Membrantopologie wurde unternommen unter Verwendung von Platten aus monoklonalen Antikörpern mit bekannten Epitopen gesamten Proteins, wobei die Bewertung ihrer Immunreaktivität wurde vor und nach Zellpermeabilisierung hergestellt wurde verteilt. DieseAnsatz erfordert eine Reihe von Antikörpern, die nicht für das Protein von Interesse verfügbar sein werden.
Eine alternative Strategie ist es, Epitop-Tags, wie myc und Hämagglutinin (HA) in verschiedene Positionen in dem Protein, wiederum durch Bestimmung der Immunreaktivität vor und nach einer Membranpermeabilisierung gefolgt Engineer. Neben immunogene Tags, enzymatischen Tags (einschließlich alkalischer Phosphatase, β Galactosidase oder β-Lactamase-) und chemischen Modifikationen, wie Cystein Scannen wurden alle verwendet, um Membranproteintopologie 7,8 zu bestimmen. Eine weitere für die topologische Abbildung von Plasmamembranproteinen verwendete Methode beruht auf einem etwas anderen Ansatz, um Epitop-Tags. In diesem Verfahren wird der Tag-Sequenz ist der N-verknüpften Glykosylierung Consensussequenz NXS / T. Da nur Glykosylierung tritt auf, wenn eine solche Sequenz in das Lumen des Biosynthesewegs der Anwesenheit des Etiketts in einer Lumen Vergleich vorliegta Cytosol wird leicht als Massenverschiebung auf SDS-PAGE-Gelen beobachtet. Eine solche Vorgehensweise hat zur multispanning Ionenkanal CFTR 9 angewandt. Während all diese Ansätze verwendet worden, ist es klar, dass sie alle erfordern erhebliche Investitionen in der Molekularbiologie zu generieren und zu sequenzieren, die vielfältigen Konstruktionen.
Um zu bestimmen, topologische Informationen bezüglich Transmembranproteine innerhalb der intrazellulären Organellen hat sich als schwieriger. Die Applikation der fluoreszenzbasierten Technologien hat jedoch die Bestimmung der Membrantopologie viel einfacher. Die Technik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) beruht auf der Wechselwirkung zwischen zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente eines fluoreszierenden Proteins, das Wiederherstellen der fluoreszierenden Eigenschaften des Proteins 10. Obwohl zunächst zur Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo 10 beschrieben, hat dieser Ansatz auch dazu verwendet worden,Membranproteintopologie in pflanzlichen Zellen 11 zu bestimmen. Dieser Ansatz ist aber auch zeitintensiv, da sie die Bildung nicht nur von Fusionsproteinen mit dem Protein von Interesse, sondern auch eine Vielzahl von Fusionsproteinen in das Cytosol oder Organell Lumen gezielte benötigt und erfordert die Kenntnis über den intrazelluläre Membranen, die das Protein von Interesse besteht in .
Ein alternativer einfacherer Ansatz zur Bestimmung Membranprotein Topologie beschrieben worden 12. Der Assay, Fluoreszenz-Protease Protection (FPP) erfordert die Erzeugung eines Fusionsproteins zwischen GFP und das Gen von Interesse. Der Ansatz basiert auf der relativen Zugänglichkeit unspezifische Proteasen zu dem GFP-Einheit basiert; je nachdem, ob GFP aus Proteolyse durch die sich in das Lumen des intrazellulären Organellen oder geschützt wird, um die Proteolyse durch wobei im Cytosol vorliegende ausgesetzt. Wenn somit das GFP Einheit an das Protein von Interesse steht das Zytoplasma, wird es zu belichtendenProtease-Aktivität und das Fluoreszenzsignal verloren. Umgekehrt, wenn das GFP-Einheit an das Protein von Interesse sieht eine Umgebung "geschützt" aus der Protease (wie die Golgi-Lumen) anschließend wird das Fluoreszenz-Signal bestehen.
Damit Proteasen in die Zelle eindringen, aber nicht in den intrazellulären Membran Abteile der Cholesterinbindungsarzneimittel Digitonin verwendet. Cholesterin ist der dominierende Sterol in Vertebraten, und ist speziell in der Plasmamembran relativ zu intrazellulären Kompartimenten angereichert. Die Glycosid-Toxin, Digitonin, wird aus der Anlage Digitalis purpurea extrahiert. Digitonin eine Affinität für Cholesterin reiche Membranen, wo sie führt zu einer selektiven Membran permeabiliztion 14,16 (Figur 1). Zusätzlich dazu, dass die Ausfahrt der kleinen cytosolischen Komponenten ermöglicht Digitonin Permeabilisierung auch den Eintritt von exogenen Molekülen, wie Proteinase K oder Trypsin. Die FPP-Protokoll nutzt die fact, dass die Plasmamembran enthält bis zu 80% des zellulären Cholesterin 17, wohingegen andere Zellorganellen, wie ER, Golgi, Endosomen, Mitochondrien, die einen sehr geringen Cholesteringehalt aufweisen, intakte 14 verbleiben. Die selektiven Einbau von Cholesterin in die Plasmamembran wurde in vielen eukaryotischen Zellen beobachtet worden, die die Verwendung von Digitonin-abhängigen Plasma Membranpermeabilisierung in so unterschiedlichen eukaryotischen Spezies wie S. cerevisiae die menschliche 14,18. Die FPP-Assay bietet eine einfache, schnelle und ziemlich robust Mittel zur Bestimmung (a) ob ein Protein membrangebunden / verknüpften oder im Cytosol und (b) die Domäne eines Membranprotein frei diffusions Gesichter der Cytosol oder Organelle Lumen. Sollte ein Membranprotein mehrere Orientierungen, wird das Signal von der dominanten Form entstehen und kleinere Formen werden nicht erkannt. Zwar gibt es einige Bedenken, dass die Zugabe eines GFP-Einheit an das Protein an Interesse kann die Funktion beeinträchtigen und/ Oder subzelluläre Lokalisierung, das ist eigentlich mehr theoretisch als tatsächlich. Tatsächlich wurden viele Studien haben klar gezeigt, dass die GFP-Tag nicht die Eigenschaften des Proteins 19,20 verändern.
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Protocol
1. Erzeugung und Validierung von Fluorescent Protein Chimären
- Append grün fluoreszierende Protein (GFP) an die Amino- oder Carboxytermini des Proteins von Interesse unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien, 13.
HINWEIS: Auch wenn wir GFP ausgiebig genutzt, andere Varianten wie zum Beispiel Cyan Fluorescent Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), DsRed und mCherry eingesetzt werden. Verbesserungen in der Fluorophor Faltungseffizienz, Helligkeit und Lichtstabilität werden ständig gemacht, und Ermittler sollten sich über die neueste Generation Konstrukte in Anspruch nehmen.- Bestätigen korrekte DNA-Sequenz und sicherzustellen, dass die GFP-Einheit ist im Rahmen mit dem interessierenden Protein. Führen Sequenzierung unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien 21.
HINWEIS: Viele Institutionen haben Kern DNA Einrichtungen, die der Ermittler ist aufgefordert, für weitere Informationen zu kontaktieren. - Für Einzel- oder Doppelpass Membranproteine zu erzeugensowohl Amino- und Carboxylende Versionen der Fusionsproteine 19.
- Für Multi-Spanning Proteine einfügen GFP im vermeintlichen extramembranären Schleifen, sowie die Enden. Besondere Vorsicht beim Erzeugen Trans Chimären mit dem fluoreszierenden Fusionsprotein mit dem Amino-Terminus des Zielproteins befestigt, wie Signalsequenzen werden oft durch Proteolyse abgespalten, sobald das Protein durch die ER Translokon geleitet.
- Im Fall von noch vorhandenen Signalsequenzen, legen Sie die fluoreszierende Fusionsprotein distal der Spaltstelle, um ein reifes Protein eine intakte aminoterminale getaggte fluoreszierendes Protein enthält, zu erzeugen. Beschäftigen rekombinanten DNA-Standardstrategien zur Erzeugung von Chimären 21.
- Bestätigen korrekte DNA-Sequenz und sicherzustellen, dass die GFP-Einheit ist im Rahmen mit dem interessierenden Protein. Führen Sequenzierung unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Strategien 21.
- Bestimmen Sie die Anwesenheit von ausreichend entsprechend lokalisierten Fluoreszenz-Signal in der Zelllinie von Interesse.
- Beachten Sie die Zellen unter Epifluoreszenzmikroskopie mit Hilfe der Eigenfluoreszenz von GFP unter entspreaß Filter festgelegten Bedingungen. Für GFP Filtersätze, die von 510 bis 560 nm umfassen, zu bestätigen, dass die richtigen Filter für die verwendete Fluorophor verwendet.
HINWEIS: Ein ausreichendes Signal wird erreicht, wenn Beurteilung mit dem Auge bietet stark genug empfangen, dass die Zellstruktur, in dem das Signal liegt leicht über dem Untergrund gelöst. Zusätzlich sollte das Färbemuster des GFP-Proteins mit derjenigen von Markern zur geeigneten Organelle, und vorzugsweise identisch mit der des nativen unmarkierte Protein sein.
- Beachten Sie die Zellen unter Epifluoreszenzmikroskopie mit Hilfe der Eigenfluoreszenz von GFP unter entspreaß Filter festgelegten Bedingungen. Für GFP Filtersätze, die von 510 bis 560 nm umfassen, zu bestätigen, dass die richtigen Filter für die verwendete Fluorophor verwendet.
- Bestimmen Sie, ob eine stabile oder transiente Transfektion Ansatz wird basierend auf das Protein evaluiert genutzt werden.
HINWEIS: Stabile Transfektanten in der Regel leisten niedrigere Expressionsniveaus als vorüberSysteme. Obwohl die transiente Expression ergibt eine hohe Expression von Proteinen und der Erhöhung der Signalintensität (~ 5-24 h nach der Transfektion in Abhängigkeit von dem Protein), kann es auch zu einer Überexpression Artefakte wie Protein aggr führenegation oder Sättigung der Proteintargetingsignalwege, was zu fehlerhaften subzelluläre Lokalisation.
2. Transfektion von Zellen und Zellkultur
ANMERKUNG: Eine Vielzahl von Zellen sind zugänglich für FPP-Analyse, einschließlich HEK293, HeLa, COS-7 und CHO-Zellen 14. Die folgende Beschreibung ist auf das Ausdrücken von Membranproteinen in HEK293-Zellen.
- Wachsen menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) als adhärente Monolagen in 6 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Natriumpyruvat und 250 & mgr; g / ml Penicillin / Streptomycin ergänzt war, bei 37 & deg; C mit 5% CO 2. Alle Arbeiten mit Zellen in einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze. Wachsen Zellen, die in Kulturmedium, bis ~ 80% Konfluenz in einem T-75-Kolben.
- Transfektion von Zellen mit jedem Standard-High-Effizienz, geringe Toxizität Transfektionsmethode, einschließlich Lipid-, viral- oder Elektroporation basierenden Technologien zu generieren transient oder stabile Expression. Typischerweise 2 & mgr; g Plasmid-DNA pro 1 × 10 6 Zellen ergibt gute reproduzierbare Proteinexpression. Pflegen Zellen 5-48 h in geeigneten Gewebekulturmedien bei 37 ° C in einem CO 2 fähig Gewebekultur-Inkubator.
- Überwachungszellen für die Expression des GFP-Fusionsprotein unter Verwendung der Epifluoreszenzmikroskopie, mit der intrinsischen Fluoreszenz von GFP-Signal, unter Verwendung von geeigneten Filtersätze gemäß dem Protokoll des Herstellers. Fluoreszenzsignal in der Regel ein Maximum erreicht innerhalb von 24-72 Stunden nach der Transfektion. Verwenden Sie Zellen, wenn das Fluoreszenzsignal einen Maximalwert erreicht. Überwachen Proteinexpressionsniveaus durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die entweder gegen das Protein von Interesse oder das GFP-Einheit geleitet.
- Für experimentelle Analyse Platte Zellen auf beschichteten Deckgläsern. Sehen Sie entweder im Rahmen eines Live-cell-Konfiguration oder nach Fixierung und Montage auf Objektträger. Plattenzellen auf 60% bis 80% Zusammenfluss innerhalb von 24-48 h erreicht.
- Coat Deckgläser mit Poly-Lysin-Lösung (0,1 mg / ml), so dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren für 30 min unter einem UV-Licht bei Raumtemperatur, gefolgt von 60 min in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C. Überschüssiges Poly-Lysin und spülen Sie die Deckgläser in PBS 3 mal.
- Alternativ Platte die Zellen auf einem Kammer-Deckglas, bestehend aus Zellkultur-Platten mit einem optischen Glasboden, um direkte Abbildung mit Öl-Immersionsobjektive ermöglichen. Die tatsächliche Mikroskopie Setup hängt davon ab, den der Forscher Ausrüstung, sollte aber in der Lage, eine schnelle Lösung Änderungen. Je nach Zelltyp und der Zellform, sollten Zellen um 60-90% konfluente zum Zeitpunkt des FPP-Assay.
3. Fluoreszenzmikroskopie-Setup
- Verwenden Sie eine hohe numerische Apertur (NA) Ölimmersionsobjektiv für maximale Signalerfassung und räumliche Auflösung, wie ein 60X, 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv. Verwenden the folgenden Laser, um die Fluorophore anzuregen: Argongas 488 nm (GFP und YFP) und 561 Dioden (RFP, mCherry).
- Bestimmen Sie die optimale Belichtung, Verstärkung und Erfassungsrate der Bilder für jedes Konstrukt. Passen Laserintensität und Belichtungszeit zu minimieren Photobleaching (siehe Schritt 7.1.2).
- Für Studien mit mehreren Fluorophoren (zB ein löslicher Marker für Membranpermeabilisierung im Konzert mit einem Membran-Protein-Marker), wählen Sie entsprechende Filtersätze zur Signalübersprechen zu minimieren und Signal-zu-Rausch-Verhältnis.
4. Aufbau Optimale Bedingungen für Plasma Membranpermeabilisierung
- Entfernen des Zellkulturmediums von den Zellen nur lösliche fluoreszierende Proteine exprimieren (zB EGFP, DsRed). In KHM Puffer waschen der Zellen 3 mal (jeweils 1 min) (110 mM Kaliumacetat, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Führen Sie Versuche mit Zellen und alle Reagenzien bei Raumtemperatur.
- Ortszellen on Deckgläser (siehe Schritt 2.4) in KHM-Puffer auf einem Fluoreszenzmikroskop Bühne und sammeln Sie das erste Bild, das die Kontrolle "nicht-permeabilisierten" Stufe stellt.
- Um selektiv durchdringbar, die Plasmamembran, fügen Digitonin (30 uM) in KHM Puffer zu den Zellen. Perfundieren Zellen mit Puffer (buffer + Digitonin) mit einer Geschwindigkeit von 5 ml / min für 10-60 sec.
- Bestimmung der optimalen Digitonin Konzentration durch die schrittweise Erhöhung der Konzentration von Digitonin. Die optimale Digitonin Konzentration erreicht wird, wenn eine vollständige Verlust der Fluoreszenz-Signal von löslichen EGFP innerhalb 10-60 sec Digitonin Anwendung. Für viele Zellen Anwendung von 10-50 & mgr; M Digitonin ausreichend ist, um die Zellmembran zu permeabilisieren.
- Für alle Anwendungen, die niedrigste mögliche Konzentration von Digitonin. Sammeln Sie die Bilder nach der Digitonin permeabilisierten Permeabilisierung für Hintergrundsignal.
- Bestätigen Sie, dass die GFP-Protein-Chimäre der Umgebung ist die Membran indurch Bestätigen zelluläre Retention des Fluoreszenzsignals nach Digitonin Permeabilisierung der Plasmamembran 16 integriert.
- Express eine Organelle spezifische fluoreszierende Protein 23. Mitochondriale Proteine funktionieren gut in dieser Hinsicht 16 zB pDsRed2-Mito Vektor. Bestimmen Sie die optimale Expression Bedingungen wie in Schritt 2.1 beschrieben.
- Bestätigen, dass das Digitonin Konzentration für den Zelltyp, indem sichergestellt eingesetzt ist angemessen, dass die Morphologie der intrazellulären Organellen über lange (bis zu 60 min) Einwirkung Digitonin konstant bleibt.
HINWEIS: Verwenden Sie Standard-Immunfluoreszenz-Protokolle unter Verwendung von Antikörpern gegen verschiedene Zellkompartimente wie Lysosomen (zB LAMP1), Golgi (zB TGN38) Endoplasmatischen Retikulum (zB Calnexin), Endosomen (zB Rab5), Mitochondrien (zB Cytochrom c). Wenn intrazellulären Organellen-Morphologie / Integrität ändert sich dramatisch over 60 min, ist es wahrscheinlich, dass das Digitonin-Konzentration zu hoch war, und erfordert die Verringerung Digitonin Konzentration und / oder der Belichtungszeit.
HINWEIS: Digitonin ist durch Einatmen und Hautkontakt toxisch. Geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen.
5. Protease Behandlung von Fluoreszierende Proteine
- Waschen Sie die Zellen in KHM Puffer und fügen Protease (Proteinase K; 50 ug / ml in Puffer KHM) direkt auf die Zellen. Perfundieren Zellen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml / min unter Verwendung einer Schwerkraftzufuhr Perfusionssystem kontinuierlich Bad wurde der Zubereitung.
- Shop-Lösungen in 50 ml Spritzen und Polyethylenschlauch verbunden unabhängige Reservoirs mit einem Verteiler mit einem einzigen Auslass am Bad (5 ml / min Durchflussmenge). Positionieren Sie eine Saugpipette, eine konstante (0,5 ml) Badvolumen erhalten und erzielen Lösung Austausch durch manuelles Umschalten zwischen Perfusion Stauseen.
- Sammeln Bilder, ob der Fluor bestimmenzier Signal bestehen bleibt oder verschlechtert. Ein Verlust von> 90% der Ausgangssignalstärke über 30-60 sec ist konsistent mit den proteolytischen Abbau des GFP-Protein-Chimären (siehe Repräsentative Ergebnisse).
- Wenn keine Signalverschlechterung durch Proteinase K zu beachten, wenn ein solcher Verlust zu erwarten ist, ersetzen Sie die Proteinase K-Lösung mit Trypsin (4-8 mM) in KHM-Puffer. Falls erforderlich, verwenden eine Mischung von Proteinase K und Trypsin. Es besteht keine Notwendigkeit, die Protease-Aktivität zu quenchen.
6. alternativer Ansatz für Plasmamembranproteinen mit externen Domains
- Für Plasmamembranproteinen, führen Sie den Test für externe fluoreszierende Proteine Chimären vor Permeabilisierung Digitonin. Die Zellen auf Deckgläsern in KHM-Puffer (5 ml / min x 3 min) waschen, und nehmen Sie ein Bild für die Pre-Protease-Behandlung und Quantifizierung von Pre-Protease-Fluoreszenz-Signal, wie in Schritt 7.
- Expose Zellen Protease (Proteinase K; 50 & mgr; g / ml Trypsin oder 4-8 mM in KHM Puffer) in ter Abwesenheit Digitonin durch Perfusion der Zellen mit Medium, das KHM Protease (Fließgeschwindigkeit 5 ml / min). Sammeln Bilder des fluoreszierenden Proteins, um zu bestimmen, wie schnell das Signal verschwindet, oder wie lange das Signal andauert.
- Bevor Digitonin Permeabilisierung quenchen alle Proteaseaktivität, entfernt, indem die Zellen dreimal (jeweils 1 min) in Zellkulturmedium, das 10% Serum (FBS).
- Waschen Sie die Zellen durch Perfusion mit KHM Puffer (Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min) für 2 min. Erwerben Sie eine pre-Permeabilisierung Bild. Permeabilisierung der Zellmembran, wie in Schritt 4 beschrieben.
- Sammeln Sie Bilder folgenden Protease hinaus wie in Schritt 5 beschrieben.
7. Bildanalyse
- Verwenden eines Umkehrmikroskops fähig "lebenden Zellen" aufzunehmen, in dem der Verlust der Fluoreszenzsignal in Echtzeit überwacht werden. Zur kontinuierlichen Überwachung, beschäftigen identischen Parametern (Belichtungszeit, Verstärkung, Laserintensität, etc.).
- Bestimmen experimental Parameter durch Beobachten des Fluoreszenzsignals von der GFP-Protein von Interesse unter Kontrollbedingungen (dh KBH Puffer allein). Einstellen der Verstärkung, der Laserintensität und die Belichtungszeit-Einstellungen auf der computergesteuerten Mikroskop, um sicherzustellen, dass es keinen nennenswerten Verlust an Signalintensität über einen Zeitraum von 10-20 Minuten.
HINWEIS: Die Signalstärke ist kein absoluter Wert, sondern auf dem Mikroskopsystem und verfügbaren Einstellungen für jedes PI basiert. Überwachen Sie Änderungen der relativen Fluoreszenzintensität.
- Bestimmen experimental Parameter durch Beobachten des Fluoreszenzsignals von der GFP-Protein von Interesse unter Kontrollbedingungen (dh KBH Puffer allein). Einstellen der Verstärkung, der Laserintensität und die Belichtungszeit-Einstellungen auf der computergesteuerten Mikroskop, um sicherzustellen, dass es keinen nennenswerten Verlust an Signalintensität über einen Zeitraum von 10-20 Minuten.
- Alternativ lassen Zellen zu festgelegten Zeitpunkten in Digitonin gefolgt von Protease und fixieren Zellen vor der Montage auf Deckgläser für die Bildgebung. Bestimmen Sie den Zeitpunkten empirisch folgenden Verfahren in den Schritten 4 und 5. Für die erste Untersuchung, beginnen bei 0, 30, 60, 120 und 300 Sekunden nach der Zugabe von Digitonin oder Protease.
- Fix-Zellen (20 min bei Raumtemperatur) unter Verwendung einer ausreichenden Menge an Fixierungsmittel (3,7% Paraformaldehyd in PBS) vollständig versenken thE-Zellen.
- Quench Restparaformaldehyd durch Spülen Zellen mit PBS, enthaltend 20 mM Glycin (3 x 5 min).
- Montieren Sie Deckgläser durch das Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit aus dem Deckglas und Umkehren des Deckglases auf 50 ul Eindeckmittel auf einem Glasobjektträger für die Bildgebung. Die Objektträger dürfen über Nacht vor der Bildgebung zu trocknen.
- Sammeln Fluoreszenzmikroskopiebilder (unter den entsprechenden Filtern setzt kompatibel mit der Fluorophor verwendet wird) unter Verwendung der Videobild-Aufzeichnungsfunktion auf einer computergesteuerten Fluoreszenzmikroskop.
- Quantifizierung Fluoreszenzsignalintensitäten als Funktion der Inkubationszeit Zustand. Besorgen Sie sich die mittlere Pixelintensität innerhalb einer Region of Interest (ROI), die eine einzelne Zelle umschließt.
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Representative Results
Plasma Membranpermeabilisierung
Effiziente Plasma Membranpermeabilisierung wird durch die Verwendung von löslichen, fluoreszierenden Proteinen (zB GFP, DsRed) (Schritt 4) bestimmt. Diese Proteine, wenn sie in Zellen exprimiert wird, frei im Cytosol diffundieren und gehen verloren, wenn die Plasmamembran mit Digitonin (Abbildung 2) permeabilisiert. Ein vollständiges Verschwinden der Fluoreszenz-Signal sollte innerhalb von 10 bis 60 sec von Digitonin Anwendung auftreten. Bestätigung, dass das Protein von Interesse mit intrazellulären Organellen assoziiert ist, mit der Feststellung die Retention von Fluoreszenzsignal folgenden Digitonin Permeabilisierung erreicht.
Protease-Behandlung
Nach der erfolgreichen Erzeugung von Fluoreszenz Chimären zwischen dem Protein von Interesse und das fluoreszierende Protein (GFP, YFP, usw.) (Schritt 1) und die Expression des fluoreszierenden Proteins in Zellen (Schritt 2), die Behandlung der permeabilisierten Zellen mit Protease wird die Information, ob das Fluorophor (und ihrer benachbarten Proteindomäne) sind im Cytosol und zugänglich Proteaseverdau oder innerhalb einer Organelle Lumen angeordnet und damit von Proteaseverdau (Schritt 4) verhindert werden. LMTK2 eine Membran verankert Kinase 15 und Fluoreszenz Protease-Schutzassays wurden benutzt, um seine Membrantopologie 16 bestimmen. Die Carboxy Schwanz LMTK2 wurde GFP fusioniert und transient exprimiert. Fluoreszenz LMTK2-GFP-Signal rasch nach Zugabe von Proteinase K hat, die den Ort des Carboxylterminus LMTK2 innerhalb Cytosol (Figur 3) befindet. Caveolin-GFP (CAV1-GFP) 17 ist ein Plasmamembranprotein mit einem GFP-Einheit an die zytosolische Domäne befestigt. Wie bei LMTK2, wird das Signal von Caveolin-YFP Digitonin unempfindlich, aber empfindlich gegenüber der nachfolgenden Zugabe von Protease (Figur 3).
t "> Luminal löslichen Proteine können auch unter Verwendung der FPP-Protokoll identifiziert werden. In diesem Beispiel wird das ER-Retentionssignal KDEL zu DsRed hängt. Im Gegensatz zu den Signalen von LMTK2 und Caveolin, unempfindlich, um sowohl das Signal von der KDEL-DsRed Digitonin und Protease, wie Digitonin ist unfähig, die ER-Membran zu permeabilisieren und das Fluoreszenzsignal von Protease-Abbau geschützt. Ein Beispiel eines Membrandomäne innerhalb des Lumens einer Organelle durch die mitochondrialen Protein gegeben beträgt Untereinheit VIII der menschlichen Cytochrom-c-Oxidase 18,19. pDsRed-Mit, codiert die rot fluoreszierendes Protein aus Discosoma sp. auf der mitochondrialen Targeting-Sequenz von Cytochrom-c-Oxidase verschmolzen. In Zellen, die pDsRed-Mito wird Fluoreszenzsignal in der Zelle zu sehen. Nach Digitonin Permeabilisierung, das Fluoreszenzsignal mit pDsRed-Mito verbunden bleibt stabil. Zudem wurde nach Zugabe von Proteinase K, die Fluoreszenz im Zusammenhang mit pDsRed-Mito besteht, conin Einklang mit dem Fluorophor in den Mitochondrien und nicht in das Cytosol freigelegt und damit von Protease-Aktivität geschützt ist (Abbildung 3).Extrazellulären Domänen
Protease-Behandlung von nicht-permeabilisierten Zellen sollten schnell abzuschrecken das Fluoreszenzsignal, wenn die fluoreszierende Gruppe an ein Membranprotein gebunden ist die Zelle, den Blick nach außen. Die Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankert Protein PrP 20 dient als ein hervorragendes Beispiel. Ein Konstrukt, das gelb fluoreszierende Protein enthält (YFP) mit dem Aminoterminus von PrP (YFP-PrP) 21,22, ein großzügiges Geschenk von Dr. Ehud Cohen angebracht, von der Hebräischen Universität in Jerusalem. Vor der Proteasebehandlung war das Fluoreszenzsignal von der extrazellulären YFP hell (Abbildung 4). Nach Behandlung mit Protease, verschwand die extrazelluläre Fluoreszenzsignal schnell.
Zeit Überlegungen
Abbildung 1: Selektive Permeabilisierung der Plasmamembran (a) Cartoon Modell des FPP-Assay, das eine einzelne Zelle gehen durch die Versuchsprotokoll.. Das rote Symbol steht für rot fluoreszierendes Protein (RFP) im Cytosol, die grünen und blauen Symbole stehen für Transmembranproteine mit dem Fluoreszenz-Tag entweder mit Blick auf die Organelle Lumen (blau) oder Cytosol (grün). (B) Nach Digitonin Permeabilisierung, freie zytosolischeProteine diffundieren, wodurch die RFP-Signal. (C) Nach dem Aufbringen der Proteinase K wird die cytosolische grünes Signal abgebaut, während die blaue Signal wird vor dem Abbau durch die Präsenz in den Organellen Lumen geschützt.
Abbildung 2: Digitonin Behandlung permeabilisiert die Plasmamembran und gibt cytosolischen GFP (a) Cartoon einer einzelnen Zelle ausdrücken löslichen GFP, vor und nach der Behandlung mit Digitonin.. (B) Behandlung Digitonin permeabilisiert die Plasmamembran und gibt cytosolischen GFP. Eine Region of Interest (ROI) um CHO-Zellen, die GFP löslich gezogen. Nach der Behandlung mit Digitonin (50 uM) wurden Bilder vor und nach der Zugabe von Digitonin, und zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Maßstabsbalken, 10 um. (C) Die Quantifizierung der fluorescence Intensitäten der Vollzeit-Serie (af) gezeigt.
Abbildung 3: FPP zeigt die Topologie des endosomalen Protein LMTK2 (a) Karikatur von FPP, die Verlust von DsRed (rote Kugeln), sondern Eigentums LMTK2-GFP (green balls) folgende Digitonin Permeabilisierung, gefolgt von Signalverlust auf Antrag des Proteinase K. . (b) FPP-Assay von CHO-Zellen exprimiert und DsRed LMTK2-GFP. Bilder wurden vor und nach der Behandlung Digitonin und nach Proteinase K, wie angegeben, entnommen. Maßstab: 10 um.
Abbildung 4: (a) Cartoon-Modell, das die Topologie und Lage der YFP-PrP (grün) vor und nach Proteinase K-Behandlung. CHO-Zellen,YFP-PrP wurden einer K für 100 sec Proteinase. (B) Die Bilder vor und nach der Proteasebehandlung an den angegebenen Zeitpunkten dargestellt. YFP-PrP Signal vollständig folgenden Protease in Abwesenheit von Digitonin verloren. Gelb zeigt Region of Interest (ROI) für die Quantifizierung in (c) gezeigt ist.
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Discussion
Die richtige Orientierung und Topologie von Membranproteinen ist von wesentlicher Bedeutung für die ordnungsgemäße Funktion. Trotz der Bedeutung des Verständnisses Membranproteintopologie gibt viele Proteine, für die diese Daten vollständig fehlen. FPP bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit zur Bestimmung Membranproteintopologie und eine, die von den meisten Labors durchgeführt werden können. Die FPP-Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber den bisherigen Methoden zur Bestimmung von Protein-Topologie. Zum Beispiel gibt es keine Notwendigkeit, eine Gruppe von mehreren Antikörpern gerichtet wieder verschiedene Domänen des Proteins von Interesse 31 haben. In vielen Fällen ist eine derartige Gruppe von Antikörpern nicht verfügbar ist; dies gilt insbesondere für neu klonierten Proteine. Da der Assay auf Einzelzellebene durchgeführt werden, werden große Mengen an Protein biochemisch nicht für nachgeschaltete biochemischen erforderlichen Analysen wie Proteolyse oder SDS-PAGE. Tatsächlich werden nur relativ wenige transfizierten Zellen erforderlich sind, um eindeutig zuordneneine Topologie an das Protein von Interesse. Dies ist wichtig, wenn der Prüfer die Bewertung Topologie in schwer zu transfizieren Zellen wie Epithelzellen oder Neuronen. Einfache Zugabe eines GFP-Einheit entweder an die Carboxyl- oder Amino-Terminus des Proteins kann leicht unter Verwendung der zahlreichen kommerziell erhältlichen GFP enthaltenden Plasmiden erreicht werden, und in den meisten Fällen hat die Zugabe der GFP-Einheit nicht ordnungsgemäße Proteinfaltung oder subzellulären Lokalisation behindern. Jedoch muß der Prüfer bestätigen, dass dies für ihre Protein ist, da das Potential für GFP, das Protein von Interesse 23,24 beeinflussen. Viele Proteine sind bereits als GFP-Fusionsproteine zur Verfügung und erfordern somit minimalen zusätzlichen Aufwand zu topologischen Studien zu initiieren. Obwohl die kontinuierliche Überwachung von Fluoreszenz bietet eine schnelle und effiziente Mittel zur Bestimmung der Proteintopologie, für die Ermittler, die nicht über Zugriff auf Live-Cell-Imaging Equipment wird der Test ohne weiteres auf eine Formaldehydfixierung App angepasstRotauge mit Standard-Epifluoreszenz der konfokalen Mikroskopie.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen in der Anwendbarkeit der FPP-Assay. Sollte proteolytischen Prozessierung oder andere post-translationale Modifikationen führen zu leicht unterschiedlichen Membrantopologien für das Protein von Interesse wird die FPP-Assay nur bewerten die dominierende Proteinform. Zusätzlich Anhängen eines GFP-Rest an die Enden einiger Proteine ihre Funktion beeinflussen, beispielsweise zu stören carboxyterminalen PDZ-Domänen. Dennoch bietet das FPP-Assay einen einfachen Einstieg in Gründung Orientierung und Topologie viele Membranproteine.
Es ist entscheidend, dass die ersten Experimente durchgeführt werden, um die korrekte Konzentration von Digitonin, um intrazelluläre lösliche GFP frei bestimmen. Wenn das GFP diffundiert nicht aus der Zelle folgende Digitonin Anwendung sollte die Konzentration von Digitonin schrittweise erhöht werden, um die minimale Konzentration zu bestimmen Wiedererforderlich, um die Freisetzung zu erleichtern. Allerdings wird zu viel Digitonin die Morphologie der intrazellulären Vesikeln, deren Integrität sollten folgende Digitonin Anwendung bestätigt werden beeinflussen. Organellen in einigen Zellen sind sehr empfindlich und kann einen stabilisierenden Pufferzusammensetzung 25 erforderlich. Falls das Fluoreszenzsignal von der Chimäre ausgewertet niedrig ist, Auswählen eines einzelnen Klons mit einem höheren Expressionsspiegel, oder Durchführen einer transienten Expression wird oft erhöht die Signalstärke auf einem akzeptablen Niveau. Die Suche nach neuen, sollte heller Plasmiden auch mit geringer Signalintensität berücksichtigt werden. Schließlich sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass der Verlust des Signals zu sehen ist auf Proteaseabbau und nicht gegen Ausbleichung von Fluorophoren. Die Reduzierung der Lichtintensität und / oder Erfassungsrate wird dazu beitragen, Bleichen zu verringern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
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