Introduction
Plasmamembranerne, samt de mange intracellulære membraner tjener som barrierer, der adskiller to vandige rum. I tilfælde af plasmamembranen, adskillelsen mellem ydersiden og indersiden af cellen; for intracellulære organeller er mellem cytoplasmaet og organel lumen. For eksempel, det endoplasmatiske reticulum (ER) membran adskiller et oxiderende miljø i lumen af ER fra en cytosolisk reducerende miljø 1. Membranproteiner syntetiseres på ER-associeret ribosomer og opnå deres endelige topologi i ER-membranen 2. Købet af passende membran orientering og topologi for proteiner er afgørende for deres normale funktion. Korrekt topologi giver relevante domæner af membranproteiner at interagere med deres bindingspartnere, giver det kritiske post-translationelle modifikationer for at forekomme, og i tilfælde af plasmamembranproteiner tillader cellen at interagere med og reagere to dens miljø. For fuldt ud at forstå funktionen af et membranprotein, er det klart nødvendigt at vide, hvordan dette protein er orienteret med hensyn til membranen, inden for hvilken den er placeret, dvs dens membran topologi. Ud over erhvervelsen af grundlæggende videnskabelige viden, forståelse topologi et membranprotein og hvilke aspekter af et protein overflade udsættes for forskellige miljøer har markeret kliniske implikationer siden membranproteiner udgør størstedelen af farmakologiske mål 3. Indtil for nylig, tilgange til bestemmelse af membranprotein topologi har krævet betydelige investeringer i tid og penge, eller har krævet reagenser, der er vanskelige at finde.
Både forsøg og in silico fremgangsmåder er blevet anvendt til at bestemme membran topologi af proteiner, der er bosiddende i plasmamembranen. Siden de første forudsigelser af domæner membranspændende baseret på evalueret hydrofobicitet Individobbelt aminosyrer 3, talrige prædiktive algoritmer er nu tilgængelige på internettet, og blot kræver kendskab til proteinets aminosyresekvens. Men forudsætningerne er ofte central for sådanne modelleringsprogrammer, antagelser, der kan føre til forkerte opgaver af topologi 4,5. Selv disse edb-baserede forudsigelser forsøgsvis kan tildele membranspændende regioner, har de ikke altid afgøre, om amino- eller carboxy-termini af proteiner er i cytoplasmaet, organel lumen eller celle ydre. Selv med øget datakraft, og brugen af maskinen-learning algoritmer 6, disse oplysninger er stadig en model, og skal valideres ved hjælp af eksperimentelt indsamlede data. Direkte eksperimentel bestemmelse af membran topologi der er foretaget ved hjælp af paneler af monoklonale antistoffer med kendte epitoper fordelt i hele proteinet, hvor der er gjort vurdering af deres immunoreaktivitet før og efter celle permeabilisering. Dettefremgangsmåde kræver et sæt af antistoffer, som måske ikke er tilgængelige for proteinet af interesse.
En alternativ strategi er at konstruere epitopmærker såsom myc eller hæmagglutinin (HA) i forskellige steder i hele proteinet, igen efterfulgt af bestemmelse af immunreaktivitet før og efter membranpermeabilisering. Ud immunogene tags har enzymatiske tags (herunder alkalisk phosphatase, β-galactosidase eller β-lactamase), og kemiske modifikationer, såsom cystein scanning alle blevet anvendt til at bestemme membranprotein topologi 7,8. En yderligere metode anvendes til topologisk kortlægning af plasmamembranproteiner beror på en lidt anden tilgang til epitopmærker. Ved denne fremgangsmåde tag-sekvens er den N-bundet glycosylering konsensussekvens NXS / T. Da glycosylering forekommer kun, når en sådan sekvens er til stede i hulrummet i biosyntesevejen, tilstedeværelsen af fragmentet i en luminal versusen cytosolisk rum er let observeret som en masseskift på SDS-PAGE geler. En sådan fremgangsmåde er blevet anvendt på den multispanning ionkanal CFTR 9. Mens alle disse tilgange er blevet brugt, er det klart, at de alle kræver betydelige investeringer i molekylærbiologi til at generere og rækkefølgen de mangfoldige konstruktioner.
For at bestemme topologisk information om transmembrane proteiner placeret inden intracellulære organeller har vist sig at være mere udfordrende. Anvendelsen af fluorescens baserede teknologier har dog gjort bestemmelsen af membranen topologi meget enklere. Teknikken med bimolekylær fluorescens komplementation (BiFC) afhængig af interaktion mellem to ikke-fluorescerende fragmenter af et fluorescerende protein, genoprette de fluorescerende egenskaber af dette protein 10. Selvom oprindeligt beskrevet til bestemmelse af protein-protein interaktioner in vivo 10, har denne fremgangsmåde også blevet udnyttetat bestemme membranprotein topologi i planteceller 11. Men denne fremgangsmåde er også tidskrævende da den kræver generation ikke kun fusionsproteiner med proteinet af interesse, men også en række af fusionsproteiner målrettet til cytosolen eller organel lumen og kræver viden om, hvilke intracellulære membraner proteinet af interesse ligger i .
En alternativ enklere metode til opgørelse af membranprotein topologi er blevet beskrevet 12. Assayet fluorescens Protease Protection (FPP) kræver generering af et fusionsprotein mellem GFP og genet af interesse. Den fremgangsmåde er baseret på den relative tilgængelighed af ikke-specifikke proteaser til GFP del; afhængigt af, om GFP er beskyttet mod proteolyse ved bopæl i lumen af intracellulære organeller eller er udsat for proteolyse ved at være til stede i cytosolen. Hvis således GFP-delen på proteinet af interesse vender cytoplasmaet, det vil blive udsat forproteaseaktivitet og fluorescenssignalet tabt. Omvendt, hvis GFP-delen på proteinet af interesse står et miljø "beskyttede" fra protease (såsom Golgi lumen) og derefter fluorescenssignalet vil fortsætte.
Hvis du vil tillade proteaser at komme ind i cellen, men ikke indtaste intracellulære membran rum kolesterol bindende stof digitonin anvendes. Kolesterol er den dominerende sterol i hvirveldyr, og er specifikt beriget i plasmamembranen i forhold til intracellulære rum. Glycosidet toksin, digitonin, ekstraheres fra planten Digitalis purpurea. Digitonin har en affinitet for cholesterol rige membraner, hvor det fører til selektiv membran permeabiliztion 14,16 (figur 1). Ud over at tillade udgang af små cytosoliske bestanddele, digitonin permeabilization tillader også indførsel af eksogene molekyler, såsom proteinase K eller trypsin. The FPP protokol drager fordel af FACt at plasmamembranen indeholder op til 80% af cellulær cholesterol 17, mens andre organeller, såsom ER, Golgi, endosomer, mitokondrier, som har meget lavt kolesterol, forbliver intakte 14. Den selektive inkorporering af cholesterol i plasmamembranen er blevet observeret i mange eukaryote celler, tillader anvendelsen af digitonin-afhængige plasma membranpermeabilisering i så forskellige eukaryote arter som S. cerevisiae til human 14,18. Den FPP analysen giver en enkel, hurtig og temmelig robuste midler til at bestemme (a) om et protein er membranbundet / associerede eller frit diffundere i cytosolen og (b) som domæne af et membranprotein vender cytosolen eller organel lumen. Skulle et membranprotein have flere orienteringer, vil signalet opstår fra den dominerende form og mindre former vil ikke blive detekteret. Mens der kan være en vis bekymring for, at tilsætningen af et GFP del til proteinet på interesse kan påvirke dens funktion og/ Eller subcellulær lokalisering, er det faktisk mere teoretisk end faktisk. Faktisk mange undersøgelser har klart vist, at GFP tag ikke ændrer egenskaberne af proteinet 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generation og validering af fluorescerende proteinkimærer
- Append grønt fluorescerende protein (GFP) til amino- eller carboxylterminale ender af proteinet af interesse ved anvendelse af standard rekombinante DNA strategier 13.
BEMÆRK: Selvom vi har brugt GFP udførligt, andre varianter, såsom cyan fluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP), DsRed og mCherry kan anvendes. Forbedringer i fluorofor folde effektivitet, lysstyrke og fotostabilitet bliver konstant gjort, og efterforskere bør benytte sig af den nyeste generation af konstruktioner.- Bekræfte korrekte DNA-sekvens, og sikre, at GFP-delen er i ramme med proteinet af interesse. Udfør sekventering under anvendelse af standard rekombinante DNA strategier 21.
BEMÆRK: Mange institutioner har core DNA faciliteter, som investigator opfordres til at kontakte for yderligere oplysninger. - For enkelt- eller dobbeltværelser pass membranproteiner, genererebåde amino- og carboxylterminale versioner af fusionsproteinerne 19.
- Til multi-spænder over proteiner indsætte GFP inden formodede extramembrane loops, samt terminaler. Vær særlig forsigtig, når generering transmembrane kimærer med fluorescerende fusionsprotein bundet til aminoterminalen af målproteinet signalsekvenser ofte spaltes ved proteolyse, når proteinet er passeret gennem ER translocon.
- I tilfælde af bevarede signalsekvenser indsætte fluorescerende fusionsprotein distalt spaltningsstedet således at generere et modent protein, der indeholder en intakt aminoterminalt mærkede fluorescerende protein. Ansæt standard rekombinante DNA strategier til generering af kimærer 21.
- Bekræfte korrekte DNA-sekvens, og sikre, at GFP-delen er i ramme med proteinet af interesse. Udfør sekventering under anvendelse af standard rekombinante DNA strategier 21.
- Bestemme tilstedeværelsen af tilstrækkelig passende lokaliseret fluorescerende signal i cellelinjen af interesse.
- Overhold celler under epifluorescens mikroskopi ved hjælp af den iboende fluorescens af GFP under er passende,spiste filtersæt betingelser. For GFP filtersæt, der omfatter 510-560 nm, bekræfter, at de korrekte filtre anvendes til fluoroforen anvendes.
BEMÆRK: Et tilstrækkeligt signal opnås, når vurdering øjet giver en stærk nok signal at den cellulære struktur, inden for hvilken signalet bosat nemt løses over baggrunden. Desuden farvningsmønster af GFP-protein bør være i overensstemmelse med markører for passende organel, og fortrinsvis er identisk med det native umærket protein.
- Overhold celler under epifluorescens mikroskopi ved hjælp af den iboende fluorescens af GFP under er passende,spiste filtersæt betingelser. For GFP filtersæt, der omfatter 510-560 nm, bekræfter, at de korrekte filtre anvendes til fluoroforen anvendes.
- Bestem, om en stabil eller transient transfektion fremgangsmåde vil blive anvendt baseret på protein, der evalueres.
BEMÆRK: Stabile transfektanter generelt råd lavere udtryk end forbigående systemer. Skønt transient ekspression giver ekspression på højt niveau af proteiner og stigning signalintensitet (~ 5-24 timer efter transfektion, afhængigt af protein), kan det også føre til overekspression artefakter såsom protein aggrdelegeringsaftaler eller mætning af protein målretning veje, hvilket fører til fejlagtig subcellulær lokalisering.
2. Transfektion af celler og Cell Culture
BEMÆRK: En række af celler er modtagelige for FPP analyse, herunder HEK293-, HeLa-, COS-7 og CHO-celler 14. Den følgende beskrivelse er baseret på ekspression membranproteiner i HEK293-celler.
- Grow humane embryonale nyreceller (HEK293) som adhærerende monolag i 6 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 1% natriumpyruvat og 250 ug / ml penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO 2. Udfør alt arbejde med celler i en laminar strømning vævskultur hætte. Grow celler i dyrkningsmedium, indtil ~ 80% sammenflydende i en T-75-kolbe.
- Transficerer celler ved hjælp af enhver standard højeffektiv, lav toksicitet transfektionsmetode, herunder lipid-, virus- eller elektroporation-baserede teknologier til at generere transient eller stabil ekspression. Typisk 2 ug plasmid DNA per 1 x 10 6 celler giver god reproducerbar proteinekspression. Oprethold celler til 5-48 timer i en passende vævskulturmedium ved 37 ° C i en CO 2 kunne vævskulturinkubator.
- Overvåg celler til ekspression af GFP-fusionsproteinet ved hjælp af epifluorescens-mikroskopi, ved hjælp af iboende fluorescens signal af GFP, ved hjælp af passende filtersæt ifølge producentens protokol. Fluorescenssignal normalt når et maksimum inden 24-72 timer efter transfektion. Brug celler, når fluorescens signal når et maksimalt niveau. Overvåg protein ekspressionsniveauer ved immunoblot-analyse under anvendelse af antistoffer rettet mod enten proteinet af interesse eller GFP-delen.
- For eksperimentelle analyse plade celler på coatede dækglas. Se enten under en live-cell konfiguration eller efter fiksering og montere på mikroskopi dias. Plate celler for at opnå 60% -80% konfluens inden for 24-48 timer.
- Coat dækglas med poly-lysin-opløsning (0,1 mg / ml), således at hele overfladen er dækket. Inkuber i 30 minutter under en ultraviolet lys ved stuetemperatur, efterfulgt af 60 minutter i en cellekultur inkubator ved 37 ° C. Fjern overskydende polylysin og skyl dækglassene i PBS 3 gange.
- Alternativt plade cellerne på en kamre cover-glas bestående af cellekultur plader med en optisk glasbund at tillade direkte billeddannelse med olie-nedsænkning mål. Selve mikroskopi setup afhænger af det udstyr til rådighed for investigator, men bør være i stand til hurtig løsning ændringer. Afhængigt af celletypen og celleform bør celler være omkring 60-90% konfluente på tidspunktet for FPP-assayet.
3. Fluorescens mikroskopi Setup
- Brug en høj numerisk apertur (NA) olieimmersionsobjektiv for maksimal signal indsamling og rumlig opløsning, såsom en 60X, 1,42 NA olieimmersion mål. Brug the følgende lasere til at stimulere fluoroforer: Argon gas 488 nm (GFP og YFP) og 561 diode (RFP mCherry).
- Bestem den optimale eksponering, gain og opsamling på billeder for hver konstruktion. Juster laser intensitet og eksponeringstid for at minimere fotoblegning (se trin 7.1.2).
- For studier ved hjælp af flere fluoroforer (fx en opløselig markør for membranpermeabilisering i samråd med et membranprotein markør), vælge passende filter sæt til at minimere signal krydstale og maksimere signal-til-støj-forhold.
4. Etablering af optimale betingelser for Plasma membranpermeabilisering
- Fjern celledyrkningsmediet fra celler, der udtrykker kun opløselige fluorescerende proteiner (f.eks EGFP, DsRed). Vask cellerne 3 gange (1 minut hver) i KHM buffer (110 mM kaliumacetat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Udfør forsøg med celler og alle reagenser ved stuetemperatur.
- Place celler on dækglas (se trin 2.4) i KHM buffer på et fluorescensmikroskop fase og indsamle det første billede, der repræsenterer kontrol "ikke-permeabiliseret 'stadium.
- For selektivt at permeabilisere plasmamembranen, tilsæt digitonin (30 uM) i KHM buffer til cellerne. Perfundere celler med buffer (buffer + digitonin) med en hastighed på 5 ml / min for 10-60 sek.
- Bestemme den optimale digitonin koncentration ved gradvist at øge koncentrationen af digitonin. Den optimale digitonin koncentration opnås, når der er fuldstændigt tab af fluorescenssignal fra opløselig EGFP inden 10-60 sek digitonin ansøgning. For mange celler anvendelse af 10-50 pM digitonin er tilstrækkelig til at permeabilisere cellemembranen.
- For alle programmer bruger den lavest mulige koncentration af digitonin. Saml billeder efter digitonin permeabilisering for permeabiliserede baggrund signal.
- Bekræft, at GFP-protein-kimære af interesse er membran igreret ved at bekræfte cellulær retention af fluorescenssignalet efter digitonin permeabilisering af plasmamembranen 16.
- Udtrykke en organel specifik fluorescerende protein 23. Mitokondrielle proteiner fungerer godt i denne henseende 16, f.eks pDsRed2-Mito vektor. Bestemme optimale ekspressionssystemer betingelser som beskrevet i trin 2.1.
- Bekræft, at digitonin koncentration er egnet til den celletype ansat ved at sikre, at morfologien af intracellulære organeller forbliver konstant over længere tids påvirkning (op til 60 min) til digitonin.
BEMÆRK: Brug standard immunfluorescensmikroskopi protokoller anvendelse af antistoffer mod forskellige cellulære rum, såsom lysosomer (f.eks LAMP1), Golgi (f.eks TGN38), endoplasmatiske reticulum (f.eks calnexin), endosomer (f.eks Rab5), mitochondrier (f.eks cytokrom c). Hvis intracellulær organel morfologi / integritet ændres dramatisk over 60 min, er det sandsynligt, at digitonin koncentration var for høj, og kræver en reduktion i digitonin koncentration og / eller eksponeringstid.
BEMÆRK: Digitonin er giftig ved indånding og ved kontakt med huden. Bær egnede personlige værnemidler (PPE).
5. Protease Behandling af fluorescerende proteiner
- Vask cellerne i KHM buffer og derefter tilføje protease (proteinase K, 50 ug / ml i KHM buffer) direkte på cellerne. Perfundere celler ved en strømningshastighed på 5 ml / min ved hjælp af en tyngdekraft fodret perfusionssystem kontinuerligt bad præparatet.
- Butiksløsninger i 50 ml sprøjter og polyethylen slange tilsluttet uafhængige reservoirer til en manifold med et enkelt udløb ved badet (5 ml / min flow rate). Placer en suge pipette at opretholde en konstant (0,5 ml) bad volumen og opnå opløsning udveksling ved manuelt at skifte mellem perfusion reservoirer.
- Saml billeder at afgøre, om fluorescent signal fortsætter eller nedbrydes. Et tab af> 90% af den oprindelige signal intensitet over 30-60 sek er i overensstemmelse med proteolytisk nedbrydning af GFP-protein-kimære (se Repræsentative resultater).
- Hvis der ikke signal der iagttages nedbrydning med proteinase K, når der forventes et sådant tab, udskifte proteinase K-opløsning med trypsin (4-8 mM) i KHM buffer. Hvis det er nødvendigt, anvende en blanding af proteinase K og trypsin. Der er ikke behov for at standse proteaseaktivitet.
6. alternativ tilgang til plasmamembranproteiner med eksterne domæner
- For plasmamembranproteiner, udføre analysen for eksterne fluorescerende proteiner kimærer før digitonin permeabilisering. Vask cellerne på dækglas i KHM buffer (5 ml / min x 3 min), og tage et billede for pre-proteasebehandling og kvantificere pre-protease fluorescens signal som i trin 7.
- Bring celler til protease (proteinase K, 50 ug / ml eller trypsin 4-8 mM i KHM puffer) i than fravær af digitonin ved perfusion af cellerne med KHM medier indeholdende protease (strømningshastighed 5 ml / min). Saml billeder af fluorescerende protein til at bestemme, hvor hurtigt signalet forsvinder eller hvor længe signalet fortsætter.
- Før digitonin permeabilisering, slukke alle proteaseaktivitet, ved vask af cellerne tre gange (1 minut hver) i celledyrkningsmedier indeholdende 10% serum (FBS).
- Vask cellerne ved perfusion med KHM puffer (strømningshastighed på 5 ml / min) i 2 minutter. Anskaf en pre-permeabilization billede. Permeabilisere cellemembranen som beskrevet i trin 4.
- Saml billeder følgende protease tilsætning som beskrevet i trin 5.
7. Image Analysis
- Brug et omvendt mikroskop stand til "levende celler" optagelse, hvor der kan overvåges tab af fluorescens signal i realtid. For løbende overvågning, beskæftiger identiske parametre (eksponeringstid, gain, laser intensitet, etc.).
- Bestem experimental parametre ved at observere fluorescens signal fra GFP-proteinet af interesse under kontrol betingelser (dvs. KBH buffer alene). Juster gain, laser intensitet og eksponering indstillinger tid på computeren-drevne mikroskop for at sikre, at der ikke er nogen nævneværdig tab af signal intensitet over en 10-20 minutter.
BEMÆRK: Signal intensitet er ikke en absolut værdi, men er baseret på mikroskopet, og indstillinger til rådighed for hvert PI. Overvåge ændringer i relative fluorescens intensitet.
- Bestem experimental parametre ved at observere fluorescens signal fra GFP-proteinet af interesse under kontrol betingelser (dvs. KBH buffer alene). Juster gain, laser intensitet og eksponering indstillinger tid på computeren-drevne mikroskop for at sikre, at der ikke er nogen nævneværdig tab af signal intensitet over en 10-20 minutter.
- Alternativt behandle celler på sæt tidspunkter i digitonin efterfulgt af protease, og løse celler før montering på dækglas til billeddannelse. Bestem tidspunkter empirisk følgende procedurer i trin 4 og 5. Til den indledende undersøgelse, starte ved 0, 30, 60, 120 og 300 sekunder efter tilsætning af digitonin eller protease.
- Fix celler (20 minutter ved stuetemperatur) under anvendelse af en tilstrækkelig mængde fikseringsmiddel (3,7% paraformaldehyd i PBS) til fuldt ud at dykke the celler.
- Quench resterende paraformaldehyd ved skylning celler med PBS indeholdende 20 mM glycin (3 x 5 min).
- Mount dækglas ved at fjerne overskydende væske fra dækglasset og invertere dækglasset på 50 pi montering medier på et glas objektglas til billeddannelse. Lad dias tørre natten over, før billeddannelse.
- Saml fluorescens mikroskopi billeder (under de passende filtre sætter forenelig med fluorophor anvendes) ved hjælp af video image capture funktion på en computer kontrolleret fluorescensmikroskop.
- Kvantificere fluorescerende signalintensiteter som en funktion af inkubationstid tilstand. Opnå den gennemsnitlige pixel intensitet i en region af interesse (ROI), der omslutter en individuel celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasma membranpermeabilisering
Effektiv plasma membranpermeabilisering bestemmes ved anvendelse af opløselige fluorescerende proteiner (f.eks GFP, DsRed) (trin 4). Disse proteiner, når det udtrykkes i celler, er fri til at diffundere i cytosolen, og går tabt, når plasmamembranen er permeabiliseret under anvendelse af digitonin (figur 2). En fuldstændig forsvinden af fluorescerende signal bør ske inden 10-60 sek digitonin ansøgning. Bekræftelse af, at proteinet af interesse er forbundet med intracellulære organeller opnås ved at bemærke lagring af fluorescerende signal efter digitonin permeabilization.
Proteasebehandling
Efter en vellykket generation af fluorescerende kimærer mellem proteinet af interesse og det fluorescerende protein (GFP, YFP, etc.) (trin 1) og ekspression af det fluorescerende protein i celler (trin 2), behandling af permeabiliserede celler med protease vil give oplysninger om, hvorvidt fluoroforen (og dens tilstødende proteindomæne) er i cytosolen og tilgængelig for proteasefordøjelse, eller ligger inden for en organel lumen og dermed beskyttet mod proteasespaltning (trin 4). LMTK2 er en membran forankret kinase 15, og fluorescens protease beskyttelse assays er blevet anvendt til at bestemme sin membran topologi 16. Carboxylgruppen hale LMTK2 blev fusioneret til GFP og udtrykt transient. Fluorescerende LMTK2-GFP signalet forsvandt hurtigt efter tilsætning af proteinase K, der angiver placeringen af carboxylterminalen af LMTK2 er placeret inden i cytosolen (figur 3). Caveolin-GFP (CAV1-GFP) 17 er et plasmamembranprotein med et GFP-bundet til den cytosoliske domæne. Som med LMTK2 signalet fra caveolin-YFP digitonin ufølsom, men følsomt over for den efterfølgende tilsætning af protease (figur 3).
t "> luminale opløselige proteiner kan også identificeres ved anvendelse af FPP-protokollen. I dette eksempel er ER retention signal KDEL vedlagt DsRed. I modsætning til de signaler fra LMTK2 og caveolin, signalet fra KDEL-DsRed er ufølsom over for både digitonin og protease, som digitonin er i stand til at permeabilisere ER-membranen og det fluorescerende signal er beskyttet mod proteasenedbrydning. Et eksempel på en membran domæne placeret i hulrummet i en organel er givet ved den mitokondriske protein er subunit VIII af human cytochrom c-oxidase 18,19. pDsRed-MIT, koder for rødt fluorescerende protein fra Discosoma sp. fusioneret til mitochondrial målsekvens fra cytochrom c-oxidase. I celler, der udtrykker pDsRed-Mito er fluorescerende signal ses i cellen. Efter digitonin permeabilization, fluorescenssignalet forbundet med pDSRed-Mito forbliver stabil. Desuden efter tilsætning af proteinase K, fluorescens forbundet med pDsRed-Mito fortsætter, conkonsistent med fluoroforen i mitokondrierne og ikke udsat for cytosolen og dermed beskyttet mod proteaseaktivitet (figur 3).Ekstracellulære domæner
Protease behandling af ikke-permeabiliserede celler bør hurtigt slukke fluorescenssignalet når det fluorescerende bundet til et membranprotein står cellen ydre. Den glycosylphosphatidylinositol (GPI) forankret protein PrP 20 tjener som et godt eksempel. En konstruktion indeholdende gult fluorescerende protein (YFP) fastgjort til aminoterminalen af PrP (YFP-PRP) 21,22, en generøs gave fra Dr. Ehud Cohen, fra Hebrew University i Jerusalem. Før protease behandling, det fluorescerende signal fra det ekstracellulære YFP var lyse (figur 4). Efter proteasebehandling den ekstracellulære fluorescenssignal forsvandt hurtigt.
Tid Overvejelser
Figur 1: Selektiv permeabilisering af plasmamembranen (a) cartoon model af FPP-assayet viser en enkelt celle går gennem forsøgsprotokol.. Den røde symbol repræsenterer rødt fluorescerende protein (RFP) i cytosolen, udgør de grønne og blå symboler transmembrane proteiner med fluorescerende tag enten står over for organel lumen (blå) eller cytosol (grøn). (B) Efter digitonin permeabilisering, gratis cytosoliskeproteiner diffunderer væk, hvilket reducerer RFP signal. (C) Efter anvendelse af proteinase K, er det cytosoliske grønne signal nedbrudt, mens den blå signal er beskyttet mod nedbrydning ved sin tilstedeværelse i organel lumen.
Figur 2: Digitonin behandling permeabiliserer plasmamembranen og frigiver cytosolisk GFP (a) tegning af en enkelt celle, der udtrykker opløselig GFP, før og efter digitonin behandling.. (B) Digitonin behandling permeabiliserer plasmamembranen og frigiver cytosolisk GFP. En region af interesse (ROI) trækkes omkring CHO celler, der udtrykker opløselig GFP. Efter behandling med digitonin (50 uM) blev billeder taget før og efter tilsætning af digitonin, og ved de angivne tidspunkter. Scale bar, 10 um. (C) kvantificering af fluorescence intensiteter af fuld tid-serien (AF) er vist.
Figur 3: FPP afslører topologi endosomale protein LMTK2 (a) Cartoon af FPP viser tab af DsRed (røde kugler), men fastholdelse af LMTK2-GFP (grønne bolde) efter digitonin permeabilisering, efterfulgt af tab af signal på anvendelse af proteinase K. . (b) FPP assay af CHO-celler, der udtrykker DsRed og LMTK2-GFP. Billeder blev taget før og efter digitonin behandling og efter proteinase K som angivet. Scale bar: 10 pm.
Figur 4: (A) cartoon model viser topologien og placeringen af YFP-PrP (grøn) før og efter proteinase K-behandling. CHO-celler, der udtrykkerYFP-PrP blev underkastet proteinase K i 100 sek. (B) billeder taget før og efter proteasebehandling er vist på de angivne tidspunkter. YFP-PrP signal blev helt tabt efter protease i fravær af digitonin. Gul viser region af interesse (ROI), der anvendes til kvantificering vist i (c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den korrekte orientering og topologi membranproteiner er afgørende for deres rette funktion. Til trods for vigtigheden af at forstå membranprotein topologi, der er mange proteiner, hvortil sådanne oplysninger er helt mangler. FPP giver en nem og effektiv måde at bestemme membranprotein topologi, og en, der kan udføres af de fleste laboratorier. Den FPP tilgang giver betydelige fordele i forhold til tidligere metoder til bestemmelse protein topologi. For eksempel er der ikke behov for at have et panel af flere antistoffer rettet igen forskellige domæner af proteinet af interesse 31. I mange tilfælde sådan et panel af antistoffer er ikke tilgængelig; dette gælder især for nyligt klonede proteiner. Som analysen kan udføres på en enkelt celle niveau, der ikke kræves store biokemiske mængder protein for downstream biokemiske analyser, f.eks proteolyse eller SDS-PAGE. Faktisk er relativt få transficerede celler nødvendig for utvetydigt at tildeleen topologi til proteinet af interesse. Dette er vigtigt, hvis investigator vurderer topologi på svært at transficere celler, såsom epitelceller eller neuroner. Simpel tilsætning af et GFP-delen til enten carboxyl- eller aminoterminalen af proteinet kan let opnås ved anvendelse af talrige kommercielt tilgængelige GFP indeholdende plasmider, og i de fleste tilfælde er tilsætningen af GFP-delen ikke hæmme korrekt proteinfoldning eller subcellulære lokalisering. Men investigator skal bekræfte, at dette er sandt for deres protein, da der er potentiale for GFP at påvirke protein 23,24. Mange proteiner er allerede tilgængelig som GFP fusionsproteiner, hvilket kræver minimal ekstra indsats for at indlede topologiske studier. Selvom løbende overvågning af fluorescens giver en hurtig og effektivt middel til at bestemme protein topologi, for efterforskerne, der ikke har adgang til live-cell imaging udstyr, er analysen let tilpasses til en formaldehyd fiksering appskalle anvendelse af standard epifluorescens af konfokal mikroskopi.
Der er dog nogle begrænsninger i anvendeligheden af FPP-analysen. Skulle proteolytisk processering eller andre post-translationelle modifikationer resulterer i lidt forskellige membran topologier for proteinet af interesse, vil FPP-assayet kun vurdere den dominerende protein form. Desuden kan tilføje et GFP del til terminalerne af nogle proteiner påvirke deres funktion, for eksempel interferere med carboxylterminale PDZ-domæner. Alligevel FPP-assayet giver en enkel fremgangsmåde til oprettelse af orientering og topologi mange membranproteiner.
Det er afgørende, at de første forsøg udføres for at bestemme den korrekte koncentration af digitonin at frigive intracellulære opløselig GFP. Hvis GFP ikke diffundere ud af cellen efter digitonin ansøgning, bør koncentrationen af digitonin gradvist øges, for at bestemme den minimale koncentration reves for at lette frigivelsen. Imidlertid vil for meget digitonin påvirke morfologien af intracellulære vesikler, hvis integritet bør bekræftes efter digitonin ansøgning. Organeller i nogle celler er meget følsomme og kan kræve en mere stabiliserende buffer sammensætning 25. Hvis fluorescenssignalet fra kimæren blive evalueret er lav, at vælge en enkelt klon med en højere ekspressionsniveau, eller udførelse af en transient ekspression, ofte vil øge signalstyrken til et acceptabelt niveau. Opsøge nyere, bør lysere plasmider også overvejes med lavt signal intensitet. Endelig bør der sikres, at tabet af signal set skyldes protease nedbrydning og ikke at fotoblegning af fluoroforer. Reduktion lysintensitet og / eller erhvervelse sats vil bidrage til at reducere fotoblegning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
