Introduction
Le membrane plasmatiche, nonché numerose membrane intracellulari, servono come barriere che separano due compartimenti acquosi. Nel caso della membrana plasmatica, la separazione è tra l'esterno e l'interno della cella; per organelli intracellulari che è tra il citoplasma e il lume organelli. Ad esempio, la membrana del reticolo endoplasmatico (ER) separa un ambiente ossidante all'interno del lume del ER da un citosolico riducendo ambiente 1. Le proteine di membrana sono sintetizzate sui ribosomi ER-associata, e raggiungere il loro topologia finale entro la membrana ER 2. L'acquisizione di un adeguato orientamento membrane e topologia per le proteine è fondamentale per la loro normale funzione. Topologia corretta permette pertinenti domini di proteine di membrana per interagire con i partner di legame, permette critici modificazioni post-traduzionali a verificarsi, e nel caso delle proteine di membrana di plasma, permette alla cellula di interagire con e rispondere to suo ambiente. Per apprezzare appieno la funzione di una proteina di membrana, è chiaramente indispensabile sapere come tale proteina è orientato rispetto alla membrana entro cui risiede, cioè la sua topologia membrana. Oltre alla acquisizione di conoscenze scientifiche di base, comprendere la topologia di una proteina di membrana e quali aspetti di una superficie proteine sono esposte ad ambienti differenti ha segnato implicazioni cliniche poiché proteine di membrana sono la maggioranza dei bersagli farmacologici 3. Fino a poco tempo, approcci per determinare la topologia di proteine di membrana hanno richiesto un notevole investimento di tempo e di denaro o hanno richiesto reagenti che sono difficili da trovare.
Sia approcci sperimentali e in silico sono stati impiegati per determinare la topologia di proteine di membrana che risiedono all'interno della membrana plasmatica. Dal momento che le prime previsioni di domini di membrana attraversa basati sulla idrofobicità valutato di indiviaminoacidi doppio 3, numerosi algoritmi predittivi sono ora disponibili su internet, e semplicemente richiedono la conoscenza della sequenza aminoacidica della proteina. Tuttavia, le ipotesi sono spesso al centro di tali programmi di modellazione, ipotesi che possono portare alle assegnazioni errate di topologia 4,5. Inoltre, mentre le previsioni basate su computer è possibile assegnare provvisoriamente le regioni che vanno a membrana, che non sempre determinano se la amino o carbossi-terminale di proteine sono nel citoplasma, lume organelli o esterno cella. Anche con maggiore potenza di calcolo, e l'uso di algoritmi di apprendimento macchina 6, tali dati è ancora un modello, e deve essere convalidato utilizzando i dati acquisiti sperimentalmente. Determinazione diretta sperimentale di topologia di membrana è stata effettuata utilizzando pannelli di anticorpi monoclonali con epitopi noti distribuite in tutta la proteina, in cui è stata effettuata la valutazione della loro immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione cellulare. Questoapproccio richiede una serie di anticorpi, che non possono essere disponibili per la proteina di interesse.
Una strategia alternativa è quella di progettare etichette epitopi quali myc o emoagglutinina (HA) in varie località in tutta la proteina, ancora una volta seguita da determinazione della immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione della membrana. Oltre ai tag immunogenico, tag enzimatici (compresi fosfatasi alcalina, β-galattosidasi, o β-lattamasi) e modificazioni chimiche come la scansione cisteina sono stati tutti impiegati per determinare membrana proteica topologia 7,8. Un ulteriore metodo impiegato per la mappatura topologica delle proteine di membrana plasmatica si basa su un approccio leggermente diverso per tag epitopi. In questo metodo la sequenza di tag è la sequenza di consenso glicosilazione N-linked NXS / T. Poiché glicosilazione avviene solo quando tale sequenza è presente nel lume della via biosintetica, la presenza del tag in un luminale controun compartimento citosolico è facile osservare come spostamento di massa su gel SDS-PAGE. Tale approccio è stato applicato al canale ionico multispanning CFTR 9. Mentre tutti questi approcci sono stati utilizzati, è chiaro che tutti richiedono notevoli investimenti nel campo della biologia molecolare per generare e la sequenza dei costrutti molteplici.
Per determinare le informazioni topologiche riguardanti proteine transmembrana situati all'interno organelli intracellulari ha dimostrato di essere più impegnativo. L'applicazione di tecnologie basate fluorescenza tuttavia, ha fatto la determinazione della topologia di membrana molto più semplice. La tecnica di bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) si basa sulla interazione tra due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente, ripristinando le proprietà fluorescenti di quella proteina 10. Sebbene inizialmente descritto per determinare le interazioni proteina-proteina in vivo 10, questo approccio è anche stato utilizzatoper determinare membrana proteica topologia nelle cellule vegetali 11. Tuttavia questo approccio è anche tempo intenso in quanto richiede la generazione non solo di proteine di fusione con la proteina di interesse, ma anche una varietà di proteine di fusione mirati al citosol o organelli lume, e richiede la cui conoscenza intracellulare membrane proteina di interesse risiede in .
Un approccio alternativo alla semplice determinazione topologia proteina di membrana è stato descritto 12. Il saggio di fluorescenza proteasi protezione (FPP) richiede la generazione di una proteina di fusione tra GFP e il gene di interesse. L'approccio è basato sulla relativa accessibilità di proteasi non specifici per la frazione GFP; a seconda che GFP è protetto dalla proteolisi risiedendo nel lume di organelli intracellulari o è esposto alla proteolisi essendo presenti nel citosol. Pertanto, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia citoplasma, sarà esposto aattività proteasica e il segnale di fluorescenza persi. Al contrario, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia un ambiente 'protetto' dalla proteasi (come il lume Golgi) allora il segnale di fluorescenza persisterà.
Per consentire proteasi di entrare nella cellula, ma non immettere compartimenti intracellulari membrana farmaco vincolante colesterolo digitonina viene utilizzato. Il colesterolo è sterolo dominante in vertebrati, ed è specificamente arricchito nella membrana plasmatica rispetto al compartimenti intracellulari. La tossina glicoside, digitonina, viene estratto dalla pianta Digitalis purpurea. Digitonin ha un'affinità per colesterolo ricchi membrane, dove si porta a membrana selettiva permeabiliztion 14,16 (figura 1). Oltre a consentire l'uscita dei piccoli componenti citosolici, permeabilizzazione digitonina permette anche l'ingresso di molecole esogene quali proteinasi K o tripsina. Il protocollo FPP sfrutta il fact che la membrana plasmatica contiene fino al 80% del colesterolo cellulari 17, mentre altri organelli, come ER, Golgi, endosomi, i mitocondri, che hanno molto basso contenuto di colesterolo, rimangono intatti 14. L'incorporazione selettiva di colesterolo nella membrana plasmatica è stata osservata in molte cellule eucariotiche, permettendo l'uso di digitonina-dipendente permeabilizzazione della membrana plasmatica in tali diverse specie eucariotica come S. cerevisiae di umana 14,18. Il dosaggio FPP fornisce un mezzo semplice, rapido e abbastanza robusti di determinazione (a) se una proteina è legato alla membrana / o associati liberamente diffusibile nel citosol e (b) che dominio di una proteina di membrana affronta citosol o organelli lumen. Qualora una proteina di membrana avere più orientamenti, il segnale sorgerà dalla forma dominante e non verrà rilevato forme minori. Mentre ci può essere qualche preoccupazione che l'aggiunta di una frazione GFP alla proteina di interesse può influire sulla sua funzione e/ O localizzazione subcellulare, questo è in realtà più teorica che reale. Infatti molti studi hanno chiaramente dimostrato che il tag GFP non altera le proprietà della proteina 19,20.
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Protocol
1. Generazione e convalida delle Chimere proteina fluorescente
- Append proteina fluorescente verde (GFP) alla ammino o carbossile termini della proteina di interesse utilizzando strategie di DNA ricombinante standard di 13.
NOTA: Anche se abbiamo utilizzato ampiamente GFP, altre varianti come la proteina ciano fluorescente (PCP), proteina fluorescente gialla (YFP), DsRed e mCherry possono essere impiegati. Miglioramenti in fluoroforo pieghevole efficienza, luminosità e fotostabilità vengono costantemente effettuati, e gli investigatori devono avvalersi dei costrutti di ultima generazione.- Confermare sequenza di DNA corretta e assicurarsi che la frazione GFP è in cornice con la proteina di interesse. Eseguire sequenziamento utilizzando strategie di DNA ricombinante normali 21.
NOTA: Molte istituzioni hanno servizi DNA di base, che il ricercatore è incoraggiato a contattarci per ulteriori informazioni. - Per proteine di membrana passaggio singole o doppie, generareentrambe le versioni terminali ammino- e carbossilici delle proteine di fusione 19.
- Per le proteine di multi-spanning inserire GFP all'interno di cicli extramembrane putativi, così come il termini. Prestare particolare attenzione quando si generano chimere transmembrana con la proteina di fusione fluorescenti attaccato al capolinea amino della proteina bersaglio come sequenze di segnali sono spesso spaccati dalla proteolisi una volta che la proteina è passato attraverso il translocon ER.
- Nel caso di sequenze di segnali esistenti, inserire la proteina di fusione fluorescenti distale al sito di scissione in modo da generare una proteina matura contenente una proteina fluorescente tag intatto ammino-terminale. Impiegare strategie DNA ricombinante standard per la generazione di chimere 21.
- Confermare sequenza di DNA corretta e assicurarsi che la frazione GFP è in cornice con la proteina di interesse. Eseguire sequenziamento utilizzando strategie di DNA ricombinante normali 21.
- Determinare la presenza del segnale fluorescente sufficienti opportunamente localizzata nella linea cellulare di interesse.
- Osservare le cellule sotto epifluorescenza utilizzando la fluorescenza intrinseca di GFP sotto ademangiato condizioni di filtro impostato. Per set di filtri GFP che comprendono 510-560 nm, confermano che i filtri corretti sono utilizzati per il fluoroforo impiegato.
NOTA: Un segnale sufficiente si ottiene quando la valutazione ad occhio fornisce un segnale abbastanza forte che la struttura cellulare all'interno della quale risiede il segnale viene facilmente risolto sopra sfondo. Inoltre il pattern di colorazione della proteina-GFP deve essere coerente con quello dei marcatori per la organello appropriata, e preferibilmente identica a quella della proteina nativa non etichettato.
- Osservare le cellule sotto epifluorescenza utilizzando la fluorescenza intrinseca di GFP sotto ademangiato condizioni di filtro impostato. Per set di filtri GFP che comprendono 510-560 nm, confermano che i filtri corretti sono utilizzati per il fluoroforo impiegato.
- Determinare se un approccio stabile o transiente trasfezione sarà utilizzato basa la proteina in corso di valutazione.
NOTA: trasfettanti stabili generalmente offrono bassi livelli di espressione rispetto ai sistemi transitori. Sebbene espressione transiente produce espressione elevato livello di proteine e aumento dell'intensità di segnale (~ 5-24 ore dopo la trasfezione seconda proteina), può anche portare ad artefatti iperespressione come proteine aggregation o la saturazione di proteine di targeting percorsi, portando a localizzazione subcellulare erronea.
2. Trasfezione delle cellule e colture cellulari
NOTA: Una varietà di cellule sono suscettibili di analisi FPP, tra cui HEK293, HeLa, COS-7 e cellule CHO 14. La seguente descrizione è basata su esprimenti proteine di membrana in cellule HEK293.
- Grow cellule umane embrionali renali (HEK293) come monostrati aderenti a 6 ml di Dulbecco modificato (DMEM), integrato con siero 5% fetale bovino (FBS), 1% piruvato di sodio, e 250 mg / ml di penicillina / streptomicina a 37 ° C con il 5% di CO 2. Eseguire il lavoro con le cellule in coltura tissutale cappa a flusso laminare. Grow cellule in mezzo di coltura fino ~ 80% confluenti in un pallone T-75.
- Cellule trasfettare utilizzando qualsiasi alta efficienza standard metodo trasfezione bassa tossicità, compresi lipid-, tecnologie viral- o basati elettroporazione, per generare transient o espressione stabile. Tipicamente 2 mg di plasmide DNA per 1 x 10 6 cellule dà buona espressione proteica riproducibili. Mantenere cellule per 5-48 ore in appropriate terreni di coltura tissutale a 37 ° C in un CO 2 in grado di coltura tissutale incubatore.
- Monitorare le cellule per l'espressione della proteina GFP-fusion con epifluorescenza, utilizzando il segnale di fluorescenza intrinseca di GFP, utilizzando appositi set di filtri secondo il protocollo del produttore. Segnale di fluorescenza di solito raggiunge un massimo entro 24-72 ore dopo trasfezione. Utilizzare cellule quando il segnale di fluorescenza raggiunge un livello massimo. Monitorare i livelli di espressione della proteina mediante analisi immunoblot utilizzando anticorpi diretti contro la proteina o di interesse o porzione GFP.
- Per le celle sperimentali piastra analisi su vetrini rivestiti. Visualizza sia sotto una configurazione live-cell o dopo la fissazione e montare su vetrini microscopia. Cellule piastra per raggiungere il 60% -80% di confluenza entro 24-48 ore.
- Coprioggetto Coat con la soluzione di poli-lisina (0,1 mg / ml), in modo che l'intera superficie è coperta. Incubare per 30 minuti sotto una luce ultravioletta a temperatura ambiente, seguito da 60 minuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C. Rimuovere l'eccesso poli-lisina e lavare i coprioggetti in PBS 3 volte.
- In alternativa, piastra le cellule su una copertura in vetro a camera composta da piastre di coltura cellulare con un fondo di vetro ottico per consentire l'imaging diretto con obiettivi ad immersione in olio. La configurazione effettiva microscopia dipende apparecchiature disponibili al ricercatore, ma dovrebbe essere in grado di soluzione cambia rapidi. A seconda della forma tipo di cellula e cellula, cellule dovrebbe essere circa 60-90% confluenti al momento del dosaggio FPP.
Setup 3. microscopia a fluorescenza
- Utilizzare una apertura numerica (NA) dell'obiettivo alta ad immersione in olio per la raccolta del segnale massima e risoluzione spaziale, come ad esempio un 60X, 1,42 NA obiettivo ad immersione. Usa the dopo il laser per stimolare i fluorofori: gas Argon 488 nm (GFP e YFP) e 561 diodo (RFP, mCherry).
- Determinare l'esposizione, il guadagno e la cattura tasso ottimale di immagini per ogni costrutto. Regolare intensità del laser e tempo di esposizione per minimizzare photobleaching (vedi punto 7.1.2).
- Per gli studi che utilizzano più fluorofori (ad esempio, un marker solubile per permeabilizzazione della membrana in concerto con un pennarello proteina di membrana), scegliere filtro appropriato imposta per ridurre al minimo segnale di cross-talk e massimizzare rapporti segnale-rumore.
4. Stabilire le condizioni ottimali per membrana plasmatica Permeabilization
- Rimuovere il terreno di coltura di cellule da cellule che esprimono solo proteine fluorescenti solubili (es EGFP, DsRed). Lavare le cellule 3 volte (1 min ciascuno) in tampone KHM (110 mM potassio acetato, 3 mM MgCl 2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Effettuare esperimenti con cellule e tutti i reagenti a temperatura ambiente.
- Luogo cellule on coprioggetto (vedi punto 2.4) in tampone KHM su un palco microscopio a fluorescenza e raccolgono la prima immagine, che rappresenta il controllo 'non-permeabilizzate' stage.
- Per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica, aggiungere digitonina (30 mM) in tampone KHM alle cellule. Profumato cellule con tampone (buffer + digitonina) ad una velocità di 5 ml / min per 10-60 sec.
- Determinare la concentrazione ottimale digitonina aumentando gradualmente la concentrazione di digitonina. La concentrazione digitonina ottimale si ottiene quando vi è perdita completa del segnale di fluorescenza da EGFP solubile entro 10-60 secondi di applicazione digitonina. Per molte cellule applicazione di 10-50 mM digitonina è sufficiente permeabilize membrana cellulare.
- Per tutte le applicazioni utilizzano la concentrazione più bassa possibile di digitonina. Raccogliere le immagini dopo digitonina permeabilizzazione per permeabilizzate segnale di fondo.
- Verificare che la chimera GFP-proteina di interesse è membranategrated confermando ritenzione cellulare del segnale di fluorescenza seguente permeabilizzazione digitonina della membrana plasmatica 16.
- Esprimere una proteina fluorescente organello specifico 23. Proteine mitocondriali funzionano bene in questo senso 16, ad esempio, pDsRed2-Mito vettoriale. Determinare le condizioni ottimali di espressione come descritto al punto 2.1.
- Verificare che la concentrazione digitonina è appropriato per il tipo cellulare impiegato assicurando che la morfologia di organelli intracellulari rimane costante nel prolungato (fino a 60 min) esposizione a digitonina.
NOTA: utilizzare protocolli standard di immunofluorescenza con anticorpi contro vari compartimenti cellulari, come lisosomi (es LAMPADA1), Golgi (ad esempio, TGN38), reticolo endoplasmatico (ad esempio, calnexina), endosomi (ad esempio, Rab5), mitocondri (ad esempio, citocromo c). Se organelli intracellulari modifiche morfologia / integrità drammaticamente over 60 min, è probabile che la concentrazione digitonina era troppo alta, e richiede una riduzione della concentrazione digitonina e / o tempo di esposizione.
NOTA: Digitonin è tossico per inalazione e contatto con la pelle. Indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (DPI).
5. Protease Trattamento di proteine fluorescenti
- Lavare le cellule in tampone KHM e quindi aggiungere proteasi (proteasi K; 50 mg / ml in tampone KHM) direttamente sulle celle. Profumato cellule ad una velocità di flusso di 5 ml / min usando un sistema di perfusione a gravità alimentata alla vasca continuamente la preparazione.
- Soluzioni negozio in 50 ml siringhe e tubi di polietilene collegati serbatoi indipendenti ad un collettore con una singola presa al bagno (portata 5 ml / min). Posizionare una pipetta di aspirazione per mantenere una (0,5 ml) Volume vasca costante e conseguire scambio soluzione commutare manualmente i serbatoi di perfusione.
- Raccogliere immagini per determinare se il fluorSegnale escent persiste o si degrada. Una perdita di> 90% dell'intensità del segnale iniziale tramite 30-60 sec è coerente con la degradazione proteolitica della chimera GFP-proteina (vedi Risultati rappresentativi).
- Se nessuna degradazione del segnale si osserva con proteinasi K, quando si prevede tale perdita, sostituire la soluzione di proteinasi K con tripsina (4-8 mM) in tampone KHM. Se necessario, utilizzare una miscela di proteinasi K e tripsina. Non vi è alcuna necessità di spegnere l'attività della proteasi.
6. Approccio per plasma proteine di membrana con domini esterni Alternative
- Per proteine di membrana plasmatica, eseguire il test per le proteine fluorescenti esterni chimere prima di digitonina permeabilizzazione. Lavare le cellule su vetrini in tampone KHM (5 ml / min x 3 min), e prendere una immagine per il trattamento pre-proteasi e quantificare segnale di fluorescenza pre-proteasi come al punto 7.
- Esporre le cellule di proteasi (proteinasi K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mm in tampone KHM) in tha assenza di digitonina mediante perfusione le cellule con KHM supporto contenente proteasi (portata 5 ml / min). Raccogliere immagini della proteina fluorescente, per determinare quanto velocemente il segnale scompare e per quanto tempo il segnale persiste.
- Prima permeabilizzazione digitonina, spegnere tutte le attività della proteasi, lavando le cellule tre volte (1 min ciascuno) in mezzi di coltura cellulare contenente siero 10% (FBS).
- Lavare le cellule mediante perfusione con tampone KHM (velocità di flusso di 5 ml / min) per 2 min. Acquisire un'immagine pre-permeabilizzazione. Permeabilize la membrana cellulare, come descritto al punto 4.
- Raccogliere le immagini seguenti proteasi Inoltre, come descritto al punto 5.
Analisi 7. Immagine
- Utilizzare un microscopio invertito in grado di "cellule vive" di registrazione, in cui la perdita del segnale di fluorescenza può essere monitorato in tempo reale. Per il monitoraggio continuo, impiegare parametri identici (tempo di esposizione, il guadagno, intensità laser, ecc).
- Determinare experparametri imental osservando il segnale di fluorescenza dalla GFP-proteina di interesse in condizioni di controllo (ad esempio, KBH tampone da solo). Regolare le impostazioni di tempo guadagno, intensità di esposizione laser e sul microscopio computer guidato per garantire che non vi è alcuna perdita apprezzabile di intensità del segnale in un periodo di 10-20 minuti.
NOTA: intensità del segnale non è un valore assoluto, ma si basa sul sistema microscopio e impostazioni disponibili per ciascun PI. Monitorare i cambiamenti di intensità di fluorescenza relativa.
- Determinare experparametri imental osservando il segnale di fluorescenza dalla GFP-proteina di interesse in condizioni di controllo (ad esempio, KBH tampone da solo). Regolare le impostazioni di tempo guadagno, intensità di esposizione laser e sul microscopio computer guidato per garantire che non vi è alcuna perdita apprezzabile di intensità del segnale in un periodo di 10-20 minuti.
- In alternativa, il trattamento di cellule a set punti temporali in digitonina seguito da proteasi, e fissare le cellule prima del montaggio su vetrini per l'imaging. Determinare punti di tempo a seguito empiricamente procedure nei passaggi 4 e 5. Per l'indagine iniziale, partono da 0, 30, 60, 120 e 300 sec dopo aggiunta di digitonina o proteasi.
- Fissare cellule (20 min a temperatura ambiente) con una quantità sufficiente di fissativo (3,7% paraformaldeide in PBS) per immergere completamente thcellule e.
- Quench paraformaldeide residua sciacquando cellule con PBS contenente glicina 20 mm (3 x 5 min).
- Mount coprioggetto rimuovendo il liquido in eccesso dal vetrino e invertendo il vetrino su un supporto di montaggio 50 microlitri su un microscopio Vetrini per l'imaging. Lasciare i vetrini si asciughino durante la notte prima di imaging.
- Raccogliere immagini al microscopio a fluorescenza (sotto i filtri appropriati imposta compatibile con il fluoroforo utilizzato) utilizzando la funzione di cattura dell'immagine video su un microscopio a fluorescenza computer controllato.
- Quantificare intensità di segnale fluorescente in funzione della condizione di incubazione. Ottenere l'intensità dei pixel media all'interno di una regione di interesse (ROI) che racchiude una singola cella.
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Representative Results
Plasma permeabilizzazione della membrana
Efficient permeabilizzazione della membrana plasmatica è determinato mediante l'uso di proteine fluorescenti solubili (ad esempio, GFP, DsRed) (Passaggio 4). Queste proteine, quando espresso in cellule, sono liberi di diffondere nel citosol, e vengono persi quando la membrana plasmatica è permeabilizzate con digitonina (Figura 2). Una completa scomparsa del segnale fluorescente dovrebbe avvenire entro 10-60 secondi di applicazione digitonina. Conferma che la proteina di interesse è associato organelli intracellulari è ottenuto rilevando la conservazione di segnale fluorescente seguente permeabilizzazione digitonina.
Protease Trattamento
Dopo successo generazione di chimere fluorescenti tra la proteina di interesse e la proteina fluorescente (GFP, YFP, ecc) (Fase 1) e l'espressione della proteina fluorescente in cellule (Fase 2), il trattamento cellule di permeabilizzate con proteasi forniranno informazioni sul fatto che il fluoroforo (e il suo Dominio adiacente) sono nel citoplasma e accessibile a proteasi digestione, o si trovano all'interno di un organello lume e quindi protetti da proteasi digestione (punto 4). LMTK2 è una membrana ancorata chinasi 15, e saggi di protezione di fluorescenza proteasi sono stati utilizzati per determinare la topologia di membrana 16. La coda carbossilico LMTK2 è stata fusa per GFP e ha espresso transitoriamente. Fluorescente Segnale LMTK2-GFP è stato perso rapidamente dopo aggiunta di proteinasi K, che indica la posizione del carbossile terminale LMTK2 essere situato all'interno del citoplasma (Figura 3). Caveolina-GFP (CAV1-GFP) 17 è una proteina di membrana plasmatica con GFP-frazione attaccata al dominio citosolico. Come con LMTK2, il segnale proveniente caveolina-YFP è digitonina insensibili, ma sensibile alla successiva aggiunta di proteasi (Figura 3).
t "> proteine solubili luminali possono essere identificate utilizzando il protocollo FPP. In questo esempio, il segnale di ritenzione KDEL ER viene aggiunto DsRed. In contrasto con i segnali provenienti LMTK2 e caveolina, il segnale dal KDEL-DsRed è insensibile sia digitonina e proteasi, come digitonina è in grado di permeabilize membrana ER e il segnale fluorescente è protetto dal degrado proteasi. Un esempio di un dominio di membrana situato all'interno del lume di un organello è dato dalla proteina mitocondriale è subunità VIII della citocromo c ossidasi umana 18,19. pDsRed-Mit, codifica per la proteina fluorescente rossa da Discosoma sp. fusa alla mitocondriale di targeting sequenza dal citocromo c ossidasi. In cellule che esprimono pDsRed-Mito, segnale fluorescente è visto nella cella. Dopo permeabilizzazione digitonina, il segnale fluorescente associato a pDSRed-Mito rimane stabile. Inoltre, a seguito all'aggiunta di proteinasi K, la fluorescenza associata a pDsRed-Mito persiste, concoerente con il fluoroforo nei mitocondri e non esposta al citosol e quindi protetta da attività della proteasi (Figura 3).Extracellulare Domini
Trattamento Proteasi di cellule non permeabilizzate dovrebbe spegnere rapidamente il segnale di fluorescenza quando la frazione fluorescente attaccato ad una proteina di membrana sia rivolto all'esterno delle cellule. Il glicosilfosfatidilinositolo (GPI) proteina PrP ancorato 20 serve come un ottimo esempio. Un costrutto contenente la proteina fluorescente gialla (YFP) collegato al terminale amino di PrP (YFP-PrP) 21,22, un dono generoso del Dr. Ehud Cohen, dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Prima del trattamento proteasi, il segnale fluorescente dal extracellulare YFP era luminosa (Figura 4). Dopo il trattamento della proteasi, il segnale di fluorescenza extracellulare scomparve rapidamente.
Considerazioni sui tempi
Figura 1: permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica (a) fumetto del modello del dosaggio FPP mostrando una singola cella di passare attraverso il protocollo sperimentale.. Il simbolo rosso rappresenta proteina fluorescente rossa (RFP) nel citosol, i simboli verdi e blu rappresentano proteine transmembrana con l'etichetta fluorescente sia sul lato del lume organelli (blu) o citosol (verde). (B) Dopo permeabilizzazione digitonina, citosolica gratisproteine diffondono distanza, riducendo il segnale RFP. (C) In seguito all'applicazione di proteinasi K, il segnale verde citosolico è degradata, mentre il segnale blu è protetto dalla degradazione con la sua presenza nel lume organelli.
Figura 2: trattamento Digitonin permeabilizes la membrana plasmatica e rilascia GFP citosolico (a) del fumetto di una singola cellula che esprime GFP solubile, prima e dopo il trattamento digitonina.. (B) il trattamento Digitonin permeabilizes la membrana plasmatica e rilascia GFP citosolico. Una regione di interesse (ROI) è disegnato intorno cellule CHO che esprimono GFP solubile. Dopo il trattamento con digitonina (50 pM), le immagini sono state prese prima e dopo l'aggiunta di digitonina, e nei punti temporali indicati. Bar Scala, 10 micron. (C) La quantificazione del fluoreintensità scence del tempo pieno-series (AF) è mostrato.
Figura 3: FPP rivela la topologia della proteina LMTK2 endosomal (a) fumetto di FPP mostra perdita di DsRed (palle rosse), ma la ritenzione di LMTK2-GFP (palle verde) seguente permeabilizzazione digitonina, seguita da perdita di segnale sull'applicazione della proteinasi K. . (b) FPP dosaggio di cellule CHO che esprimono DsRed e LMTK2-GFP. Le immagini sono state prese prima e dopo il trattamento digitonina, e dopo proteinasi K, come indicato. Scala bar: 10 micron.
Figura 4: (a) modello di cartone animato che mostra la topologia e la posizione di YFP-PrP (verde) prima e dopo il trattamento proteinasi K. Cellule CHO che esprimonoYFP-PrP sono stati sottoposti a proteinasi K per 100 sec. (B) immagini scattate prima e dopo il trattamento della proteasi sono indicati secondo gli orari indicati. Segnale YFP-PrP era completamente perso dopo proteasi in assenza di digitonina. Spettacoli Yellow regione di interesse (ROI) utilizzato per la quantificazione mostrato in (c).
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Discussion
L'orientamento e la topologia corretta delle proteine di membrana è essenziale per il loro corretto funzionamento. Nonostante l'importanza di comprendere la topologia proteina di membrana, ci sono molte proteine per i quali i dati sono del tutto carenti. FPP fornisce un modo semplice ed efficace per determinare topologia proteina di membrana, e uno che può essere eseguita dalla maggior parte dei laboratori. L'approccio FPP offre vantaggi significativi rispetto ai metodi precedenti per la determinazione della topologia delle proteine. Ad esempio, non è necessario avere un pannello di anticorpi diretti nuovamente multipli vari domini della proteina di interesse 31. In molti casi un tale pannello di anticorpi non è disponibile; questo è particolarmente vero per le proteine di nuova clonati. Come analisi può essere eseguita a livello di singola cellula, grandi quantità di proteine biochimiche non sono richiesti per biochimica valle analisi come proteolisi o SDS-PAGE. Infatti, sono necessari relativamente poche cellule trasfettate assegnare senza ambiguitàuna topologia per la proteina di interesse. Questo è importante se il ricercatore sta valutando topologia in cellule di difficile trasfezione come le cellule epiteliali o neuroni. Semplice aggiunta di una frazione GFP a uno carbossile o ammino terminale della proteina può essere facilmente ottenuto utilizzando numerosi GFP disponibile in commercio contenente plasmidi, e nella maggior parte dei casi, l'aggiunta della frazione GFP non ostacola il corretto ripiegamento della proteina o localizzazione subcellulare. Tuttavia, l'investigatore deve confermare che questo è vero per loro proteine, in quanto vi è il potenziale per GFP influenzare la proteina di interesse 23,24. Molte proteine sono già disponibili come proteine GFP fusione, richiedendo così il minimo sforzo supplementare per avviare studi topologici. Anche se il monitoraggio continuo della fluorescenza fornisce un mezzo rapido ed efficiente per determinare la topologia di proteine, per gli investigatori che non hanno accesso a live-cell apparecchiature di imaging, il test viene prontamente adattato ad una app fissaggio formaldeidescarafaggio con epifluorescenza standard microscopia confocale.
Ci sono tuttavia alcune limitazioni all'applicabilità del test FPP. Dovrebbe proteolitici trasformazione, o altre modificazioni post-traslazionali dar luogo a diverse topologie a membrana per la proteina di interesse, il test FPP solo valutare la forma della proteina dominante. Inoltre, aggiungendo un residuo GFP al capolinea di alcune proteine può influenzare la loro funzione, ad esempio interferire con domini PDZ terminale carbossilico. Tuttavia, il saggio FPP offre un approccio semplice per stabilire l'orientamento e la topologia di molte proteine di membrana.
E 'fondamentale che gli esperimenti iniziali essere eseguiti per determinare la corretta concentrazione di digitonina rilasciare GFP solubile intracellulare. Se la GFP non si diffonde fuori dalla cella seguente applicazione digitonina, la concentrazione di digitonina va aumentata gradualmente, per determinare la minima concentrazione di reallestimenti studiati per facilitare il rilascio. Tuttavia, troppo digitonina influenzerà la morfologia di vescicole intracellulari, la cui integrità Occorre confermare seguente applicazione digitonina. Organelli in alcune cellule sono molto sensibili e possono richiedere un più stabilizzante composizione del buffer 25. Se il segnale di fluorescenza della chimera corso di valutazione è bassa, la selezione di un singolo clone con un livello di espressione superiore o eseguendo una espressione transiente, spesso aumentare la forza del segnale ad un livello accettabile. Ricerca di recente, plasmidi brillanti dovrebbero essere considerati con bassa intensità di segnale. Infine, occorre prestare attenzione a garantire che la perdita del segnale visto è dovuta alla degradazione proteasi e non photobleaching di fluorofori. Ridurre l'intensità della luce e / o velocità di acquisizione contribuirà a ridurre photobleaching.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
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