Introduction
세포막뿐 아니라 수많은 세포 막은, 수성 두 구획을 분리 장벽의 역할을한다. 세포막의 경우, 분리와 외부 셀의 안쪽이고; 세포 내 소기관 것은 세포질 소기관 루멘 사이이다. 예를 들어, 소포체 (ER) 멤브레인을 저감 한 환경 세포질에서 ER의 루멘 내 산화성 환경을 분리한다. 막 단백질은 ER-관련 리보솜에서 합성하고, ER 막 2 내에서 최종 토폴로지를 얻을 수있다. 단백질에 적합한 막 방향 및 토폴로지의 인수는 정상적인 기능을 위해 중요하다. 정확한 토폴로지가 결합 파트너와 상호 작용하는 세포막 단백질의 중요한 영역을 허용 그것은 중요한 번역 후 변형이 발생할 수 있고, 세포막 단백질의 경우, 세포와 상호 작용하고 t를 응답 할 수환경을 오. 완전히 세포막 단백질의 기능을 이해하려면 그 단백질이 존재하는 막 내, 즉, 그 막 토폴로지에 대해 배향되는 방법을 알고 명백히 필수적이다. 막 단백질은 약리학 타겟 (3)의 대부분을 포함 이후 단백질 표면의 양태는 다른 환경에 노출되는 세포막 단백질 어느의 토폴로지를 이해하는 기초 과학 기술의 취득 이외에 임상 적 의미를 표시하고있다. 최근까지, 시간과 비용에 상당한 투자를 필요거나 구하기 어려운 시약을 요구 한 막 단백질 토폴로지를 결정하는 접근한다.
두 실험과 인 실리코 접근법 세포막 내에 존재하는 단백질의 막 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. INDIVI의 평가에 기초하여 소수성 멤브레인 스패닝 영역의 예측 제 보낸이중 아미노산 3 수많은 예측 알고리즘은 이제 인터넷에서 사용할 수 있으며, 단순히 단백질의 아미노산 서열에 대한 지식을 필요로한다. 그러나 가정은 종종 토폴로지 4,5의 잘못된 할당 될 수 있습니다와 같은 모델링 프로그램, 가정의 중심에 있습니다. 이러한 컴퓨터 기반의 예측이 잠정적으로 막에 걸쳐 영역을 할당 할 수 있지만 또한, 그들은 항상 아미노 또는 단백질의 카르복시 말단이 세포 기관 루멘 또는 셀의 외관, 세포질에 있는지 여부를 확인하지 않습니다. 계산 능력을 증가, 심지어 함께 기계 학습 알고리즘 (6), 이러한 데이터의 사용은 여전히 모델이고, 실험적으로 획득 된 데이터를 이용하여 검증되어야한다. 멤브레인 토폴로지 판정 직접 실험은 면역 반응성을 평가 전과 후에 세포 투과성으로 만들어졌다 단백질 걸쳐 분산 공지 에피토프와 모노클로 날 항체의 패널을 사용하여 수행되었다. 이접근법은 관심있는 단백질을 사용하지 못할 수도 항체들의 세트를 필요로한다.
또 다른 전략은 다시 이전과 막 투과성으로 후 면역 반응의 결정 뒤에 단백질에 걸쳐 다양한 위치에 myc의 또는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 같은 에피토프 태그를 엔지니어링하는 것입니다. 면역 원성 태그 이외에, 이러한 시스테인 스캐닝 화학적 변형 (β 갈 락토시다 아제, 알칼리 포스파타제, 또는 β의 마제 포함) 효소 태그는 모든 세포막 단백질 7,8 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. 세포막 단백질의 위상 맵핑 채용 추가적인 방법 에피토프 태그와 약간 다른 접근 방법에 의존한다. 이 방법에서, 태그 서열은 N- 연결 글리코 실화 컨센서스 서열 NXS / T이다. 이러한 시퀀스는 생합성 경로, 내강 대에서 태그의 존재의 루멘에 존재하는 경우에만 발생 글리코 실화 때문에세포질 구획은 쉽게 SDS-PAGE 젤에 질량 변화로 관찰된다. 이러한 접근 방법은 이온 채널 multispanning CFTR 9에인가되었다. 이러한 모든 접근법들이 이용되었지만, 그것들은 모두가 생성 매니 폴드 구조를 서열에 분자 생물학에 상당한 투자를 필요로하는 것이 분명하다.
세포 내 소기관에 위치한 횡단 단백질에 대한 위상 정보를 확인하려면 더 많은 도전 것으로 입증되었습니다. 형광 기반 기술의 적용하지만, 멤브레인 토폴로지 많이 간단의 판정을했다. 이분자 형광 상보의 기술 (BiFC)가 해당 단백질 (10)의 형광 특성을 복원, 형광 단백질의 형광이 아닌 두 단편 사이의 상호 작용에 의존한다. 처음 10 생체 단백질 - 단백질 상호 작용을 결정하기 위해 설명되었지만,이 방법도 이용되고있다식물 세포 (11) 세포막 단백질 토폴로지를 결정한다. 그러나이 방법은 관심의 단백질뿐만 아니라 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 타겟팅 융합 단백질의 다양한 융합 단백질뿐만 아니라 생성을 필요로 시간 집약적이기도 한 관심에있는 세포 내에서는 단백질을 세포막되는 지식이 필요 .
막 단백질의 토폴로지를 결정하는 대안적인 접근법은 단순 12을 설명 하였다. 분석법, 형광 프로테아제 보호 (FPP)는 GFP 및 관심 유전자 간의 융합 단백질의 생성을 필요로한다. 접근법은 GFP 잔기에 비특이적 프로테아제의 상대 접근성에 기반; GFP 여부에 따라 세포 내 소기관의 루멘에 존재하여 단백질 분해로부터 보호 또는 세포질 내에 존재하는 단백질 분해 됨으로써 노출된다. 관심 단백질에 GFP 잔기 세포질을 향하게되면 따라서, 그것은에 노출 될프로테아제 활성 및 형광 신호는 손실. 관심 단백질에 GFP 잔기 (예 골지 내강으로) 환경에서 프로테아제 '보호'을 반대로 향하게되면, 다음 형광 신호는 계속된다.
프로테아제는 세포를 입력 할 수 있지만, 콜레스테롤 결합 토닌 약물이 사용되는 세포 내 세포막 구획을 입력하지 않을. 콜레스테롤은 척추 동물 스테롤 지배적이며, 구체적으로는 세포 내 구획에 대하여 세포막에서 농축된다. 배당체 독소, 디기 토닌은 공장 Digitalis 푸로부터 추출된다. 토닌은 (14, 16) (그림 1) permeabiliztion 선택적 막에 이르게 콜레스테롤이 풍부한 막에 친 화성을 가지고 있습니다. 작은 세포질 성분의 출구 수있을뿐만 아니라, 디기 토닌 또한 투과성으로 단백질 분해 효소 K 또는 트립신과 같은 외인성 분자의 침입을 허용한다. FPP 프로토콜은 FAC 활용세포막은 ER 다른 소기관 반면, 골지체는 엔도 좀이 매우 낮은 콜레스테롤 함량을 가지고 미토콘드리아, 14 그대로 남아, 셀룰러 콜레스테롤 (17)의 80 %까지 포함 t. 세포막에 콜레스테롤의 선택적 혼입 S. 같은 다양한 종에서 진핵 토닌 의존적 세포막 투과성으로의 사용을 허용하는, 많은 진핵 세포에서 관찰되어왔다 인간 (14, 18)에 cerevisiae에. FPP 분석은 (a) 단백질은 막 결합 / 연관 또는 세포질과 세포막 단백질의 (b) 영역에서 자유롭게 확산 여부 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 대향 결정 간단 신속하고 매우 강력한 수단을 제공한다. 막 단백질은 여러 방향이 경우, 신호가 지배적 인 형태에서 발생하고 작은 형태가 감지되지 않습니다. 관심의 단백질 GFP 잔기의 첨가는 그 기능에 영향을 줄 수있는 얼마간의 관심이있을 수있는 반면 및/ 또는 세포 내 현지화,이 실제보다 실제로 더 이론이다. 실제로 많은 연구 명확 태그 GFP 단백질 (19, 20)의 특성을 변화하지 않는다는 것을 보여 주었다.
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Protocol
형광 단백질 키메라 1. 생성 및 검증
- 표준 재조합 DNA 전략 (13)를 사용하여 관심의 대상이되는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 추가.
참고 : 우리가 광범위하게 GFP를 사용하고 있지만, 시안 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP)와 같은 다른 변종 DsRed의 및 mCherry가 이용 될 수있다. 형광 접는 효율성, 밝기와 광 안정성의 개선이 지속적으로 이루어지고 있으며, 연구자들은 최신 구조의 자신을 소용합니다.- 정확한 DNA 서열을 확인하고 GFP 부분이 관심의 단백질과 프레임에 있는지 확인하십시오. 표준 재조합 DNA 전략 (21)를 사용하여 시퀀싱을 수행합니다.
참고 : 많은 기관이 조사가 추가 정보를 문의 권장 핵심 DNA 시설을 가지고있다. - 단일 또는 이중 패스 막 단백질의 경우, 생성융합 단백질 (19)의 아미노 및 카르 복실 단말기 버전 모두.
- 다중 스패닝 단백질 추정 extramembrane 루프 내에서 GFP뿐만 아니라 말단를 삽입합니다. 단백질은 ER에 translocon 통과 한 후에 신호 서열은 종종 단백질 분해에 의해 절단 될 때 목적 단백질의 아미노 말단에 부착 된 형광 융합 단백질 트랜스 키메라를 생성 할 때 특히주의.
- 그대로 아미노 - 말단 태그 형광 단백질을 함유하는 성숙한 단백질을 생성하도록 현존하는 신호 계열의 경우, 절단 부위에 형광 융합 단백질 말단을 삽입한다. 키메라 (21)의 생성을위한 표준 재조합 DNA 전략을 사용한다.
- 정확한 DNA 서열을 확인하고 GFP 부분이 관심의 단백질과 프레임에 있는지 확인하십시오. 표준 재조합 DNA 전략 (21)를 사용하여 시퀀싱을 수행합니다.
- 관심 세포주 충분한 적절히 국부 형광 신호의 존재를 결정.
- appropri에서 GFP의 고유 형광을 이용하여 표면 형광 현미경 하에서 세포를 관찰필터 설정 조건을 먹었다. 510-560 nm의를 포함 GFP 필터 세트의 경우, 올바른 필터가 사용되는 형광체에 사용되는 것을 확인합니다.
참고 : 눈에 의한 평가는 신호가 상주하는 내 세포 구조가 쉽게 배경 위에 해결되었는지 충분히 강한 신호를 제공 할 때 충분한 신호를 얻을 수있다. 또한 GFP 단백질의 염색 패턴은 적절한 세포 기관에 대한 마커의 것과 일치하고, 기본 태그가 지정되지 않은 단백질의 바람직 동일해야합니다.
- appropri에서 GFP의 고유 형광을 이용하여 표면 형광 현미경 하에서 세포를 관찰필터 설정 조건을 먹었다. 510-560 nm의를 포함 GFP 필터 세트의 경우, 올바른 필터가 사용되는 형광체에 사용되는 것을 확인합니다.
- 안정적인 또는 일시 발현 방식이 단백질이 평가되고 기반으로 활용할지 여부를 결정합니다.
참고 : 안정 형질은 일반적으로 일시적인 시스템보다 표현의 낮은 수준을 감당할. 일시적 발현은 (단백질에 따라 5-24 시간 ~ 포스트 형질) 단백질 및 증가 된 신호 강도의 높은 수준의 발현을 얻을 수 있지만, 또한 단백질 등의 과발현 AGGR 인공물을 초래할 수잘못된 세포 내 현지화로 이어지는 egation 또는 단백질 대상 경로의 포화,.
세포와 세포 배양 2. 형질
참고 : 세포의 다양한 HEK293, 헬라, COS-7, CHO 세포 (14)를 포함하여, FPP 분석 의무가 있습니다. 다음의 설명은 HEK293 세포에서 막 단백질을 발현에 기초한다.
- 성장 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 부착 단층 등의 6 개의 37 °에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 피루브산 나트륨 및 250 ㎍ / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM), ml의 5 % CO 2와 C. 층류 조직 문화 후드 세포와 모든 작업을 수행합니다. T-75 플라스크에서 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 ~ 배지에서 세포를 성장한다.
- transien를 생성하는 지질, 또는 일렉트로 viral- 기반 기술을 포함하는 임의의 표준 고효율, 낮은 독성의 형질 전환 방법을 사용하여 세포를 형질t 또는 안정 식입니다. 일반적으로 1 × 10 6 세포 당 플라스미드 DNA의 2 μg의 좋은 재현성 단백질 발현을 제공합니다. CO 2 할 수있는 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 적절한 조직 배양 배지에서 5-48 시간 동안 세포를 유지한다.
- 제조사의 프로토콜에 따라 적절한 필터 세트를 이용하여, 극한의 GFP 형광 신호를 이용하여, 표면 형광 현미경을 이용하여 GFP 융합 단백질의 발현을 위해 세포를 모니터한다. 형광 신호는 보통 다음 형질 감염 24-72 시간 이내에 최대에 도달한다. 형광 신호가 최대 레벨에 도달 할 때 셀을 사용한다. 관심있는 단백질 또는 GFP 잔기 하나에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석에 의한 단백질 발현 수준을 모니터링.
- 코팅 된 커버에 실험 분석 판 세포하십시오. 라이브 셀 구성 또는 다음 고정에서 하나보고 현미경 슬라이드에 탑재합니다. 플레이트 세포는 24 ~ 48 시간 내에 60 % -80 %의 합류를 달성하기 위해.
- 전체 표면이 피복되도록 폴리 라이신 용액 (0.1 ㎎ / ㎖)으로 코팅 된 커버. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 60 분,이어서 실온에서 자외선 광 하에서 30 분 동안 인큐베이션. 초과 폴리 라이신을 제거하고 PBS 3 회에 커버 슬립을 씻어.
- 대안 적으로, 오일 - 침지 목적과 직접 촬상 할 수 있도록 광학 유리 바닥이있는 세포 배양 플레이트로 구성된 챔버 커버 유리 셀을 접시. 실제 현미경 설정은 연구자가 사용할 수있는 장비에 따라 다르지만 빠른 솔루션을 변경 할 수 있어야한다. 세포 형태 및 세포 형태에 따라, 세포는 FPP 분석시의 주위 60-90% 합류이어야한다.
3. 형광 현미경 설정
- 이러한 60X, 1.42 NA 오일 침지 목적으로 최대 신호 수집 및 공간 해상도에 대한 높은 개구 수 (NA) 오일 침지 목표를 사용합니다. 일 사용전자 형광 물질을 자극하는 레이저를 다음과 아르곤 가스를 488 나노 미터 (GFP와 YFP) 및 561 다이오드 (RFP, mCherry을).
- 각각의 구조에 대한 이미지의 최적의 노출, 이득 및 캡처 속도를 결정합니다. (단계 7.1.2 참조) photobleaching에 최소화하기 위해 레이저 강도와 노출 시간을 조정합니다.
- (예를 들면, 세포막 단백질 마커와 협동하여 막 투과성으로 대 수용성 마커), 적절한 필터를 선택할 여러 형광 물질을 이용하여 연구를위한 신호 크로스 토크를 최소화하고 신호대 잡음비를 최대화하도록 설정한다.
4. 플라즈마 막 투과성으로 최적 조건을 설정
- (예 EGFP DsRed의) 전용 수용성 형광 단백질을 발현하는 세포로부터 세포 배양 배지를 제거한다. KHM 버퍼 셀을 3 회 (각각 1 분)을 워시 (110 mM 아세트산 칼륨, 3 mM의 MgCl 2, 20 mM의 HEPES-NaOH를, pH가 7.2). 실온에서 세포 실험과 모든 시약을 수행합니다.
- 장소 세포 오N, 커버 슬립 형광 현미경 스테이지 KHM 버퍼 (단계 2.4 참조), 제어 '비 - 투과 가능'단계를 나타내는 첫 번째 이미지를 수집한다.
- 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하려면, 세포 KHM 디기 토닌 완충액 (30 μM)을 첨가. 10-60 초 동안 5 ㎖ / min의 속도 완충액 (+ 디기 토닌 완충액)로 세포를 관류.
- 서서히 토닌의 농도를 증가시킴으로써 최적 토닌 농도를 측정. 디기 토닌 애플리케이션 10-60 초 이내에 용해 EGFP에서 형광 신호의 완전한 손실이있을 때 최적 토닌 농도가 달성된다. 많은 세포 10-50 μM의 디기 토닌의 적용은 세포막을 Permeabilize 하시려면하기에 충분하다.
- 모든 응용 프로그램은 디기 토닌의 가장 낮은 농도를 사용합니다. 투과 가능 배경 신호에 대해 투과성으로를 토닌 후 이미지를 수집합니다.
- 관심의 GFP 단백질 키메라는 막에 있는지 확인세포막 투과성으로 디기 토닌 (16)의 다음의 형광 신호의 세포 유지를 확인함으로써 tegrated.
- 세포 소기관 특정 형광 단백질 (23)을 표현한다. 미토콘드리아 단백질은 예를 들어, 이와 관련 16 일, pDsRed2 - 미토 벡터에서 잘 작동합니다. 2.1 단계에 설명 된대로 최적의 발현 상태를 확인합니다.
- 세포 내 소기관의 형태가 토닌에 장시간 (60 분에) 노출을 일정하게 유지하는 토닌 농도를 확인하여 사용되는 세포 유형에 적합한 지 확인합니다.
참고 사항 : 리소좀 같은 다양한 세포 구획에 대한 항체를 사용하여 사용 표준 면역 형광 현미경 프로토콜 (예 LAMP1), 골지 (예 TGN38) 소포체 (예컨대, calnexin), 엔도 솜 (예 Rab5), 미토콘드리아 (예를 들면, 시토크롬 C). 세포 내 소기관의 형태 / 무결성 변경 극적으로 비켜 경우R 60 분, 그것은 토닌 농도가 너무 높았다 같으며 토닌 농도 및 / 또는 노출 시간의 감소를 필요로한다.
참고 : 토닌은 흡입 및 피부 접촉에 의해 독성. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것.
형광 단백질의 5. 단백질 분해 효소 처리
- 단백질 분해 효소를 추가 한 후 (단백질 분해 효소 K를, KHM 버퍼에 50 ㎍ / ㎖) KHM 버퍼에있는 세포를 씻으 직접 세포에. 5 mL의 연속적 제조를 목욕 관류 중력 공급 시스템을 사용하여 / 분의 유속으로 세포를 관류.
- 50 ㎖ 주사기에 보관 솔루션과 폴리에틸렌 튜브 목욕 (5 ml / 분의 유량)에서 단일 출구 매니 폴드에 독립적 인 저수지를 연결. 상수 (0.5 mL) 중 조 볼륨을 유지하고 수동 저수지 관류 용액의 전환에 의해 교환을 달성하기 위해 흡인 피펫을 위치.
- 불소 여부를 결정하기 위해 이미지를 수집escent 신호가 지속되거나 저하. 30-60 초 이상 초기 신호 강도의> 90 %의 손실이 GFP 단백질 키메라의 단백질 분해 열화와 일관성 (대표 결과 참조).
- 신호 열화가 테 K 관찰되지 않는 경우, 이러한 손실이 예상되는 경우, 버퍼 내의 KHM 트립신 (4-8 mM)을 가진 테 K 솔루션을 대체. 필요한 경우, 프로 테이나 제 K 및 트립신의 혼합물을 이용한다. 프로테아제 활성을 해소 할 필요가 없다.
외부 도메인에 플라즈마 막 단백질 6. 대안
- 세포막 단백질, 투과성으로 토닌을하기 전에 외부 형광 단백질 키메라에 대한 분석을 수행한다. KHM 버퍼 된 커버에 세포 (5 ml / 분 × 3 분) 세척 및 사전 단백질 분해 효소 처리에 대한 이미지를 촬영하고 7 단계로 사전 단백질 분해 효소 형광 신호를 정량화.
- 프로테아제 세포를 노출 (단백질 분해 효소 K를 50 ㎍ / ㎖의 또는 mM의 KHM 버퍼에 4-8 트립신) t에KHM 매체 함유 프로테아제 (유량 5 ㎖ / 분)로 세포를 환류시켜두면 그 토닌의 부재. 신호가 사라지거나 얼마나 오랫동안 신호가 지속 얼마나 빨리 결정하기 위해, 형광 단백질의 이미지를 수집합니다.
- 디기 토닌 투과성으로 전에, 10 %의 혈청 (FBS)을 함유하는 세포 배양 배지에서 세포를 세 번 (각각 1 분)을 세정함으로써, 모든 프로테아제 활성을 급냉.
- 2 분 동안 KHM 완충액 (5 ㎖ / 분의 유량)으로 환류시켜두면 세포를 세척 하였다. 사전 투과성으로의 화상을 취득. 단계 4에 기재된 세포막 Permeabilize 하시려면.
- 5 단계에 설명 된대로 프로테아제 또한 다음과 같은 이미지를 수집합니다.
7. 이미지 분석
- 형광 신호의 손실은 실시간으로 모니터링 할 수있는 "생균"기록 가능한 도립 현미경을 사용한다. 지속적으로 모니터링 동일한 파라미터 (노출 시간, 게인, 레이저 강도 등)을 이용한다.
- EXPER 결정제어 조건 (즉, KBH 혼자 버퍼)에서 관심의 GFP 단백질의 형광 신호를 관찰하여 imental 매개 변수를 설정합니다. 10-20 분 동안의 신호 강도의 뚜렷한 손실이 없다는 것을 보장하기 위해 컴퓨터 - 기반 현미경 이득, 레이저 강도 및 노출 시간 설정을 조정한다.
주 : 신호 강도의 절대 값이 아니라, 각각의 PI 사용할 현미경 시스템과 설정에 기초한다. 상대 형광 강도의 변화를 모니터링합니다.
- EXPER 결정제어 조건 (즉, KBH 혼자 버퍼)에서 관심의 GFP 단백질의 형광 신호를 관찰하여 imental 매개 변수를 설정합니다. 10-20 분 동안의 신호 강도의 뚜렷한 손실이 없다는 것을 보장하기 위해 컴퓨터 - 기반 현미경 이득, 레이저 강도 및 노출 시간 설정을 조정한다.
- 또한, 단백질 분해 효소에 의해 다음 토닌에 설정된 시간 지점에서 세포를 치료, 이전 이미징 된 커버에 장착에 세포를 고정합니다. 시점 경험적 4 단계와 초기 조사 제의 절차에 따라 결정, 디기 토닌 또는 프로테아제의 0, 30, 60, 120 및 300 초 후 첨가 시작한다.
- 세포 (실온에서 20 분간) 완벽 번째 잠기하는 고정액 충분한 양 (PBS에 3.7 % 파라 포름 알데히드)를 사용하여 해결전자 세포.
- PBS 20 mM의 글리신 (3 × 5 분)를 함유하는 세포를 세척하여 잔여 파라 포름 알데히드를 켄칭.
- 커버 슬립에서 물기를 제거하고 유리 현미경에 50 μl의 설치 매체에 커버 슬립을 반전하여 마운트 된 커버는 이미징 슬라이드. 슬라이드 영상 전에 밤새 건조하도록 허용합니다.
- 형광 현미경 이미지를 수집 컴퓨터 제어 형광 현미경 영상 캡쳐 기능을 사용함으로써 (아래에서 적절한 필터하면 형광 물질이 사용되고 호환 세트).
- 배양 조건의 함수로서 형광 신호 세기를 정량화. 개별 셀을 둘러싸는이자 (ROI)의 영역 내의 평균 픽셀 강도를 구합니다.
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Representative Results
플라즈마 막 투과성으로
효율적인 세포막 투과성으로는 수용성 형광 단백질 (예 : GFP DsRed의) (단계 4)의 사용에 의해 결정된다. 이들 단백질은, 세포에서 발현 될 때, 세포질에서 자유롭게 확산 및 세포막은 (도 2)를 사용하여 투과 가능 토닌 경우 손실된다. 형광 신호의 완전한 소멸 토닌 응용 프로그램의 10 ~ 60 초 이내에 발생한다. 관심의 단백질이 세포 내 소기관과 연관된 확인이 토닌 투과성으로 다음 형광 신호의 보유를 주목함으로써 달성된다.
단백질 분해 효소 처리
세포에 형광 단백질의 관심있는 단백질과 형광 단백질 (GFP, YFP 등) (단계 1), 식 간의 형광 키메라의 성공적인 생성을 이하의 (단계 2), 치료 프로테아제의 투과 가능 세포가 형광 물질 (및 인접하는 단백질 도메인) 세포질에있는 소화 프로테아제 액세스, 또는 세포 기관 루멘 내에 위치하므로 프로테아제 분해 (단계 4)로부터 보호되는지에 대한 정보를 제공 할 것이다. LMTK2 멤브레인 고정 키나아제 15, 형광 단백질 분해 효소 보호 분석법은 토폴로지 막 (16)을 결정하는데 사용되어왔다. LMTK2의 카복실 꼬리에 융합 된 GFP와 일시적으로 발현되었다. LMTK2-GFP 형광 신호가 LMTK2 세포질 (도 3) 내에 위치되는 카복실 말단의 위치를 나타내는, 테 K 첨가 한 다음에 빠르게 소실되었다. 카베 올린 GFP (Cav1-GFP) (17)는 세포질 도메인에 부착 된 GFP-잔기 세포막 단백질이다. (도 3)과 마찬가지로 LMTK2, 카베 올린 YFP로부터 신호 토닌 둔감하지만, 프로테아제의 첨가 이후에 민감.
t "> 내강 가용성 단백질도 FPP 프로토콜을 사용하여 식별 될 수있다.이 예에서, ER 체류 신호 KDEL가 DsRed를 추가된다. LMTK2 및 카베로부터의 신호는 대조적으로는 KDEL-을 DsRed로부터의 신호 둘 다에 둔감 디기 토닌이 ER 막을 Permeabilize 하시려면 할 수없는 등의 디기 토닌 및 프로테아제, 형광 신호는 프로테아제 분해로부터 보호된다. 미토콘드리아 단백질에 의해 주어진다 소기관의 내강 내에 위치한 멤브레인 도메인의 예는 인간 사이토 크롬 c 산화 효소 서브 유닛 VIII이고 18,19.는 pDsRed-이 MIT, Discosoma 피알 적색 형광 단백질. 사이토 크롬 c 산화 효소의 서열을 표적 미토콘드리아에 융합을 인코딩한다.는 pDsRed-미토 발현 세포에서는 형광 신호가 셀에서 볼 수있다. 토닌 투과성으로 이어 형광 신호 는 pDsRed - 미토와 관련이 안정적으로 유지. 또한, 단백질 분해 효소 K,는 pDsRed - 미토가 지속와 관련된 형광, 죄수의 또한 다음미토콘드리아에 형광 물질로 일관하고 (그림 3) 세포질에 노출 따라서 단백질 분해 효소 활동으로부터 보호되지.세포 외 도메인
비 - 투과 가능 세포의 프로테아제 처리가 빠르게 막 단백질에 부착 된 형광 부분은 셀 외부를 향하게되어 형광 신호를 급냉한다. glycosylphosphatidylinositol (GPI) 고정 된 단백질 PRP (20)는 좋은 예로서 역할을한다. 노란색 형광 단백질을 포함하는 구조는 (YFP) 예루살렘의 히브리 대학에서, PRP (YFP-PRP) 21, 22, 박사 후드 코헨에서 관대 한 선물의 아미노 말단에 연결합니다. 치료 프로테아제에 앞서, 세포 외 YFP의 형광 신호 (그림 4) 밝습니다. 프로테아제 처리 후, 세포 외 형광 신호가 급격히 사라졌다.
시간 고려 사항
도 1 : 세포막의 선택적 투과성으로 실험 프로토콜 거치지 단일 셀을 도시 FPP 에세이 () 만화 모델.. 빨간색 기호가 세포질에서 적색 형광 단백질 (RFP)를 나타내고, 녹색과 파란색 기호는 세포 기관 루멘 (파란색) 또는 세포질 (녹색)에 직면하거나 형광 태그 횡단 단백질을 나타냅니다. (b) 후 디기 토닌 투과성으로 자유 세포질단백질 RFP 신호를 감소 멀리 확산. 청색 신호 소기관 루멘에서의 존재에 의해 열화로부터 보호되는 반면 티나 제 K의인가에 따라 (c)는, 세포질 녹색 신호가 열화된다.
도 2 : 토닌 치료 세포막과 세포질 릴리스 permeabilizes GFP를 단일 셀의 (a) 만화 전과 치료 후 디기 토닌, 수용성 GFP를 발현.. (b) 토닌 처리는 세포막과 세포질 릴리스 GFP를 permeabilizes. 관심 영역 (ROI)의 영역은 가용성 GFP를 발현하는 CHO 세포 주위 그려진다. 디기 토닌 (50 μM)로 처리 후, 화상 전과 토닌의 첨가 후, 및 지시 된 시점에서 촬영 하였다. 스케일 바, 10 μm의. (c) fluore의 정량화풀 타임 시리즈 (AF)의에서 scence 강도가 표시됩니다.
그림 3 : FPP는 엔도 좀의 단백질 LMTK2의 토폴로지를 보여준다 () LMTK2-GFP (녹색 공)의 DsRed의 손실 (빨간 공)하지만 보존을 보여주는 FPP의 만화는 단백질 분해 효소 K의 응용 프로그램에 신호 손실 다음, 디기 토닌 투과성으로 다음. . (b)을 DsRed 및 LMTK2-GFP를 발현하는 CHO 세포의 FPP 분석. 이미지는 전에 지시 된 바와 같이, 치료를 토닌, 및 단백질 분해 효소 K를 다음과 후 촬영 하였다. 스케일 바 : 10 μm의.
도 4 (a) 전 및 프로 테이나 제 K 처리 후 PRP-YFP (녹색)의 위상과 위치를 나타내는 만화 모델. 발현 CHO 세포YFP-PRP는 100 초 동안 K 테를 행 하였다. (b) 이전에 찍은 사진과 프로테아제 처리 후 표시된 시간에 도시되어있다. YFP-PRP 신호는 완전히 토닌의 부재에서 단백질 분해 효소 다음이 끊어졌습니다. (c)에 도시 정량에 사용되는이자 (ROI)의 노란색 쇼 영역입니다.
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Discussion
막 단백질의 정확한 방향 및 토폴로지들은 적절한 기능을 위해 필수적이다. 막 단백질 토폴로지 이해의 중요성에도 불구하고, 이러한 데이터가 완전히 결여되는 많은 단백질이있다. FPP는 쉽고 효율적인 세포막 단백질 토폴로지를 결정하는 단계로서, 대부분의 실험실에 의해 수행 될 수있는 하나를 제공한다. FPP 방식은 단백질 토폴로지를 결정하기위한 기존의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제공한다. 예를 들어, 관심 (31)의 단백질의 다양한 영역을 다시 관한 여러 항체의 패널을 가질 필요가 없다. 많은 경우에 항체의 이러한 패널을 사용할 수 없습니다; 이 새로 복제 된 단백질에 특히 사실이다. 분석은 단일 세포 수준에서 수행 할 수있는 바와 같이, 많은 단백질의 생화학 수량이 하류 생화학 필요하지 않은 이러한 단백질 분해 또는 SDS-PAGE로 분석한다. 실제로, 상대적으로 적은 형질 전환 된 세포를 명확하게 지정하는 데 필요한관심 단백질 토폴로지. 연구자는 상피 세포 나 신경 세포로 형질하기 어려운 세포에서 토폴로지를 평가하고 경우에 중요합니다. 단백질의 카르복시 또는 아미노 말단에 하나에 GFP 잔기의 간단한 첨가는 쉽게 플라스미드를 함유하는 수많은 시판 GFP를 이용하여 달성 될 수 있으며, 대부분의 경우에, GFP 잔기의 첨가는 올바른 단백질 폴딩 또는 세포 내 위치 파악을 방해하지 않는다. 관심 (23, 24)의 단백질에 영향을 GFP에 대한 가능성이있는 그러나, 수사관이 자신의 단백질에 대한 사실 확인해야합니다. 대부분의 단백질은 따라서 토폴로지 연구를 시작하기 위해 최소한의 추가 노력을 필요로하는, 이미 GFP 융합 단백질로 사용할 수 있습니다. 형광의 지속적인 모니터링이 라이브 셀 이미징 장비를 액세스 할 수없는 연구자 들어 단백질 토폴로지를 판정하는 신속하고 효율적인 수단을 제공하지만, 분석은 용이하게 포름 알데히드 고정하도록되어 앱바퀴벌레는 공 초점 현미경의 표준 표면 형광을 사용.
FPP 분석의 적용에 몇 가지 제한도 존재한다. 단백질 분해 프로세싱 또는 다른 번역 후 변형은 관심 단백질 막 약간 다른 토폴로지를 초래한다 FPP 분석은 지배적 인 단백질 형태를 평가한다. 또한, 일부 단백질의 말단에 GFP 잔기를 붙이면 카복실 단말 PDZ 도메인과 간섭, 예를 들어, 그 기능에 영향을 미칠 수있다. 그럼에도 불구하고, FPP 분석은 많은 막 단백질의 방위 및 토폴로지를 설정하기위한 간단한 방법을 제공한다.
그것은 초기 실험은 세포 내 수용성 GFP를 해제 토닌의 정확한 농도를 결정하기 위해 수행하는 것이 중요하다. GFP는 애플리케이션 토닌 다음 세포 바깥으로 확산하지 않으면 토닌의 농도는 최소 농도를 결정하기 위해 다시 서서히 증가시켜야방출을 용이하게하기 위해 quired. 그러나, 너무 많은 토닌 무결성 토닌 응용 프로그램 다음 확인해야한다 세포 내 소포의 형태에 영향을 미칠 것입니다. 일부 세포에서 세포 내 소기관은 매우 민감하고보다 안정화 버퍼 조성물 (25)가 필요할 수 있습니다. 평가되는 키메라에서 형광 신호가 로우 인 경우, 더 높은 발현 수준으로 단일 클론을 선택하거나, 일시적인 발현을 수행 종종 허용 가능한 레벨로 신호 강도를 증가시킬 것이다. 새를 추구, 밝은 플라스미드는 낮은 신호 강도로 고려되어야한다. 마지막으로, 치료는 본 신호의 손실이 프로테아제 열화에 기인하지 photobleaching에의 형광체 인 것이 확인해야한다. 광 강도 및 / 또는 수집 속도를 줄이면 광표백을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
