Bestemme Membran Protein Topology med fluoresens Protease Protection (FPP)

Introduction

Plasmamembranen, så vel som de mange intracellulære membraner, tjener som barrierer som skiller to vandige kammere. I tilfelle av plasmamembranen, er avstanden mellom utsiden og innsiden av cellen; for intracellulære organeller er det mellom cytoplasma og organeller lumen. For eksempel skiller det endoplasmatiske retikulum (ER) membran et oksyderende miljø i lumen av ER fra en cytosolisk reduserende miljø ^1. Membran proteiner syntetiseres på ER-assosiert ribosomer, og oppnå sin endelige topologi innenfor ER membranen ^2. Oppkjøpet av passende membran orientering og topologi for proteiner er avgjørende for deres normale funksjon. Riktig topologi tillater relevante domener av membranproteiner til å samhandle med deres bindingspartnere, gjør det kritiske post-translasjonelle modifikasjoner til å forekomme, og i tilfelle av plasmamembranproteiner, tillater cellen å samvirke med og reagere to sitt miljø. For å få fullt utbytte av funksjonen av et membranprotein, er det åpenbart viktig å vite hvordan dette protein er orientert med hensyn til membranen hvor den befinner seg, dvs. dens membran topologi. I tillegg til kjøp av grunnleggende vitenskapelig kunnskap, forståelse topologien av en membran protein og hvilke aspekter av et protein overflaten er utsatt for ulike miljøer har preget kliniske implikasjoner siden membran proteiner utgjør flertallet av farmakologiske mål ^3. Inntil nylig, tilnærminger til å bestemme membran protein topologi har krevd betydelig investering i tid og penger eller har nødvendige reagenser som er vanskelig å komme med.

Både eksperimentelle og i silico tilnærminger er blitt benyttet for å bestemme membran topologien av proteiner som befinner seg inne i plasmamembranen. Siden de første spådommer om membran spenner domener basert på den evaluert hydrofobisiteten av indidual aminosyrer ^tre, mange prediktive algoritmer er nå tilgjengelig på internett, og bare krever kunnskap om proteinets aminosyresekvens. Men forutsetningene er ofte sentralt i slike modelleringsprogrammer, antagelser som kan føre til feil oppdrag av topologi ^4,5. Videre, mens slike datamaskinbaserte forutsigelser kan forsøksvis tildele membran som strekker seg over områder, har de ikke alltid fastslå om amino- eller karboksyendene av proteiner er i cytoplasma, organelle hulrom eller celle utvendig. Selv med økt regnekraft, og bruk av maskinlæringsalgoritmer ^6, slike data er fortsatt en modell, og må valideres ved hjelp av eksperimentelt innsamlede data. Direkte eksperimentell bestemmelse av membran topologi er blitt foretatt ved bruk av paneler av monoklonale antistoffer med kjente epitoper fordelt over hele proteinet, der er foretatt vurdering av deres immunreaktivitet før og etter celle permeabilization. Dettetilnærming krever et sett av antistoffer, som kanskje ikke er tilgjengelig for proteinet av interesse.

En alternativ strategi er å konstruere epitope koder som myc eller hemagglutinin (HA) i ulike steder i protein, igjen etterfulgt av fastsettelse av immunoreaktiviteten før og etter membran permeabilization. I tillegg til immunogeniske koder, enzymatiske tags (inkludert alkalisk fosfatase, β -galaktosidase, eller β -laktamase) og kjemiske modifikasjoner som cystein scanning har alle blitt ansatt for å bestemme membran protein topologi ^7,8. En annen metode benyttes for topologisk kartlegging av plasmamembranproteiner er avhengig av en litt annen tilnærming til epitope koder. I denne fremgangsmåten merkelappen sekvensen er N-bundet glykosylering konsensussekvensen NXS / T. Etter glykosylering oppstår bare når en slik sekvens er tilstede i lumen av den biosyntetiske reaksjonsveien, nærværet av merkelappen i en luminal versusen cytosolisk Rommet er lett observeres som en masseforskyvning på SDS-PAGE-geler. En slik tilnærming har blitt brukt til multispanning ionekanalen CFTR ^9. Mens alle disse tilnærmingene er benyttet, er det klart at de alle krever betydelige investeringer i molekylærbiologi å generere og sekvensere mangfoldige konstruksjoner.

Å bestemme topologisk informasjon om trans proteiner ligger innenfor intracellulære organeller har vist seg å være mer utfordrende. Anvendelsen av fluorescens-basert teknologier har imidlertid gjort bestemmelsen av membranen topologi mye enklere. Teknikken med bimolecular fluorescens komplemente (BiFC) er avhengig av interaksjonen mellom to ikke-fluoriserende fragmenter av et fluorescerende protein, gjenoppretter de fluorescerende egenskapene til at proteinet ^10. Selv om den opprinnelig er beskrevet for bestemmelse av protein-protein interaksjoner in vivo ^10, har denne tilnærmingsmåten har også blitt benyttetå bestemme membran protein topologi i planteceller ^11. Men denne fremgangsmåten er også tidskrevende da det krever genereringen ikke bare av fusjonsproteiner med proteinet av interesse, men også en rekke fusjonsproteiner rettet til cytosol eller organelle lumen, og krever kjennskap til hvilke intracellulære membraner proteinet av interesse ligger i .

En alternativ enklere tilnærming til bestemmelse av membranprotein topologi er blitt beskrevet ^12. Analysen, Fluorescens Protease beskyttelse (FPP) krever dannelsen av et fusjonsprotein mellom GFP og genet av interesse. Tilnærmingen er basert på den relative tilgjengeligheten av ikke-spesifikke proteaser til GFP gruppe; avhengig av om GFP er beskyttet fra proteolyse av bor i lumen av intracellulære organeller, eller er utsatt for proteolyse ved å være til stede i cytosol. Hvis således GFP-delen på proteinet av interesse vender mot cytoplasma, vil det bli utsatt forproteaseaktivitet og fluorescens-signalet tapt. Motsatt, hvis den GFP-delen på proteinet av interesse vender et miljø "beskyttet" fra protease (slik som Golgi lumen) og fluorescens-signalet vil vedvare.

Å tillate proteaser å gå inn i cellen, men ikke gå inn intracellulære membran avdelinger kolesterol bindende narkotika digitonin brukes. Kolesterol er den dominerende sterol i vertebrater, og er spesielt anriket på plasmamembranen i forhold til intracellulære kamre. Glykosidet toksin, digitonin, blir trukket ut fra anlegget Digitalis purpurea. Digitonin har en affinitet for kolesterolrike membraner, hvor det fører til selektiv membran permeabiliztion ^14,16 (figur 1). I tillegg til at avkjørselen til små cytosoliske komponenter, digitonin permeabilization tillater også oppføring av eksogene molekyler, for eksempel proteinase K eller trypsin. FPP protokollen utnyttet fact at plasmamembranen inneholder opp til 80% av cellulær kolesterol ^17, mens det andre organeller, såsom ER, Golgi, endosomer, mitokondrier, som har meget lavt kolesterolinnhold, forblir intakt ^14. Den selektiv innlemmelse av kolesterol inn i plasmamembranen har blitt observert i mange eukaryote celler, noe som tillater bruk av digitonin-avhengige plasmamembranen permeabilization på så forskjellige eukaryote arter som S. cerevisiae til menneskelig ^14,18. FPP-analysen er en enkel, hurtig og relativt robuste middel for å bestemme (a) hvorvidt et protein er membranbundet / assosiert eller fritt diffusjonsevne i cytosol og (b) som domene av et membranprotein vender cytosol eller organelle lumen. Skulle en membran protein har flere orienteringer, vil signalet oppstår fra den dominerende formen og mindre former vil ikke bli oppdaget. Mens det kan være en viss bekymring for at tilsetning av et GFP-gruppe til proteinmolekylet på interesse kan påvirke dens funksjon og/ Eller subcellulære lokalisering, dette er faktisk mer teoretisk enn faktiske. Faktisk er mange studier har klart vist at GFP taggen ikke endrer egenskapene til proteinet ^19,20.

Protocol

1. generasjon og validering av Fluorescent proteinkimærer

1. Føyer grønt fluorescerende protein (GFP) til amino- eller karboksyl termini til proteinet av interesse ved å bruke standard rekombinante DNA strategier ^13.
   MERK: Selv om vi har brukt GFP mye, andre varianter som cyan fluorescerende protein (CFP), gul fluoriserende protein (YFP), DsRed og mCherry kan benyttes. Forbedringer i fluorophore folding effektivitet, lysstyrke og fotostabilitet blir stadig gjort, og etterforskerne skal benytte seg av den nyeste generasjonen konstruksjoner.
   1. Bekrefte korrekte DNA-sekvens, og at GFP-delen er i ramme med proteinet av interesse. Utføre sekvensering ved anvendelse av standard rekombinante DNA strategier ^21.
      MERK: Mange institusjoner har kjerne DNA-fasiliteter, som etterforskeren blir oppfordret til å ta kontakt for ytterligere informasjon.
   2. For enkel eller dobbel pass membran proteiner, genererebåde amino- og karboksyl-terminale versjoner av fusjonsproteinene ^19.
   3. For multi-spenner proteiner setter GFP innenfor antatte extramembrane looper, samt Termini. Utvise spesiell forsiktighet ved generering av transmembran-kimærer med det fluorescerende fusjonsprotein bundet til aminoenden av målproteinet som signalsekvenser er ofte spaltet ved proteolyse når proteinet har passert gjennom ER translocon.
   4. I tilfelle av bevarte signalsekvenser, setter den fluorescerende fusjonsprotein distalt til spaltningssetet for derved å generere et modent protein som inneholder en intakt aminoterminalt kodede fluorescerende protein. Anvende standard rekombinante DNA strategier for generering av kimærene ^21.
2. Bestemme tilstedeværelsen av tilstrekkelig hensiktsmessig lokalisert fluorescerende signal i cellelinjen er av interesse.
   1. Observere cellene under epifluorescence mikros bruker den iboende fluorescens av GFP henhold hensiktsmesspiste filter sette vilkår. For GFP filtersett som omfatter 510-560 nm, bekrefter at de riktige filtre brukes for fluorophore ansatt.
      MERK: En tilstrekkelig signal oppnås når vurdering av øyet gir et sterkt nok signal om at cellestruktur innen hvilke signal bor er lett løses over bakgrunnen. I tillegg til fargemønster av GFP-protein bør være i samsvar med at av markører for den aktuelle organellen, og fortrinnsvis identisk med det native umerket protein.
3. Avgjøre om en stabil eller transient transfeksjon tilnærming vil bli benyttet basert på proteinet som blir evaluert.
   MERK: Stabile transfektanter generelt råd til lavere nivåer av uttrykk enn forbigående systemer. Selv transient ekspresjon gir høy ekspresjon av proteiner og øke signalintensiteten (~ 5 til 24 timer etter transfeksjon, avhengig av proteinet), kan det også føre til overekspresjon gjenstander som protein aggregation eller metning av protein målretting trasé, som fører til feilaktige subcellulære lokalisering.

2. Transfeksjon av celler og cellekultur

MERK: En rekke celler er mottagelig for FPP analyse, inkludert HEK293, HeLa, COS-7 og CHO-celler ^14. Den følgende beskrivelse er basert på uttrykkmembranproteiner i HEK293-celler.

1. Dyrker humane embryoniske nyreceller (HEK293) som adherente monosjikt i 6 ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 1% natriumpyruvat, og 250 pg / ml penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO _2. Utføre alt arbeidet med celler i en laminær vev kultur hette. Dyrke celler i kultur medium til ~ 80% konfluent i en T-75 kolbe.
2. Transfektere celler bruker noen standard høy effektivitet, lav toksisitet transfeksjonsmetoden, inkludert lipid-, Virus-eller electroporation-baserte teknologier for å generere transient eller stabil uttrykk. Typisk 2 pg av plasmid-DNA pr 1 x 10 ⁶ celler gir god reproduserbar proteinekspresjon. Opprettholde celler for 5-48 timer i hensiktsmessig vevskultur-medier ved 37 ° C i en _CO2 vevskulturinkubator stand.
3. Overvåke cellene for ekspresjon av GFP-fusjonsprotein ved hjelp av epifluorescens mikroskopi, ved hjelp av den iboende fluorescens-signalet av GFP, ved hjelp av passende filtersettene i henhold til produsentens protokoll. Fluorescens signal når vanligvis en maksimal innen 24-72 timer etter transfeksjon. Bruk celler når fluorescens-signal når et maksimalt nivå. Overvåke protein ekspresjonsnivåer ved immunoblotanalyse ved hjelp av antistoffer rettet mot enten proteinet av interesse eller GFP-del.
4. For eksperimentelle analyse plateceller på belagte dekkglass. Vis enten under en live-celle konfigurasjon eller etter fiksering og montere på mikros lysbilder. Plate celler for å oppnå 60% -80% samløpet innen 24-48 timer.
   1. Belegge dekkglass med poly-lysin-oppløsning (0,1 mg / ml), slik at hele overflaten er dekket. Inkuber i 30 minutter under en ultrafiolett lys ved romtemperatur, etterfulgt av 60 min i en cellekulturinkubator ved 37 ° C. Fjern overflødig poly-lysin og skyll Dekk i PBS tre ganger.
   2. Alternativt plate cellene på en kamret cover-glass som består av cellekulturplater med en optisk glassbunn for å tillate direkte avbildning med olje-nedsenking mål. Selve mikros oppsett avhenger av tilgjengelig utstyr for undersøkeren, men bør være i stand til rask oppløsning endringer. Avhengig av celletypen og celleform, bør cellene være rundt 60-90% konfluent på tidspunktet for FPP analysen.

3. Fluorescensmikroskopi Setup

1. Bruke en høy numerisk apertur (NA) olje-neddykking mål for maksimal signal innsamling og romlig oppløsning, for eksempel en 60X, 1,42 NA oljeneddyppingsobjektivet. Bruk the følgende lasere for å stimulere fluoroforene: Argon gass 488 nm (GFP og YFP) og 561 diode (RFP, mCherry).
2. Bestemme optimal eksponering, gevinst og opptakshastighet på bilder for hver konstruksjon. Juster laserintensitet og eksponeringstiden for å minimalisere fotobleking (se trinn 7.1.2).
3. For studier med flere fluoroforene (f.eks en løselig markør for membran permeabilization på konsert med en membran protein markør), velg passende filter sett å minimere signal krysstale og maksimere signal-til-støy-forhold.

4. Etablering av optimale forhold for Plasma Membran Permeabilization

1. Fjern cellekulturmedium fra celler som uttrykker kun løselig fluorescerende proteiner (f.eks EGFP, DsRed). Vask cellene 3 ganger (1 min hver) i KHM buffer (110 mM kaliumacetat, 3 mM _MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Utføre forsøk med celler og alle reagenser ved romtemperatur.
2. Plasser cellene on Dekk (se trinn 2.4) i KHM buffer på en fluorescens mikroskop scenen og samle det første bildet, som representerer kontroll "non-permeabilized 'scenen.
3. For selektivt å permeabilisere plasmamembranen, tilsett digitonin (30 pM) i KHM buffer til cellene. Perfuse celler med buffer (buffer + digitonin) med en hastighet på 5 ml / min i 10 til 60 sek.
4. Bestemme den optimale konsentrasjonen digitonin ved gradvis å øke konsentrasjonen av digitonin. Den optimale digitonin konsentrasjon oppnås når det er fullstendig tap av fluorescens signal fra løselig EGFP innen 10-60 sek av digitonin søknad. For mange celler er tilstrekkelig til å permeabilisere cellemembranen anvendelse av 10-50 pM digitonin.
   1. For alle programmer bruker den lavest mulig konsentrasjon av digitonin. Samle bilder etter Digitonin permeabilization for permeabilized bakgrunnssignal.
5. Bekrefte at GFP-proteinet chimera av interesse er membran i, integrert ved å bekrefte cellulær retensjon av fluorescens-signalet etter digitonin permeabilization av plasmamembranen ^16.
   1. Uttrykke en organspesifikk fluorescerende protein ^23. Mitokondrielle proteiner fungere godt i denne forbindelse ^16, for eksempel, pDsRed2-Mito vektor. Bestemme optimale uttrykk betingelser som beskrevet i trinn 2.1.
   2. Bekreft at digitonin konsentrasjonen er hensiktsmessig for celletype ansatt ved å sikre at morfologi av intracellulære organeller forblir konstant over lengre (opptil 60 min) eksponering for Digitonin.
      MERK: Bruk standard immunfluorescens mikros protokoller ved hjelp av antistoffer mot ulike celleplass, som lysosomer (f.eks LAMP1), Golgi (f.eks TGN38), endoplasmatiske retikulum (f.eks calnexin), endosomes (f.eks Rab5), mitokondrier (f.eks cytokrom c). Hvis intracellulære organelle morfologi / integritet endres dramatisk over 60 min, er det sannsynlig at digitonin konsentrasjonen var for høy, og krever en reduksjon i digitonin konsentrasjon og / eller eksponeringstiden.
      MERK: Digitonin er giftig ved innånding og hudkontakt. Bruke egnet personlig verneutstyr (PVU).

5. Protease Behandling av Fluorescent Proteiner

1. Vask cellene i KHM buffer og deretter legge protease (proteinase K, 50 ug / ml i buffer KHM) direkte på cellene. Perfuse celler ved en strømningshastighet på 5 ml / min ved hjelp av et gravitasjonsmatet perfusjon system til kontinuerlig å bade fremstillingen.
   1. Butikkløsninger i 50 ml sprøyter og polyetylen rør koblet uavhengige reservoarer til en manifold med et enkelt uttak på bad (5 ml / min flow rate). Plasser en suge pipette for å opprettholde en konstant (0,5 ml) badvolum og oppnå løsning utveksling ved å manuelt bytte mellom perfusjon reservoarer.
2. Samle bilder for å avgjøre om fluorescent signal vedvarer eller degraderes. Et tap på> 90% av den opprinnelige signalintensitet i løpet av 30-60 sek er forenlig med proteolytisk nedbrytning av GFP-protein-kimer (se Representative resultater).
3. Hvis ingen signal degradering er observert med proteinase K, når slikt tap er forventet, erstatte proteinase K løsning med trypsin (4-8 mm) i KHM buffer. Hvis det er nødvendig, anvende en blanding av proteinase K og trypsin. Det er ikke nødvendig å stanse proteaseaktivitet.

6. alternativ tilnærming for plasmamembran Proteiner med eksterne domener

1. For plasma membran proteiner, utføre analysen for eksterne fluorescerende proteiner chimeras før Digitonin permeabilization. Vask cellene på Dekk i KHM buffer (5 ml / min x 3 min), og ta et bilde for pre-protease behandling og kvantifisere pre-protease fluorescens signal som i trinn 7.
2. Eksponere cellene til protease (proteinase K, 50 ug / ml eller trypsin 4-8 mM i KHM buffer) i tHan fravær av digitonin ved perfusert cellene med KHM medier inneholdende protease (strømningshastighet 5 ml / min). Samle bilder av det fluorescerende protein, for å bestemme hvor raskt signalet forsvinner, eller hvor lenge signalet vedvarer.
3. Før digitonin permeabilization, slukke all protease-aktivitet, ved vasking av cellene tre ganger (1 min hver) i cellekulturmedium inneholdende 10% serum (FBS).
4. Vask cellene ved perfusert med KHM buffer (strømningshastighet på 5 ml / min) i 2 min. Erverve en pre-permeabilization bilde. Permeabilize cellemembranen som beskrevet i Trinn 4.
5. Samle bilder følgende protease tillegg som beskrevet i trinn 5.

7. Bildeanalyse

1. Bruke et invertert mikroskop kan "levende celle" opptaket hvor tap av fluorescens-signal kan overvåkes i sanntid. For kontinuerlig overvåking, ansetter identiske parametere (eksponeringstid, gevinst, laser intensitet, etc.).
   1. Bestem experimental parametere ved å observere fluorescens signalet fra GFP-proteinet av interesse i henhold til reguleringsforhold (dvs. KBH buffer alene). Justere styrke, laserintensitet og eksponeringstidsinnstillinger på datastyrte mikroskop for å sikre at det ikke er noen nevneverdig tap av signalintensiteten over en 10-20 minutters periode.
      MERK: Signalintensiteten er ikke en absolutt verdi, men er basert på mikroskopsystem og innstillinger tilgjengelig for hver PI. Overvåke endringer i relativ fluorescens intensitet.
2. Alternativt kan du unne celler til faste tidspunkter i digitonin fulgt av protease, og fikse celler før montering på dekkglass for bildebehandling. Bestemme tidspunkter empirisk følgende prosedyrer i trinn 4 og 5. For den innledende etterforskningen, starter på 0, 30, 60, 120 og 300 sek etter tillegg av digitonin eller protease.
   1. Fiks celler (20 min ved romtemperatur) ved hjelp av en tilstrekkelig mengde av fikseringsmiddel (3,7% paraformaldehyd i PBS) for å full senk the celler.
   2. Slukke restparaformaldehyd ved å skylle cellene med PBS inneholdende 20 mM glysin (3 x 5 min).
   3. Mount Dekk ved å fjerne overflødig væske fra dekkglass og invertere dekkglass på 50 mikroliter monterings media på et glass objektglass for bildebehandling. Tillate lysbilder tørke over natten før bildebehandling.
3. Samle fluorescens mikroskopi bilder (under de aktuelle filtre setter kompatibel med fluoroforen blir brukt) ved hjelp av videobildeopptaksfunksjon på en datastyrt fluorescensmikroskop.
4. Kvantifisere fluorescerende signalintensitet som en funksjon av inkubasjonstid tilstand. Få tak i den midlere pikselintensitet innenfor en region av interesse (ROI) som omslutter en enkelt celle.

Representative Results

Plasma Membran Permeabilization

Effektivt plasmamembranen permeabilization bestemmes ved anvendelse av løselige fluorescerende proteiner (f.eks, GFP, DsRed) (trinn 4). Disse proteinene, når uttrykt i cellene, er fri til å diffundere inn i cytosol, og går tapt når plasmamembranen er permeabilisert ved hjelp av digitonin (figur 2). En fullstendig bortfall av fluorescerende signal skal skje innen 10-60 sek av digitonin søknad. Bekreftelse på at proteinet av interesse er forbundet med intracellulære organeller oppnås ved å merke seg at retensjonen av fluorescent signal etter digitonin permeabilization.

Protease Treatment

Etter vellykket produksjon av fluorescerende kimærer mellom proteinet av interesse, og det fluorescerende protein (GFP, YFP, etc.) (Trinn 1) og ekspresjonen av det fluorescerende protein i celler (trinn 2), behandlings av permeabiliserte celler med protease vil gi informasjon om hvorvidt fluoroforen (og dens tilstøtende protein domene) er i cytosol og tilgjengelig for proteasenedbrytning, eller ligger innenfor en organelle lumen og dermed beskyttet mot proteasenedbrytning (trinn 4). LMTK2 er en membran forankret kinase ^15, og fluorescens protease beskyttelsesanalyser har blitt brukt for å bestemme dens membran ¹⁶ topologi. Karboksylsiden halen av LMTK2 ble smeltet til GFP og uttrykte forbigående. Fluorescerende LMTK2-GFP signalet gikk tapt raskt etter tilsetning av proteinase K, noe som indikerer plasseringen av karboksylterminusen LMTK2 blir plassert inne i cytosol (figur 3). Caveolin-GFP (Cav1-GFP) ¹⁷ er et plasmamembranprotein med et GFP-gruppe festet til cytosoliske domene. Som med LMTK2, blir signalet fra caveolin-YFP digitonin ufølsom, men følsomme for den etterfølgende tilsetning av protease (figur 3).

t "> Luminal oppløselige proteiner kan også bli identifisert ved hjelp av FPP-protokollen. I dette eksempel er ER retensjonssignal KDEL føyd til DsRed. I motsetning til signalene fra LMTK2 og caveolin, er ufølsom for både signalet fra KDEL-DsRed digitonin og protease, som digitonin er ute av stand til å permeabilisere ER membranen og det fluorescente signalet er beskyttet mot protease nedbrytning. Et eksempel på en membran domene lokalisert inne i hulrommet av en organeller, er gitt ved mitokondrie protein er subenhet VIII i humant cytokrom c oksidase ^18,19. pDsRed-Mit, koder for det røde fluorescerende protein fra Discosoma sp. fusjonert til mitokondrie målretting sekvensen fra cytokrom c-oksydase. I celler som uttrykker pDsRed-Mito, er fluorescerende signal sett i cellen. Etter digitonin permeabilization, det fluorescente signalet assosiert med pDSRed-Mito forblir stabil. Videre følgende tillegg av proteinase K, fluorescens forbundet med pDsRed-Mito vedvarer, conkonsistent med fluoroforen i mitokondriene og ikke utsettes for cytosol og dermed beskyttet mot protease-aktivitet (figur 3).

Ekstracellulære domener

Protease behandling av ikke-permeabiliserte celler bør hurtig slukke fluorescensen signal når den fluoriserende gruppe festet til en membranprotein er vendt mot cellens ytre. Den glykosylfosfatidylinositol (GPI) forankret protein PrP ²⁰ fungerer som et utmerket eksempel. En konstruksjon som inneholder gul fluoriserende protein (YFP) festet til aminoterminusen av PrP (YFP-PrP) ^21,22, en sjenerøs gave fra Dr. Ehud Cohen, fra Det hebraiske universitetet i Jerusalem. Forut for proteasebehandling, det fluorescente signalet fra det ekstracellulære YFP var lyse (figur 4). Etter protease behandling, det ekstracellulære fluorescens-signalet forsvant raskt.

Tid Betraktninger

Figur 1: Selektiv permeabilization av plasmamembranen (a) tegneserie modell av FPP-analyse som viser en enkelt celle som går gjennom den eksperimentelle protokollen.. Den røde symbolet representerer rød fluorescerende protein (RFP) i cytosol, de grønne og blå symboler representerer transmembrane proteiner med fluorescerende lappen heller vender organelle lumen (blå) eller cytosol (grønn). (B) Etter digitonin permeabilization, gratis cytosolicproteiner diffunderer bort, noe som reduserer RFP signal. (C) Etter påføring av proteinase K, er cytosoliske grønt signal brytes ned, mens det blå signal er beskyttet mot nedbrytning ved sin tilstedeværelse i organeller lumen.

Figur 2: Digitonin behandling permeabilizes plasmamembranen og utgivelser cytosolisk GFP (a) Cartoon av en enkelt celle uttrykker løselig GFP, før og etter digitonin behandling.. (B) Digitonin behandling permeabilizes plasmamembranen og utgivelser cytosolisk GFP. Et område av interesse (ROI) er trukket rundt CHO celler som uttrykker løselig GFP. Etter behandling med digitonin (50 pM), ble bildene tatt før og etter tilsetning av digitonin, og ved de angitte tidspunkter. Skala bar, 10 mikrometer. (C) Kvantifisering av fluorescence intensiteter av hele tidsserien (af) vises.

Figur 3: FPP viser topologien til den endosomale protein LMTK2 (a) tegneserie av FPP som viser tap av DsRed (røde kuler), men retensjon av LMTK2-GFP (grønne kuler) etter digitonin permeabilization, etterfulgt av signaltap på anvendelse av proteinase K. . (b) FPP analysen av CHO celler som uttrykker DsRed og LMTK2-GFP. Bilder ble tatt før og etter behandling digitonin, og etter proteinase K, som angitt. Målestokk: 10 mikrometer.

Figur 4: (a) tegneserie modell som viser topologien og plassering av YFP-PrP (grønn) før og etter proteinase K-behandling. CHO celler som uttrykkerYFP-PrP ble utsatt for proteinase K for 100 sek. (B) bilder tatt før og etter protease behandling er vist på de angitte tider. YFP-PrP signalet ble helt fortapt etter protease i fravær av digitonin. Gul viser region av interesse (ROI) som brukes for kvantifisering vist i (c).

Discussion

Riktig retning og topologi av membran proteiner er avgjørende for riktig funksjon. Til tross for at viktigheten av å forstå membranprotein topologi, det er mange proteiner for hvilke slike data er fullstendig mangler. FPP gir en enkel og effektiv måte å bestemme membranprotein topologi, og en som kan utføres av de fleste laboratorier. FPP tilnærming gir betydelige fordeler i forhold til tidligere metoder for å bestemme protein topologi. For eksempel er det ikke nødvendig å ha et panel av flere antistoffer rettet igjen ulike domener i proteinet av interesse ^31. I mange tilfeller, for eksempel et panel av antistoffer som ikke er tilgjengelige; Dette gjelder spesielt for nylig klonet proteiner. Som analysen kan utføres på en enkelt celle-nivå, blir store mengder av biokjemiske protein ikke er nødvendig for nedstrøms biokjemiske analyser som proteolyse eller SDS-PAGE. Faktisk, er relativt få transfekterte celler er nødvendig for å tilordne entydigen topologi til proteinet av interesse. Dette er viktig hvis etterforsker vurderer topologi i hardt for å transfektere celler som epitelceller eller nerveceller. Enkel tilsetning av et GFP-del til enten karboksyl- eller amino-terminus av proteinet kan enkelt oppnås ved hjelp av en rekke kommersielt tilgjengelige GFP inneholdende plasmider, og i de fleste tilfeller ikke tilsetningen av GFP-enheten ikke hindre skikkelig proteinfolding eller subcellulær lokalisering. Imidlertid må etterforskeren bekrefte at dette er sant for deres protein, så det er mulighet for GFP å påvirke protein av interesse ^23,24. Mange proteiner er allerede tilgjengelig som GFP fusjonsproteiner, og dermed krever minimal ekstra innsats for å initiere topologiske studier. Selv om kontinuerlig overvåking av fluorescens gir en rask og effektiv måte å bestemme protein topologi, for etterforskere som ikke har tilgang til live-cell imaging utstyr, er analysen lett tilpasses til en formaldehyd fiksering appmort bruker standard epifluorescence av konfokal mikroskopi.

Det er imidlertid noen begrensninger i anvendelsen av FPP-analysen. Skulle proteolytisk spaltning, eller andre post-translasjonelle modifikasjoner gi litt forskjellige membran topologier for proteinet av interesse, vil FPP analysen bare vurdere den dominerende protein form. I tillegg kan tilføye et GFP-del til termini av noen proteiner påvirke deres funksjon, for eksempel blande seg med karboksylterminale PDZ domener. Likevel gir den FPP-analysen er en enkel tilnærming for å etablere orienteringen og topologien til mange membranproteiner.

Det er avgjørende at innledende forsøk utføres for å bestemme riktig konsentrasjon av digitonin å frigjøre intracellulær løselig GFP. Dersom GFP ikke diffunderer ut av cellen etter digitonin søknad, bør konsentrasjonen av digitonin økes gradvis, for å bestemme den minimale konsentrasjonen required å lette utgivelsen. Imidlertid vil for mye digitonin påvirke morfologi av intracellulære vesikler, hvis integritet skal bekreftes etter digitonin søknad. Organeller i noen celler er svært følsom og kan kreve en mer stabiliserende buffer sammensetning ^25. Ved fluorescens-signalet fra kimæren blir evaluert er lavt, velger en enkelt klon med et høyere ekspresjonsnivå, eller utfører en forbigående ekspresjon, ofte vil øke signalstyrken til et akseptabelt nivå. Søker ut nyere, bør lysere plasmider også bli vurdert med lav signalintensitet. Til slutt bør man sørge for å sikre at tap av signal sett skyldes protease degradering og ikke til fotobleking av fluorophores. Redusere lysintensiteten og / eller oppkjøp rente vil bidra til å redusere fotobleking.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704