Introduction
plazma zarları, yanı sıra çok sayıda hücre içi zarlar, iki sulu bölmelerini ayıran engel olarak hizmet vermektedir. Plazma membranı durumunda, ayırma dış tarafı arasında ve hücrenin içinde olduğu; hücre içi organellere için sitoplazma ve organel lümen arasında. Örneğin, endoplazmik retikulum (ER) membran ortamı 1 azaltıcı sitozolik ER lümeninde bir oksitleyici ortam ayırır. Zar proteinleri, ER-bağlantılı, ribozomlar üzerinde sentezlendiği ve ER zar 2 içinde son topoloji elde edilir. proteinler için uygun membran yönelim ve topoloji edinimi normal fonksiyonu için önemlidir. Doğru topolojisi bağlanma partnerleri ile etkileşim zar proteinlerinin uygun etki sağlayan, kritik post-translasyonel modifikasyonlar meydana sağlar ve plazma zar proteinleri durumunda, hücre ile karşılıklı etkileşim ve t yanıt sağlarçevresini o. Tam bir membran proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için, bu protein, bulunduğu olan membran, örneğin, zar topolojisine göre yönlendirilmiştir nasıl açıkça şarttır. Membran proteinleri farmakolojik hedefler 3 çoğunluğunu oluşturan bu yana bir protein yüzey yönleri farklı ortamlara maruz kalan bir membran proteini ve hangi topoloji anlamak temel bilimsel bilginin edinimi, ek olarak klinik etkileri işaretlenmiş. Yakın zamana kadar, zaman ve para önemli yatırım gerektirmiştir veya gelmek zor olan reaktifler gerektirmiştir membran proteini topoloji belirleme yaklaşımları.
Hem deneysel ve silico yaklaşımlar plazma zarı içinde bulunan proteinlerin membran topolojisini belirlemek için kullanılmıştır. Bireyler değerlendirilir hidrofobisitesine göre membranlı etki ilk tahminleri yanaÇift amino asitler 3, çok sayıda öngörü algoritmalar artık internette mevcuttur ve sadece proteinin amino asit dizisinin bilgisi gerektirir. Ancak, varsayımlar genellikle topoloji 4,5 yanlış atamaları neden böyle modelleme programları, varsayımlara merkezi vardır. Bu bilgisayar tabanlı tahminler geçici zar kapsayan bölgeleri atayabilirsiniz Dahası, onlar her zaman amino ya da proteinlerin karboksi terminali organel lümen veya hücre dış, sitoplazmasında olup olmadığını belirlemek değil. Hesaplama gücü artmış, ve hatta makine-öğrenme algoritmaları 6, bu tür verilerin kullanımı hala bir modeldir ve deneysel elde edilen veriler kullanılarak valide edilmelidir. Membran topoloji doğrudan deneysel belirlenmesi onların imünoreaktivitenin değerlendirilmesi öncesi ve hücre geçirgenleştirmeden sonra yapılmış protein, dağılmış bilinen epitoplarıyla monoklonal antikor panelleri kullanılarak üstlenilmiştir. Buyaklaşım ilgili protein için mevcut olmayabilir antikorlar, bir dizi gereklidir.
Alternatif bir strateji yeniden öncesi ve membran geçirgenleştirmeden sonra imünoreaktivite belirlenmesi ardından protein boyunca çeşitli yerlerde, içine myc veya hemagglutinin (HA) gibi epitop etiketleri mühendisi olduğunu. Imünojenik etiketleri ek olarak, ve bu sistein tarama gibi kimyasal değişiklikler (alkalin fosfataz, P-galaktosidaz β, β-laktamaz ya da dahil olmak üzere), enzimatik etiketler, tüm zar proteini topoloji 7,8 belirlemek için kullanılmıştır. Plazma zar proteinlerinin topolojik haritalaması için kullanılan bir başka yöntem de epitop etiketleri için biraz farklı bir yaklaşıma dayanmaktadır. Bu yöntemde etiket dizisi N-bağlantılı glikosilasyon konsensüs sekansı NXS / T'dir. Bu tür bir sekans biyosentetik yolun bir luminal karşı etiketin varlığının lümeninde var olduğunda glikosilasyon yalnızca oluşur yanasitozolik bölmesi kolayca SDS-PAGE jelleri üzerinde bir kitle vardiya olarak görülmektedir. Böyle bir yaklaşım, multispanning iyon kanalının CFTR 9 uygulanmıştır. Tüm bu yaklaşımlar kullanılmıştır olmakla birlikte, bunların hepsi oluşturmak ve çeşitli yapıları sıralamak için moleküler biyoloji önemli yatırımlar gerektiren açıktır.
Hücre içi organellere içinde bulunan zar proteinleri ile ilgili topolojik bilgileri belirlemek için daha zor olduğu kanıtlanmıştır. floresan tabanlı teknolojilerin uygulanması, ancak zar topoloji çok basit belirlenmesi yaptı. bimoleküler floresan komplementasyon tekniği (BiFC) o proteinin 10 floresan özelliklerinin korunması, bir fluoresan proteininin iki floresan olmayan fragmanlar arasında etkileşimine dayanmaktadır. Ilk olarak, in vivo 10 protein-protein etkileşimlerini belirlemek için tarif edilmiş olmasına rağmen, bu yaklaşım aynı zamanda kullanılmıştırBitki hücrelerinde 11 zar proteini topolojisini tespit etmek. Bununla birlikte, bu yaklaşım, ilgili protein, aynı zamanda sitosol veya organel lümenine hedeflenen füzyon proteinlerinin çeşitli füzyon proteinlerinin sadece oluşumunu da gerektirir gibi yoğun süresi de, ve ilgi bulunan hücre içi protein membranlar olan bilgi gerektirir .
Zar proteini topoloji olarak belirlemenin bir alternatifi daha basit bir yaklaşım 12 tarif edilmiştir. Deney, Fluoresans Proteaz koruma (FPP), GFP ve ilgili gen arasındaki bir füzyon proteini üretilmesini gerektirir. yaklaşım GFP kısmı için spesifik olmayan proteazlar nispi erişilebilirlik üzerine dayanmaktadır; olup GFP bağlı olarak hücre içi organellerin lümeninde bulunan ile proteoliz tarafından korunduğu veya sitoplazmada mevcut olan vasıtasıyla proteolize maruz kalmaktadır. Ilgilenilen proteinin GFP kısmı sitoplazma dönük Böylece, eğer, bu maruz kalacağıproteaz aktivitesi ve floresan sinyali kaybetti. Ilgi protein GFP kısmı (örneğin Golgi lümen gibi) proteazm bir ortam 'korumalı' karşı karşıya Tersine, daha sonra floresan sinyali devam edecektir.
Proteazlar hücreye girmesine izin, ancak kolesterol bağlayıcı ilaç digitonin kullanılan hücre içi membran bölmeleri girmek değil. Kolesterol omurgalıların baskın steroldür ve özellikle hücre içi bölümlere göre plazma membranında zenginleştirilmiştir. glikozit toksini, dijitonin, bitki Digitalis purpurea'nın elde edilir. Digitonin'dir bu 14,16 (Şekil 1) permeabiliztion seçici membran neden kolesterol açısından zengin zarlar için afinitesi vardır. Küçük sitosolik bileşenlerin çıkış sağlayan ek olarak, dijitonin geçirgenleştirme, aynı zamanda, proteinaz K ya da tripsin gibi eksojen moleküllerin girişini mümkün kılar. FPP protokol fac yararlanırPlazma membranı, ER gibi diğer organellere, oysa, golgi endozomlarda, çok düşük bir kolesterol içeriği vardır mitokondri, 14 olduğu gibi kalır, hücresel kolesterolün 17% 80 kadar ihtiva t. plazma zarının kolesterolün seçici dahil S. gibi çeşitli ökaryotik türlerde dijitonin bağımlı plazma membran geçirgenliği kullanımını sağlayan, çok sayıda ökaryotik hücrelerde gözlenmiştir İnsan 14,18 ile cerevisiae. FPP deneyi (a) proteini zara bağlı / ilgili veya sitosol ve membran proteini, (b) etki serbestçe nüfuz olup sitosol veya organel lümeni yüzler belirlemek için bir basit, hızlı ve oldukça sağlam bir araç sağlar. Bir zar proteini birden yönelimleri varsa, sinyal baskın biçimde ortaya çıkacak ve minör form tespit edilmez. Ilgi proteine GFP kısmının eklenmesi işlevini etkileyebilir ki bazı endişeler olabilir iken ve/ Veya hücre içi lokalizasyonu, bu gerçek aslında daha teorik. Gerçekten de birçok çalışmalar net bir şekilde GFP etiket protein 19,20 özelliklerini değiştirmediğini göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Floresan Protein Kimeralar 1. Nesil ve Doğrulama
- Standart rekombinant DNA stratejileri 13 ile ilgili proteinin amino ya da karboksil uçları da yeşil floresan protein (GFP) ekleyin.
NOT: Bu yaygın olarak GFP kullanılmış olsa da, bu mavi floresan proteinin (CFP), sarı floresan proteini (YFP) gibi diğer varyantlar DsRed ve MCherry kullanılabilecektir. Fluorofor katlama verimliliği, parlaklık ve fotostabilite gelişmeler sürekli olarak yapılıyor ve araştırmacılar yeni nesil yapıları kendilerini boşuna gerekir.- Doğru DNA sekansına edin ve GFP grup, ilgi konusu proteini ile çerçeve içinde olduğundan emin olun. Standart rekombinant DNA stratejileri 21 kullanılarak sıralamayı yapın.
NOT: Birçok kurum araştırmacı ek bilgi için irtibat için teşvik edilir çekirdek DNA imkanları var. - Tek ya da çift geçişli membran proteinleri için, oluşturmakfüzyon proteinlerinin 19 amino ve karboksil terminal versiyonları.
- Çok kapsayan proteinler için varsayılan extramembrane döngüler içinde GFP gibi terminaline yerleştirin. Protein ER translokon geçtikten sonra sinyal diziler genellikle proteoliz ile ayrılmaktadır hedef proteinin amino terminaline bağlı floresan füzyon proteini ile transmembran kimeralar üreten özel bir dikkat.
- Sağlam bir amino terminal etiketli floresan proteini içeren olgun bir proteini üretmek üzere kaybolmamış sinyal dizileri söz konusu olduğunda, yarılma sitesi floresan füzyon proteini distalinde yerleştirin. Kimeralarının 21 nesil için standart rekombinant DNA stratejileri istihdam.
- Doğru DNA sekansına edin ve GFP grup, ilgi konusu proteini ile çerçeve içinde olduğundan emin olun. Standart rekombinant DNA stratejileri 21 kullanılarak sıralamayı yapın.
- Ilgi hücre hattı yeterli uygun lokalize floresan sinyal varlığını belirler.
- ÖDENEK altında GFP içsel floresan kullanarak Epifloresans mikroskobu altında hücreleri gözlemleyinFiltre set koşulları yedik. 510-560 nm kapsayacak GFP filtre setleri için, doğru filtreler kullanılan fluorophore için kullanılan olduğunu doğrulamaktadır.
NOT: gözle değerlendirme sinyali bulunduğu hücresel yapı kolayca arka plan üzerinde giderilmiş olduğunu yeterince güçlü bir sinyal sağlar zaman yeterli sinyal elde edilir. Buna ek olarak, GFP protein boyama modeli, uygun bir organele için işaretler ile tutarlı ve ana etiketlenmemiş proteinin ya da tercihen aynı olmalıdır.
- ÖDENEK altında GFP içsel floresan kullanarak Epifloresans mikroskobu altında hücreleri gözlemleyinFiltre set koşulları yedik. 510-560 nm kapsayacak GFP filtre setleri için, doğru filtreler kullanılan fluorophore için kullanılan olduğunu doğrulamaktadır.
- Bir sabit veya geçici transfeksiyon yaklaşımı proteini değerlendirilen dayalı kullanılacaktır belirleyin.
NOT: Kararlı transfektanları genellikle geçici sistemlere göre daha ifade düzeyi düşük göze. Geçici ifade (proteine bağlı olarak ~ 5-24 saat sonra transfeksiyon) protein ve artış sinyal yoğunluğunun yüksek düzeyde ekspresyonunu elde edilir, ancak, aynı zamanda, örneğin, protein AGGR gibi aşın eserler yol açabilirhatalı hücre içi lokalizasyonu giden egation veya protein hedefleme yollarının doygunluk,.
Hücreler ve Hücre Kültürü 2. Transfeksiyon
NOT: Birçok hücre, HEK293, HeLa, COS-7 ve CHO hücreleri 14 de dahil olmak üzere, FPP analizine tabi tutulabilirler. Aşağıdaki açıklama Hek293 hücreleri membran proteinleri ifade dayanmaktadır.
- Büyüme, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK293) uyumlu tekli katman olarak muhafaza 6 37 ° C'de,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 sodyum piruvat ve 250 ug / ml penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM), ml % 5 CO2 ile soğutuldu. Laminer akış doku kültürü kaputu hücreleri ile tüm çalışmaları gerçekleştirin. T-75 balonuna% 80 konfluent ~ kadar kültür ortamı içinde büyür.
- Transien oluşturmak için lipid, vira- veya elektroporasyon-tabanlı teknolojiler de dahil olmak üzere herhangi bir standart, yüksek verimlilik, düşük toksisite transfeksiyon yöntemi kullanılarak Transfect hücrelerit veya kalıcı tanımlama. Tipik olarak, 1 x 10 6 hücre başına plazmid DNA 2 ug tekrarlanabilir protein ifadesini sağlar. CO2 sahip doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de, uygun bir doku kültürü ortamı içinde 5-48 saat boyunca hücrelerin muhafaza edin.
- Üreticinin protokolüne uygun olarak uygun bir filtre kümesi kullanılarak GFP iç floresan sinyali kullanılarak, epifloresans mikroskobu kullanılarak GFP füzyon proteininin sentezlenmesi için hücre izleyin. Floresan sinyali genellikle transfeksiyonunun takip 24-72 saat içinde maksimuma ulaşır. Floresans sinyali bir maksimum değere ulaştığı zaman hücreler kullanın. Ilgili proteinin ya da GFP kısmı ya karşı antikorlar kullanılarak immünolojik leke analiziyle protein ekspresyonu seviyesini takip edin.
- Kaplanmış lamelleri deneysel analiz plaka hücreleri için. Canlı hücre yapılandırması veya aşağıdaki tespit altında ya görüntüle ve mikroskopi slaytlar monte. Plaka hücreler 24-48 saat içerisinde 60% -80% izdiham elde etmek için.
- Bütün yüzeyi kaplanana kadar poli-lizin çözeltisi (0.1 mg / ml) ile kaplayın lamelleri. 37 ° C'de bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 60 dakika, ardından oda sıcaklığında bir mor ötesi ışık altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşırı poli-lisin çıkarın ve PBS 3 kez lamelleri durulayın.
- Seçenek olarak ise, yağ daldırma hedefleri ile doğrudan görüntülenmesine olanak vermek üzere bir optik cam alt hücre kültürü plakaları kapsayan bir bölmeli kapak camı üzerine hücreler plaka. Gerçek mikroskopi kurulum araştırmacı mevcut ekipman bağlıdır, ancak hızlı çözüm değişiklikleri yeteneğine sahip olmalıdır. Hücre tipi ve hücre şekli ile ilgili olarak, hücreler, FPP deneyinde zamanında yaklaşık% 60-90 konfluent olmalıdır.
3. Floresan Mikroskopi Kurulumu
- Böyle bir 60X, 1.42 NA immersiyon yağı hedefi olarak maksimum sinyal toplama ve uzamsal çözünürlük, yüksek bir sayısal diyafram (NA) yağ daldırma hedefi kullanın. Inci kullanıne fluorophores uyarmak için lazerler aşağıdaki: argon gazı 488 nm (GFP ve YFP) ve 561 diyot (RFP, mCherry).
- Her yapı için görüntülerin optimal pozlama, kazanç ve yakalama oranını belirleyin. (Adım 7.1.2 bakınız) photobleaching en aza indirmek için lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlayın.
- (Örneğin, bir membran proteini markeri ile uyum içinde membran geçirgenliği için çözünür bir belirteci), uygun bir filtre tercih birden florofor ile çalışmaları için sinyal yansesi en aza indirmek ve sinyal-gürültü oranı en üst düzeye ayarlar.
4. Plazma membran geçirgenliği için optimal şartları oluşturulması
- (Örneğin, EGFP DsRed), sadece çözünür floresan proteinleri eksprese eden hücrelerden elde edilen hücre kültür ortamı çıkarın. KHM tampon hücreleri, 3 kez (1 dk) yıkayın (110 mM potasyum asetat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.2). Oda sıcaklığında hücreleri ile deneyler ve reaktifler yapın.
- Yer hücreleri on lamelleri bir floresan mikroskop sahnede KHM tamponunda (adım 2.4) ve kontrol 'olmayan geçirgenleştirildi' sahne temsil ilk görüntü, toplamak.
- Seçici olarak, plazma membran geçirgenliği için, hücrelere KHM tamponu digitonin (30 uM) ilave edin. 10-60 saniye için 5 ml / dakikalık bir hızla tampon (tampon + digitonin) ile hücrelerin serpmek.
- Yavaş yavaş digitonin konsantrasyonu artırarak optimum digitonin konsantrasyonunu belirlemek. dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde çözünen EGFP floresan sinyalinin tamamen kaybı olduğunda uygun dijitonin konsantrasyon elde edilir. Birçok hücre için 10-50 uM digitonin uygulama hücre membran geçirgenliği için yeterli değildir.
- Için tüm uygulamalar digitonin mümkün olan en düşük konsantrasyon kullanın. Permeabilize arka plan sinyali için geçirgenliği digitonin sonra görüntü Toplama.
- Ilgi GFP proteini kimera zar olduğunu doğrulayınplazma zarı 16 digitonin permeabilization aşağıdaki floresan sinyalinin hücresel tutma onaylayarak bütünleşmiş.
- Bir organel özel floresan proteini 23 Express. Mitokondriyal proteinler, örneğin bu bağlamda 16, pDsRed2-Mito vektör iyi çalışır. Adım 2.1 açıklandığı gibi uygun ifade koşullarını belirleyin.
- Hücre içi organellerin morfoloji digitonin için uzun süreli (60 dk) maruz boyunca sabit kalmasını digitonin konsantrasyon sağlayarak istihdam hücre tipi için uygun olduğundan emin olun.
NOT: Bu tür lizozomlardan gibi çeşitli hücresel bölmeleri karşı antikorlar kullanarak Kullanım standart immunofloresan mikroskopi protokolleri, (örneğin, LAMP1), Golgi (örneğin, TGN38), endoplazmik retikulum (örneğin, calnexin), endozomlar (örneğin, Rab5), mitokondri (örn, sitokrom c) işlendi. Hücre içi organel morfolojisi / bütünlük değişiklikleri dramatik ove iser, 60 dakika, bu dijitonin konsantrasyonu çok yüksek olduğu muhtemeldir ve dijitonin konsantrasyonu ve / veya maruz kalma süresinde bir azalma gereklidir.
NOT: Digitonin Teneffüs ve cilt ile temasında toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin.
Floresan Protein 5. Proteaz İle Muamele
- Proteaz ekleyin (proteinaz K; KHM tamponu içinde 50 ug / ml) KHM tampon hücreleri yıkanır ve doğrudan hücreler üzerine. 5 ml sürekli hazırlama banyosu yerçekimi vasıtasıyla beslenmesini perfüzyon sistemi kullanılarak / dakikalık bir akış hızında hücreleri serpmek.
- 50 ml 'lik şırıngaya saklayın çözeltiler ve polietilen boru banyosu (5 ml / dk akış oranı) tek bir çıkış ile bir manifolda bağımsız rezervuar bağlı. Sabit (0.5 mi) banyo hacmi korumak ve el ile perfüzyon rezervuar arasında geçiş yaparak çözelti değişimi elde etmek için bir emme pipet yerleştirin.
- Flor belirlemek için görüntüleri toplayınescent sinyal devam ederse veya alçaltır. 30-60 saniye boyunca ilk sinyal yoğunluğunun>% 90 bir kayıp GFP proteini kimera proteolitik bozulması ile tutarlıdır (Örnek Sonuçlar bakınız).
- Hiçbir sinyal bozulması proteinaz K ile görülürse, bu tür kayıp beklenen zaman, KHM tamponunda tripsin (4-8 mM) ile proteinaz K çözümü değiştirin. Gerekirse, proteinaz K, tripsin bir karışımını kullanmaktadır. Proteaz aktivitesini bastırmak için bir ihtiyaç vardır.
Dış Etki Plazma Membran Proteinleri 6. Alternatif Yaklaşım
- Plazma membran proteinleri için, geçirgenliği digitonin önce dış floresan proteinleri kimeralar için tahlil yapmak. KHM tamponu lamelleri hücreleri (5 mi / dakika x 3 dakika) yıkanır, ve ön-proteaz tedavisi için bir görüntü ve Aşama 7'deki gibi ön-proteaz floresan sinyalini ölçmek.
- Proteaz hücreleri Açığa (proteinaz K, 50 ug / ml veya mM KHM tamponunda 4-8 tripsin) tKHM ortam ihtiva eden bir proteaz (akış hızı 5 ml / dak) ile hücrelerin perfüze digitonin arasında da yokluğu. Sinyal kaybolur ya da ne kadar sinyal devam nasıl hızlı bir şekilde belirlemek için, floresan protein görüntüleri toplayın.
- Dijitonin geçirgenliği önce,% 10 serum (FBS) ihtiva eden hücre kültür ortamı içinde hücreleri üç kez (1 dk) yıkayarak, bunların hepsi proteaz etkinliğe söndürün.
- 2 dakika boyunca KHM tamponu (5 ml / dk akış oranı) ile perfüze hücreleri yıkayın. Bir ön-permeabilizasyon görüntü elde. Aşama 4'te tarif edildiği gibi, hücre membran geçirgenliği.
- Aşama 5'te tarif edildiği gibi proteaz ilave edildikten sonra görüntü Toplama.
7. Görüntü Analizi
- Flüoresan sinyal kaybı gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan "canlı hücre" kayıt kapasitesine sahip bir ters mikroskop kullanın. Sürekli izleme için, aynı parametreler (pozlama süresi, kazanç, lazer yoğunluğu, vb) kullanır.
- Exper belirleyinKontrol koşulları altında (yani, KBH sadece tampon) altında ilgi GFP protein floresan sinyalini gözlemlenerek imental parametreleri. 10-20 dakikalık bir süre boyunca sinyal yoğunluğu kayda değer kaybı olmasını sağlamak için bilgisayar odaklı mikroskop kazanç, lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlarını ayarlayın.
NOT: Sinyal yoğunluğu bir mutlak değer değil, ama her PI mevcut mikroskop sistemi ve ayarlar dayanmaktadır. Nispi flüoresan yoğunluğundaki değişiklik izler.
- Exper belirleyinKontrol koşulları altında (yani, KBH sadece tampon) altında ilgi GFP protein floresan sinyalini gözlemlenerek imental parametreleri. 10-20 dakikalık bir süre boyunca sinyal yoğunluğu kayda değer kaybı olmasını sağlamak için bilgisayar odaklı mikroskop kazanç, lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlarını ayarlayın.
- Alternatif olarak, proteaz tarafından takip digitonin set zaman noktalarında hücreleri tedavi ve önceki görüntüleme için lamelleri montaj hücreleri düzeltmek. Zaman noktaları ampirik adım 4 ve ilk soruşturma için 5. prosedürleri takip belirleyin, digitonin veya proteaz 0, 30, 60, 120 ve 300 sn sonrası ek başlayacak.
- Hücreleri (oda sıcaklığında 20 dakika) tam th daldırmak için sabitleyici yeterli bir miktarını (PBS içerisinde% 3.7 paraformaldehit) kullanarak saptamakE hücreler.
- PBS, 20 mM glisin ile (3 x 5 dk) içeren hücrelerin durulanarak artık paraformaldehid söndürüldü.
- Lamel fazla sıvıyı çıkarılması ve bir cam mikroskop 50 ul montaj ortamına lamel tersini Mount lamelleri görüntüleme için slaytlar. Slaytlar görüntüleme gecede önce kurumasını bekleyin.
- Floresan mikroskop görüntüleri toplayın bilgisayar kontrollü floresan mikroskop video görüntü yakalama işlevini kullanarak (uygun filtreler altında flüoroforun kullanılan uyumlu setleri).
- İnkübasyon durumunun bir fonksiyonu olarak flüoresan sinyal yoğunluklarını ölçmek. Tek bir hücreyi çevreleyen faiz (ROI) bir bölgede ortalama piksel yoğunluğu edinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plazma Membran Permeabilization
Etkin plazma membran geçirgenleştirilmesi çözünür floresan protein (örneğin, GFP, DsRed) (Basamak 4) kullanılması ile tespit edilir. Bu proteinler, hücrelerde ifade edildiğinde, sitozol içinde dağıtmak için serbesttir ve plazma membranı (Şekil 2) digitonin ile geçirgenleştirildi zaman kaybolur. Floresan sinyalinin bir tamamen yok dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde gerçekleşmelidir. Ilgili protein, hücre içi organellerin ilişkili onay dijitonin geçirgenliği, aşağıdaki flüoresan sinyal tutma not elde edilir.
Proteaz İle Muamele
Hücrelerdeki floresan protein ilgili protein ve floresan proteini (GFP YFP, vb) (Aşama 1) ve ifade arasındaki floresan kimeralar başarıyla nesil sonra (Aşama 2), tedavi proteaz ile birlikte geçirgen hale hücreler fluorofor (ve onun komşu protein etki) sitosolde ve sindirim proteaz erişilebilir, ya da bir organel lümeninde bulunan ve bu nedenle proteaz sindirim (Adım 4) korunur konusunda bilgi verecektir. LMTK2 bir zara bağlı kinaz 15, ve floresan proteaz koruma deneyleri zar topoloji 16 belirlemek için kullanılmıştır. LMTK2 karboksil kuyruk GFP'ye birleştirilmiş ve geçici olarak ifade edilmiştir. Floresan LMTK2-GFP sinyali LMTK2 sitosol (Şekil 3) içinde konumlanmış olan karboksil terminaline konumunu gösteren, proteinaz K ilave edildikten sonra hızlı bir şekilde kaybedildi. Kaveolin-GFP (CAV1 GFP) 17 sitosolik alana bağlı bir GFP kısmı bir plazma membran proteinidir. (Şekil 3) LMTK2 gibi, kaveolin-YFP sinyal duyarsız Digitonin'dir fakat proteaz daha sonra ilave duyarlı.
t "> lüminal çözünür proteinler de FPP protokolü kullanılarak tespit edilebilir. Bu örnekte, ER-retensiyon sinyali KDEL DsRed eklenir. LMTK2 ve kaveolin gelen sinyallerin tersine, KDEL-DsRed gelen sinyal iki karşı duyarsızdır dijitonin ER membran geçirgenliği mümkün olduğu gibi dijitonin ve proteaz flüoresan sinyal proteaz bozulmasına karşı korunur. mitokondriyal protein tarafından verilen bir organel lümeni içinde yer alan bir membran alanı örnek olarak insan sitokrom C oksidaz alt-birimi VIII 18,19. pDsRed-Mit, Discosoma sp kırmızı flöresanlı proteinin. sitokrom C oksidaz sekans hedefleme mitokondriyal kaynaşmış kodlar. pDsRed-Mito ifade eden hücreler içinde, floresan sinyalinin hücre içinde görülmektedir. dijitonin geçirgenliği sonra, floresan sinyalinin pDSRed-Mito ile ilişkili sabit kalır. Ayrıca, proteinaz K, pDsRed-Mito devam ile bağlantılı floresan con ilave edildikten sonramitokondrilerde fluorofor ile tutarlı ve (Şekil 3) sitoplazmada maruz kalan ve bu nedenle proteaz aktivitesi karşı korumalı değildir.Hücre dışı Etki
Olmayan geçirgen hücrelerin Proteaz işleme hızlı bir membran proteinine bağlı floresan parçası hücre dışına bakan bir floresan sinyalini gidermek gerekmektedir. glikozil (GPI) demirlemiş proteini PrP 20 mükemmel bir örnek olarak hizmet vermektedir. Sarı floresan proteini içeren bir yapı (YFP) Kudüs İbrani Üniversitesi'nden, PrP (YFP-PrP) 21,22 Dr. Ehud Cohen cömert bir hediye amino ucuna bağlı. Tedavi proteaz önce, hücre dışı YFP floresan sinyal (Şekil 4) parlak oldu. Proteaz tedavisi sonrasında, hücre dışı floresan sinyali hızla kayboldu.
Zaman Hususlar
Şekil 1: plazma zarının seçici permeabilizasyon deney protokolü geçmekte tek bir hücre gösteren FPP deneyi (a) Çizgi modeli.. kırmızı sembol sitozolde kırmızı floresan proteini (RFP) temsil, yeşil ve mavi semboller organel lümen (mavi) ya da sitoplazmada (yeşil) bakan ya floresan etiketi ile transmembran proteinleri temsil eder. (B) digitonin permeabilization ardından, serbest sitozolikproteinler RFP sinyali azaltarak, uzak yayılır. Mavi sinyal organel lümeninde varlığı ile bozulmaya karşı korunan ise proteinaz K uygulanmasının ardından, (c) sitosolik yeşil sinyal düşer.
Şekil 2: Digitonin'dir tedavisi, plazma membranı ve bültenleri sitosolik GFP permeabilizes tek bir hücre: (a) Çizgi önce ve dijitonin tedaviden sonra çözünür GFP'yi tanımlayan.. (B) Digitonin tedavisi plazma zarı ve bültenleri sitozolik GFP permeabilizes. Faiz (ROI) bir bölge çözünür GFP sentezleyen CHO hücrelerinin etrafında çizilir. Digitonin (50 uM) ile muamele sonrasında, görüntü önce ve digitonin ilave edildikten sonra ve belirli zaman noktalarında alınmıştır. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (C) fluore ölçümütam zamanlı serisi (af) olarak scence yoğunlukları gösterilmiştir.
Şekil 3: SOP endosome protein LMTK2 topolojisini ortaya (a) LMTK2-GFP (yeşil topları) olarak DsRed kaybı (kırmızı topları) ama tutma gösteren FPP'nin Karikatür proteinaz K uygulanmasına ilişkin sinyal kaybı ardından, digitonin geçirgenliği aşağıdaki. ., (b) DsRed ve LMTK2-GFP eksprese eden CHO hücrelerinin FPP deneyi. Görüntüler öncesi ve belirtildiği gibi, tedavi digitonin ve proteinaz K izledikten sonra alındı. Ölçek çubuğu: 10 mikron.
Şekil 4 (a) önce ve proteinaz K tedavisi sonrası YFP PrP (yeşil) topolojisi ve konumunu gösteren Çizgi modeli. Sentezleyen CHO hücreleriYFP PrP 100 saniye için de proteinez K'ya tabi tutuldu. (B) Çıkan öncesi ve proteaz muameleden sonra işaret edilen zamanlarda gösterilmiştir. YFP-PrP sinyali tamamen digitonin yokluğunda proteaz takip kayboldu. (C) 'de gösterilen nicelleştirilmesi için de kullanılabilecektir (ROI), Sarı Şekil bölgesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Membran proteinlerinin doğru yönlendirme ve topoloji bunların uygun fonksiyonu için gereklidir. Membran proteini topoloji anlama önemine rağmen, bu veriler tamamen yoksun olduğu için birçok protein vardır. SOP kolay ve verimli bir membran proteini topoloji belirleme şekli ve en laboratuvarlar tarafından yapılabilir bir sağlar. FPP yaklaşımı, protein topoloji belirlemek için önceki yöntemlere göre önemli avantajlar tanıyor. Örnek olarak, ilgili 31 proteinin tekrar çeşitli etki yönlendirilmiş çok sayıda antikor paneli için hiçbir gerek yoktur. Birçok durumda antikorların bir panelinin mevcut değildir; Bu klonlanmış proteinler için de geçerlidir. Deney, tek bir hücre seviyesinde yapılabilir gibi, proteinin büyük biyokimyasal miktarlarda alt baş biyokimyasal için gerekli olmayan bu gibi proteoliz veya SDS-PAGE olarak analiz eder. Gerçekten de, nispeten daha az transfekte edilmiş hücreler açıkça atamak için gerekli olanilgilenilen proteinin bir topoloji. Araştırmacı epitel hücreleri veya nöronlar gibi transfect zor hücrelerde topoloji değerlendirilmesi ise bu önemlidir. Proteinin karboksil veya amino terminalinde bir GFP kısmı basit eklenmesi kolaylıkla plazmidleri içeren çok ticari olarak temin edilebilir GFP kullanılarak elde edilebilir, ve çoğu durumda, GFP kısmı eklenmesi uygun protein katlanmasını veya hücre içi lokalizasyonu engellememektedir. Ilgi 23,24 proteini etkileyecek GFP için potansiyel var Ancak, araştırmacı, bu onların protein için doğru olduğunu onaylamanız gerekir. Birçok proteinler böylece topolojik çalışmaları başlatmak için minimum ek çaba gerektiren, zaten GFP füzyon proteinleri olarak mevcuttur. Floresan sürekli izleme canlı hücre için görüntüleme donanımları erişimi olmayan araştırmacılar için, protein topoloji belirleme hızlı ve etkin araçlar sağlar rağmen, tahlil kolaylıkla bir formaldehit tespit uygulaması uyarlanmıştırroach konfokal mikroskopi standart Epifloresans kullanarak.
FPP tahlil uygulanabilirliği bazı sınırlamalar ancak vardır. Işleme proteolitik, ya da diğer post-translasyonel modifikasyonlar ilgi protein için biraz farklı membran topolojilere neden olursa, FPP tahlil sadece dominant protein formunu değerlendirecektir. Buna ek olarak, bazı proteinlerin terminallerine bir GFP parçasını ekleme karboksil terminal PDZ etki ile müdahale, örneğin, onların işlevini etkileyebilir. Bununla birlikte, FPP deneyi birçok membran proteinlerinin yönünü ve topoloji kuran basit bir yaklaşım tanıyor.
Bu ilk deneyler, hücre içi çözünür GFP serbest bırakmak için digitonin doğru konsantrasyonunu belirlemek için yapılması önemlidir. GFP dijitonin uygulamasını takip eden hücre dışına yaygın değilse, digitonin konsantrasyonu en az konsantrasyonu yeniden belirlemek için, kademeli olarak arttırılmalıdırsalınmasını kolaylaştırmak üzere yapılması gereklidir. Bununla birlikte, çok fazla dijitonin bütünlüğü dijitonin uygulamasından sonra teyit edilmelidir hücre içi veziküller morfolojisini etkileyecektir. Bazı hücrelerde organelleri çok hassastır ve daha fazla dengeleyici tampon bileşim 25 gerektirebilir. Değerlendirilen chimera flüoresan sinyal düşük ise, daha yüksek bir ekspresyon seviyesinde tek bir klonun seçilmesi, ya da, geçici ifadeyi gerçekleştirmek genellikle kabul edilebilir seviyeye sinyal gücünü artırır. Yeni arayan, parlak plazmidler de düşük sinyal yoğunluğu dikkate alınmalıdır. Son olarak, bakım görülen sinyal kaybı proteaz bozulmasına bağlı olup fluorophores ışıkla ağartma için olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Işık yoğunluğunu ve / veya satın alma oranının azaltılması photobleaching azaltmaya yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
References
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
