Summary
특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
레이저 캡처 미세 절제 (LCM)는 높은 공간 해상도를 가진 얇은 조직 섹션에서 특정 세포의 분리를 할 수 있습니다. 효과적인 LCM은 이종 조직에서 세포 개체군의 정확한 식별이 필요합니다. LCM에 대한 관심의 세포의 식별은 일반적으로 형태 학적 기준에 형광 단백질 기자 기반으로합니다. LCM 신속한 immunolabeling의 조합은 대안적이고 효율적인 수단은 특정 유형의 세포를 시각화 및 주변 조직에서 그들을 분리를 제공한다. 고품질 RNA는 순수한 세포 집단에서 압축하고 상기 RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR를 포함한 다운 스트림 애플리케이션을 위해 처리 할 수있다. 이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 공보에 기재되어있다. 이 글의 목표는 LCM을 사용하여이 특정 세포를 분리하는 RNA의 무결성을 유지하면서 세포 인구의 급속한 immunolabeling을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 여기서, 우리는 설명D immunolabeling 하나 일된 마우스로부터 뇌 조직에서 도파민 성 세포를 포착함으로써 이러한 다단계 절차. 우리는 특별한 배려를받을 자격이 키 중요한 단계를 강조 표시합니다. 이 프로토콜은 관심 조직 및 세포의 종류에 적용될 수있다. 다양한 분야의 연구자 가능성이 방법의 데모에서 도움이 될 것입니다.
Introduction
뇌는 복잡한 네트워크를 형성하는 다른 신경 세포 유형의 많은 종류로 구성되어있다. 이 신경 세포는 형태, 연결 및 유전자 발현 패턴 (1)에 따라 별개의 그룹과 하위 그룹으로 구성됩니다. 마이크로 어레이를 개발, 차세대 시퀀싱 및 QRT-PCR은 상이한 생물학적 상황에서 1,2- 뉴런 집단의 유전자 발현 프로필을 비교할 수있는 가능성을 제공 하였다. 이러한 민감한 분석 RNA 무결성 2-4을 유지하면서 관심의 세포 유형의 정확한 식별 및 격리가 필요합니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기술이 널리 세포 표면 마커 및 / 또는 형태에 따라 특정 유형의 세포를 분리하는데 사용되어왔다. FACS는 공간 해상도 (5)의 전체 손실이 발생하기 전에 정렬에 세포 해리 단계가 필요합니다. 대부분의 신경 세포 개체군은 번째의 해부학 적 분포에 따라 서로 구별된다전자 두뇌입니다. 얇은 뇌 부분에 적용되는 레이저 캡처 미세 절제는 높은 공간 해상도 6-8와 세포의 특정 격리를위한 적절한 옵션을 제공합니다. LCM의 주요 제한은 형태 학적 기준에 유전자 또는 동물 모델에서 설계 형광성 단백질 리포터에 기초하여 관심있는 세포를 식별 할 필요가있다. LCM과 조합하여, RNA의 무결성을 보존 immunolabeling 빠른 방법을 수행하기위한 새로운 기술들의 개발은 현재 유전자 프로파일 실험을 진행하는 세포의 아 집단을 분리한다.
이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 1,9-13 공보에 기재되어있다. 여기서, 우리는 빠른 immunolabeling LCM과 조합함으로써 복합 조직 구조체에서 세포의 특정 서브 세트로부터 고품질의 RNA를 얻기 상세한 절차를 보여준다. 우리는 최대 RNA 회복을 얻기 위해 키 중요한 단계를 수행하고 있으므로 시그마 RNA의 분해를 방지하는 방법을 보여심하게 저 충격 유전자 발현 프로파일 링.
이 프로토콜의 데모를 들어, 하나의 일 된 마우스 중뇌의 도파민 신경 세포의 타겟이되었다. 도파민 뉴런은 티로신 수산화 효소 (TH)에 대해 유도 된 항체, 도파민 합성에 대한 속도 제한 효소를 사용 immunolabeled 수있다. TH 면역 염색 후, 개별 또는 도파민 신경 세포 집단은 LCM을 사용하여 단리 할 수있다. Microdissected 세포 용해 완충액에 수집되고, RNA는 RNA 분리 키트를 사용하여 추출한다. 품질과 추출 된 RNA의 양이 bioanalyzer (5)를 사용하여 측정한다. 사용하여 유전자 발현의 추가의 분석 : RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR이어서 2,4,6을 행할 수있다. 예로서, 두 단계 QRT-PCR은 레이저 캡처 절연 도파민 도메인에서 설명된다. 두 도파민 성 신경 세포 마커 유전자의 발현 량의 상대적 정량이 프로토콜의 선택도를 나타낸다.
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Protocol
참고 :이 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 캐나다의 가이드에 따라 수행하고, 대학 학자 라발 동물 보호위원회에 의해 승인되었다.
1. 샘플 준비
참고 :이 예제에서, 우리는 출생 후 1 일에서 마우스의 뇌를 사용했다.
- 3 새끼 분간 4에 대한 분쇄 된 얼음에 저체온 마취를 사용하여, 다음 얼음처럼 차가운 L15 매체에 가능한 한 빨리 뇌를 해부하다. 2 분 내에이 단계를 수행합니다.
- 전송 해부 금형 (물자의 CF. 목록)를 포함 두뇌하고 원하는 위치에 시편의 방향을 돌보는 냉동 조직 내장 미디어를 입력합니다. -80 ° C에서 액체 질소 저장 즉시 시료를 동결. 30 초 이내에이 단계를 수행합니다.
주 : 시험편 RNA의 품질을 손상시키지 않고 몇 달 보관 될 수있다.
2. 단면
- 치료 막 COA테드 유리 슬라이드 (CF. 재료의 목록) 표면의 RNAse 오염 제거 솔루션은 RNAses의 흔적을 제거합니다. DEPC 물에 슬라이드를 세척하고 건조 할 수 있습니다. 또한, 하룻밤 200 ° C에서 빵을 슬라이드.
- 이전에 표면의 RNAse 오염 제거 용액으로 세척 저온 유지 장치에 냉동 샘플을 전송합니다. 10 μm의 두께에서 -20 ° C 슬라이스 표본에서 설정 저온 유지 챔버 온도. 막 코팅 된 슬라이드에 조직 섹션을 수집하고 염색하기 전에 그들에게 건조 10 분을 할 수 있습니다. 또한, 상점은 염색 할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드.
염색 솔루션 3. 준비
- 바로 실험 개시 전에 모든 솔루션을 준비하고 RNA의 분해를 방지하기 위해 (세정액을 제외한) 모든 염색 용액에서의 RNAse 억제제를 사용한다.
- 완충 용액을 준비합니다. 1 % BSA로 보충 된 RNAse가없는 인산 완충 식염수 (PBS 이루어지는 모든 솔루션의 동일한 완충액 ()를 사용0.2 % 트리톤 (Triton) 및 2 %의 RNAse 억제제). 각 슬라이드를 들어, 완충 용액 400 μL (기본 200 μL와 2 차 항체 200 μL)를 준비합니다.
- 정착액 솔루션을 준비 : 70 % 에탄올을 사용은 -20 ° C로 유지. RNA 추출 수율이 대폭 감소를 피하기 위해 최소 조직 정착 과정을 유지.
주 : 대안 적으로, -20 ° C에 보관 5 % 아세트산 95 % 첨가 에탄올 용액을 사용한다. - 완충액에 일차 항체를 희석하여 차 항체 용액을 준비한다. 도파민 뉴런 라벨링, 티로신 히드 록 실라 제 (TH, 레이트 도파민 생산 제한 효소)을 표적으로하는 항체를 사용한다. 짧은 배양 시간을 보상하기 위해 항체의 높은 농도를 사용한다. 1:25 희석 TH 항체를 사용합니다.
참고 : 1000 : 정상적인 면역 프로토콜,이 항체는 하나의 희석에서 하룻밤 배양 강한 신호를 제공합니다. 이 프로토콜에서, 40X 더 정광을 사용짧은 배양 시간으로 인해 에드. 때문에이 방법에 사용되는 항체의 농도에 따라 비특이적 라벨링의 증가를 확인하기 위해서 병렬 표준 면역 염색을 수행한다. - 완충액에 이차 항체를 희석하여 차 항체 용액을 준비한다. 100 : 1의 농도로 바이오틴 차 항체를 사용합니다.
주 :이 예에서, 우리는 바이오틴 화 항 - 토끼 항체를 사용 하였다. - 비 오티 닐화 된 이차 항체의 검출을 위해 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC) 용액을 준비한다. 1의 농도에서 화합물 A와 화합물 B를 첨가하여 ABC 용액 만들기 : DEPC PBS에 희석 (100)는 2 %의 RNAse 억제제가 보충. 슬라이드에 추가하기 전에 아비딘 - 비오틴 복잡한 30 분을 준비합니다.
4. 염색
- 빨리 공기 그들을 가볍게 치면 -80 ° C 한번에 하나 또는 두 개의 슬라이드를 해동 (또는 송풍기를 사용하여). 소수성와 서라운드 섹션장벽 펜 및 몇 초 동안 건조 할 수 있습니다.
- -20 ° C에서 더 이상 5 분 이상 저온 정착 용액에 슬라이드를 넣습니다. 세탁 DEPC PBS 6-8 시간에 슬라이드를 빠르게, 다음 정착액 솔루션의 과잉을 제거 찍어 공중에서 한 번 흔들어.
- DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어 넘기십시오. 단계를 해동 슬라이드가 5 분을 초과하지 않도록하십시오.
- 깨끗한 선반에 슬라이드 (표면의 RNAse 염액으로 전처리는 RNAses의 흔적을 제거)하고, 실온에서 10 분 동안 각각의 슬라이드 (토끼 항 TH)에 차 항체 용액 200㎕를 넣어. 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 한 번 슬라이드를 쓸어.
- 실온에서 6 분 동안 각각의 슬라이드에 이차 항체 용액 200㎕를 넣어. 딥 신속하게 세척 DEPC PBS에서 3 번 슬라이드 및 DEPC PBS의 과잉을 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어.
- ABC의 솔루 200 μl를 넣어실온에서 4 분 동안 각 슬라이드에 기. 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 초과 DEPC PBS를 제거하기 위해 슬라이드를 쓸어.
- DAB (3,3 '디아 미노) ABC 용액에서 배양의 4 분 동안 솔루션을 준비합니다. 키트 (DAB 퍼 옥시 다제 기판 키트)에서 제공하는 시약을 사용합니다. 제공된 완충액 1 방울, DAB 용액 1 방울 및 DEPC 물 2.5ml의 30 % H 2 O 2 1 방울을 섞는다. 반전시켜 용액을 혼합한다.
- DAB 솔루션의 196 μl를 타고 그냥 슬라이드에 확산하기 전에의 RNAse 억제제 솔루션의 4 μL (2 %)를 추가합니다. 장소 (표면의 RNAse 오염 제거 용액으로 전처리) 깨끗한 트레이에 슬라이드 및 슬라이드에 DAB 솔루션의 200 μl를 넣어.
참고 : DAB 솔루션 within1 또는 2 분 반응한다. - 딥 DEPC PBS 빠르게 세탁 3 번 슬라이드 및 무수 에탄올에 몇 초 동안 슬라이드를 넣어. 공기를 쓸어 넘겨 슬라이드를 건조 (또는 송풍기를 사용). <BR /> 참고 : 슬라이드가 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관 또는 LCM 처리 할 수 있습니다.
5. 레이저 캡처 이외에 Microdissection
- 공기를 쓸어 넘겨 빠르게 슬라이드를 제상 (또는 송풍기를 사용). 단계를 해동 슬라이드가 5 분을 초과하지 않도록하십시오.
- LCM 진행합니다. 수집 관 뚜껑에 직면 샘플면 현미경 슬라이드를 놓습니다. 샘플에 가장 적합한 배율을 선택합니다. 관심의 세포를 확인하기 위해 초점을 조정합니다.
- 절단 영역을 정의하고 레이저로 절단 시작합니다. 해부 세포 (RNA 추출 키트) 용해 버퍼의 50 μL 가득 수집 관 뚜껑에 조직의 조각을 수집합니다. LCM하는 단계는 30 분을 초과하지 않도록하십시오.
- RNA 추출 키트 (CF. 물질의 목록)를 사용하여 고립 된 세포로부터 전체 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
- 42 ° C에서 30 분 동안에 수집 된 세포를 품어용균. 예비 상태 조절 완충액 250 μL를 첨가하여 RNA를 정제 용 컬럼. 로드 용균 세포의 에탄올 50 μL. 프리 컨디셔닝 정제 컬럼에 용해 세포의 100 μl를로드합니다.
- 실온에서 2 분 동안 16,000 XG에서 컬럼을 원심 분리기. 세척 버퍼로 두 번 열을 씻으십시오. RNAse가없는 물을 최소 권장 볼륨 (11 μL)으로 용출 (그것은 bioanalyser 방해 할 수 DEPC로 처리하지 않음). 테스트 품질에 2 μl를 유지합니다.
참고 : 모든 솔루션 및 시약 키트에 제공됩니다.
6. cDNA를 합성하고 정량적 RT-PCR
- 리버스 전사 역전사 효소 및 올리고 (DT)을 이용하여 상보 적 DNA 내로 레이저 캡처 도파민 세포로부터 RNA 샘플. 제조 업체의 프로토콜 (CF. 재료의 목록)을 따릅니다.
- 유전자 특이 프라이머와 QRT-PCR의 증폭 된 cDNA 1 μl를 사용합니다. 설정 PCR 정말이에요정량 PCR을위한 하나의 구성 요소 핫 스타트 반응 믹스 20 μL 부피 ctions는 제조업체에서 권장. 세중 각 반응을 수행하십시오.
- 여기 기재된 실험을 위해, 다음의 프라이머 쌍을 사용 GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R을 (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG 개그 AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); TH-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / 목-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
- 다음과 같은 빠른 순환 매개 변수를 사용하여 정량적 RT-PCR 증폭을 수행 : 95 ° C를 10 초 45주기 95 ° C, 60 ° C에서 10 초, 72 ° C에서 10 초 뒤에 5 분. determi하는 악기의 기본 설정을 사용하여 융해 곡선 분석을 수행네브라스카 균일 한 제품을 형성합니다.
- 내장 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.
- 앞서 설명한 바와 같이 14 상대적인 발현 수준을 얻기 위해 두 개의 표준 발현 유전자는 GAPDH 및 Rpl13a의 식 DA 마커 유전자 및 토륨 AADC의 발현 값을 정규화한다.
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Representative Results
이 급속 immunolabeling 절차 RNA 무결성을 유지하면서 원하는 세포를 시각화 할 수있다. 하나는 RNA 추출 전에 티슈 제조하는 단계를 도시한다. 냉동 절편 후, 도파민 뉴런 티로신 수산화에 대항하는 항체를 (표지 된 신경 세포가 갈색에 표시)를 사용하여 표시되어 있습니다. 실험 질문을 따라, 단일 세포 또는 관심의 큰 영역은 LCM을 이용하여 분리 할 수 있습니다 (그림 1D - E). 이것은 저하 된 RNA는 다음 분석의 질에 상당한 영향을 미칠 수있는 바와 같이, 추출 된 RNA의 품질을 평가하는 것이 중요하다. 각 샘플 따라서 정량 및 RNA의 무결성을 확인하는 미세 유체 기반 플랫폼 bioanalyser에 처리됩니다. (2) 저하 및 좋은 품질의 샘플의 전형적인 bioanalyser 결과를 보여줍니다. 디지털 젤 electropherograms 모두 각 졸의 RNAse 억제제를 사용하는 것의 중요성을 보여의 ution는 RNA를 보호 할 수 있습니다. 신경 (500)로부터 추출 된 RNA의 양은 예상되는 약 1-2 NG이다. 여러 조직 절편에서 Microdissected 세포 RNA의 양을 증가시키기 위해 동일한 튜브에 풀링 될 수있다.
그림 1 : 빠른 immunolabeling 및 레이저 캡처 미세 절제 절차. (A) 도식은 배아 일 15.5에서 마우스 뇌의 시상보기를 표시합니다. 검은 색 선은 중뇌 도파민 뉴런이 위치한 영역의 전후의 위치를 나타낸다. 얇은 부분은 저온 유지 장치를 사용하여 만들어지고 막 코팅 된 유리 슬라이드에 수집됩니다. immunolabeling 다음, 중뇌 도파민 신경 세포는 갈색 (B)에서 볼 수 있습니다. 레이저 microdissected 샘플은 용해 버퍼 (C)로 채워진 튜브 캡에 수집됩니다. 관심 지역 (D 파란색 선)또는 개별 셀 (E)의 해부 및 튜브 캡에서 검색 할 수 있습니다. 스케일 바 : (D) 250μm (E)으로 50μm.
도 2 : bioanalyzer 칩 키트를 사용하여 레이저 캡처 미세 절제 후 절연 총 RNA 샘플의 품질 관리 (A) bioanalyzer (L, 사다리 얻어진 디지털 겔; 1, 샘플 1 RNAsine와의 RNAse 억제제 (RNAsine), 샘플이없이. ). 부분적으로 저하 RNA 좋은 품질의 RNA의 전형적인 샘플 2 (하단 패널)를 보여주는 샘플 1 (상단 패널)의 (B) Electropherograms이있는 18S / 28S rRNA의 피크가 명확하게 볼 수 있습니다 (RIN>는 8 용인 좋다). (C) 주변 흠 t 사이에 두 DA 마커 유전자 (TH와 AADC)에 대한 배의 변화를 표현 정상화 상대적 발현 수준문제 및 DA 도메인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법의 가장 중요한 점은 RNA 저하를 방지하면서 관심의 세포를 라벨로 구성되어 있습니다. RNAses는 수용액에서 활약하는 바와 같이, 배양 시간을 감소하는 RNA 절약 11, 15을 향상시킨다. 사용되는 모든 솔루션은 RNAses을 비활성화 할 DEPC로 처리해야합니다. 모든 재료 및 표면 RNAses 오염을 방지하기 위해 표면의 RNAse 염액으로 처리 될 필요가있다. 마지막으로, 이러한 조건에서 모든 솔루션의 RNAse 억제제의 첨가가 저하되는 RNA를 유지하는데 효과적이다. 항체 인큐베이션 동안인가 고염 조건의 사용은 이전에 RNA 9,10을 유지하는 효과가있는 것으로 밝혀진 바있다. 그러나,이 대안적인 방법은 강력한 항체를 사용하여 염색을 신속 제한 남아있다. 부분의 두께는 다른 중요한 점을 나타내고 관심 셀의 크기에 따라 달라진다. 도파민 성 신경 세포의 세포체의 평균 크기는 약 10이기 때문에81; m, 우리는 세포의 한 층을 얻기 위해이 부분의 두께를 선택합니다.
FACS에 비해이 기술의 주요 제한은 microdissected 할 수있는 셀의 낮은 숫자입니다. RNA 증폭 키트의 사용은 RNA-16 염기 서열 또는 마이크로 어레이를 이용한 유전자 프로파일 실험에 요구된다. 그러나 QRT-PCR은 증폭 단계 (도 2C)없이 직접 실시 할 수있다. 빠른 immunolabeling 프로토콜 얻어진 염색 성적 평가는 항상 수행되어야 정상 immunolabeling 프로토콜을 사용하여 수득 된 염색 다를 안된다.
지금까지 레이저 캡처 실험은 주로 추천 GFP 마커를 발현하거나 Nissl 염색 빨리 조직 학적 착색을 사용하여 트랜스 제닉 동물로부터의 세포 집단을 분리하기 위해 사용되었다. 여기에 제시된 방법은 면역 조직 화학 염색을 이용하여 관심의 세포를 시각화 허용한다. 분리 및 유전자 EXPR 취득세포의 화학적 식별 인구의 ession 프로필은 현재 17 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 모든 조직에 적용하는 임의의 적절한 항체로 사용될 수있다.
뇌에서 뉴런은 지리적 위치 파악에 의해 분할하지만 대부분 뇌 영역들은 화학적 동일성에 따라 다른 개체군의 다양성을 포함 할 수있다. 뉴런의 특정 유형의 유전자 발현 패턴은 같은 뇌 영역에서 다른 세포 유형에서 크게 상이 할 수있다. 생물학적 또는 병리학 적 상황에 따라, 특정 세포 집단의 유전자 발현 프로파일 또한 변동될 수있다. 여기에 기술 된 절차를 사용하여, 그 새로운 발견에 8,18,19 방법을 포장, 이러한 변화를 모니터링 할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
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