Summary
Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.
Abstract
Captura laser microdissecação (LCM) permite o isolamento de células específicas a partir de secções de tecido fino com uma elevada resolução espacial. LCM eficaz requer a identificação precisa das células as subpopulações de um tecido heterogêneo. Identificação de células de interesse para LCM é geralmente baseada em critérios morfológicos ou em repórteres proteína fluorescente. A combinação de LCM e imunomarcação rápida oferece um meio alternativo e eficientes para visualizar tipos específicos de células e para isolá-los do tecido circundante. ARN de elevada qualidade pode então ser extraído a partir de uma população de células pura e adicionalmente processados para aplicações a jusante, incluindo a sequenciação de ARN, ou de microarray de qRT-PCR. Esta abordagem foi realizada previamente e brevemente descrito em poucas publicações. O objetivo deste artigo é ilustrar como realizar imunomarcação rápida de uma população de células, mantendo a integridade do RNA, e como isolar essas células específicas usando LCM. Nisto, nós ilustrard este processo multi-passo por imunomarcação e captura das células dopaminérgicas em tecido cerebral de ratos de um dia de idade. Destacamos etapas críticas fundamentais que merecem uma atenção especial. Este protocolo pode ser adaptado a uma variedade de tecidos e células de interesse. Pesquisadores de diferentes áreas provavelmente serão beneficiados com a demonstração desta abordagem.
Introduction
O cérebro é composto de uma grande variedade de diferentes tipos de neurónios, formando redes complexas. Esses neurônios são organizados em grupos e subgrupos distintos de acordo com a sua morfologia, conectividade e expressão gênica padrão 1. O desenvolvimento de microarrays, sequenciamento de próxima geração, e qRT-PCR oferecida a possibilidade de comparar os perfis de populações neuronais de expressão gênica em diferentes contextos biológicos 1,2. Estas análises sensíveis exigem a identificação precisa e isolamento de tipos de células de interesse, mantendo a integridade do RNA 2-4. De células (FACS) activada fluorescente técnica tem sido amplamente utilizada para isolar tipos específicos de células com base em marcadores da superfície celular e / ou morfologia. FACS requer um passo de dissociação de células antes da separação, o que resulta numa perda total de resolução espacial 5. Muitos subpopulações neuronais são distinguidas uma da outra de acordo com sua distribuição anatômica em the cérebro. Microdissection captura Laser aplicado em seções cerebrais finas oferece uma opção adequada para o isolamento específico de células com alta resolução espacial 6-8. Uma das principais limitações da LCM tem sido a necessidade de identificar as células de interesse com base em critérios morfológicos ou repórteres fluorescentes em proteína geneticamente em modelos animais. O desenvolvimento de novas técnicas para realizar métodos de imunomarcação rápidas que preservaram a integridade de ARN, em combinação com LCM, agora permite o isolamento de subpopulações de células para continuar com as experiências de perfilação de genes.
Esta abordagem foi realizada previamente e brevemente descrito em poucas publicações 1,9-13. Aqui, demonstramos um procedimento detalhado para a obtenção de RNA de alta qualidade a partir de um subconjunto específico de células de uma estrutura de tecido complexo pela combinação rápida de imunomarcação com GCV. Mostramos como executar passos fundamentais essenciais para obter a recuperação RNA máxima e evitar a degradação do RNA, pois pode sigcativamente gene impacto perfil de expressão.
Para a demonstração deste protocolo, os neurônios dopaminérgicos de um dia de idade, mesencéfalo rato foram alvejados. Neurónios dopaminérgicos pode ser immunolabeled utilizando um anticorpo dirigido contra a tirosina hidroxilase (TH), a enzima limitante da velocidade para a síntese de dopamina. Após imunocoloração TH, individuais ou grupos de neurónios dopaminérgicos pode, então, ser isolado usando LCM. Microdissecadas células são recolhidos no tampão de lise, e o ARN é extraído usando um kit de isolamento de ARN. Qualidade e quantidade do RNA extraído são medidos usando um Bioanalyzer 5. Uma análise mais aprofundada da expressão gênica usando: RNA seqüenciamento, microarray, ou qRT-PCR pode, posteriormente, ser realizada 2,4,6. Como um exemplo, um de dois passos de qRT-PCR é demonstrado nos domínios de laser capturado isolado dopaminérgicos. A quantificação relativa dos níveis de genes marcadores neurônio dois dopaminérgicos expressão ilustra a seletividade deste protocolo.
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Protocol
NOTA: Os experimentos foram realizados em conformidade com o Manual do canadense para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê da Université Laval Proteção Animal.
Preparação 1. Amostra
NOTA: Neste exemplo, usamos o cérebro do rato no dia pós-natal 1.
- Use anestesia hipotermia em gelo picado durante 3 a 4 minutos para crias, em seguida, dissecar cérebros tão rapidamente quanto possível, em meio L15 gelado. Execute esta etapa dentro de 2 min.
- Transferência dissecado cérebros incorporação molde (cf. Lista de material) e encha com media tecido congelado incorporação tendo o cuidado de orientar a amostra na posição desejada. Congelar as amostras imediatamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Execute esta etapa dentro de 30 segundos.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas alguns meses, sem comprometer a qualidade do RNA.
2. Seccionamento
- Coa membrana Treatlâminas de vidro (ted cf. Lista de material) com solução RNAse superfície descontaminação para eliminar qualquer vestígio de RNAses. Lavar as lâminas em água DEPC e deixe-os secar. Alternativamente, as lâminas durante a noite cozer a 200 ° C.
- Transferir as amostras congeladas em criostato previamente limpas com uma solução de superfície RNAse descontaminação. Defina a temperatura da câmara de criostato a -20 ° C e fatia amostras a 10 espessura mm. Recolha cortes de tecidos nas lâminas de membrana revestida e deixe-os secar 10 min antes da coloração. Alternativamente, desliza armazenamento a -80 ° C até à coloração.
3. Preparação de Soluções de Coloração
- Preparar todas as soluções imediatamente antes do início da experiência, e usar inibidor de RNAse em todas as soluções de coloração (excepto para as soluções de lavagem) para evitar a degradação de ARN.
- Preparar a solução tampão. Utilizar o mesmo em todas as soluções tampão (composta de solução salina tamponada com fosfato isenta de RNase (PBS) suplementada com 1% de BSA,0,2% de triton e 2% de inibidor de RNAse). Para cada slide, preparar 400 ml de solução tampão (200 mL para o primário e 200 mL para os anticorpos secundários).
- Preparar a solução fixadora: utilizar etanol a 70% conservado a -20 ° C. Mantenha procedimento fixação do tecido mínima para evitar uma redução drástica no rendimento de extração de RNA.
NOTA: Como alternativa, usar uma solução de etanol 95% suplementado de ácido acético a 5% mantida à temperatura de -20 ° C. - Preparar a solução de anticorpo primário por diluição do anticorpo primário na solução tampão. Para neurônios dopaminérgicos rotulagem, use um anticorpo visando a tirosina hidroxilase (TH, enzima limitante para a produção de dopamina). Usar uma elevada concentração de anticorpo para compensar o tempo de incubação rápida. Use anticorpo TH a uma diluição de 1:25.
NOTA: No protocolo de imunofluorescência normal, este anticorpo é um sinal forte quando incubadas durante a noite a uma diluição de 1: 1000. Neste protocolo, ele é usado mais 40X concentrated devido ao curto tempo de incubação. Devido à elevada concentração de anticorpo utilizada para este método, executar uma imunomarcação padrão em paralelo, a fim de verificar qualquer aumento da marcação não-específica. - Preparar a solução de anticorpo secundário através da diluição do anticorpo secundário na solução tampão. Usar um anticorpo secundário biotinilado numa concentração de 1: 100.
NOTA: Neste exemplo, foi utilizado um anticorpo biotinilado anti-coelho. - Preparar a solução para a detecção de anticorpos secundários biotinilados complexo avidina-biotina (ABC). Adicione solução ABC pela adição do composto A e o composto B a uma concentração de 1: 100 diluído em DEPC PBS suplementado com 2% de inibidor de RNAse. Prepare a avidina-biotina complexo 30 min antes de adicionar os slides.
4. Coloração
- Descongelar uma ou duas lâminas no momento de -80 ° C por um movimento súbito los rapidamente no ar (ou usar um ventilador de ar). Seções surround com um hidrofóbicocaneta barreira e deixe secar por alguns segundos.
- Colocar as lâminas em solução de fixação a frio para não mais de 5 min a -20 ° C. Agite uma vez no ar para remover o excesso de solução de fixação, em seguida, rapidamente mergulhar as lâminas em DEPC PBS 6-8 vezes para a lavagem.
- Flick os slides para remover o excesso de DEPC PBS. Certifique-se de que os slides descongelamento etapa não exceda 5 min.
- Colocar as lâminas em uma bandeja limpo (pré-tratado com uma solução de descontaminação da superfície de ARNase para eliminar qualquer vestígio de RNAses) e colocar a 200 ul de solução de anticorpo primário sobre cada lâmina (coelho anti-TH) durante 10 min à temperatura ambiente. Dip desliza rapidamente em DEPC PBS 3 vezes para lavar e agite as lâminas uma vez para remover o excesso de DEPC PBS.
- Colocar 200 mL da solução de anticorpo secundário sobre cada lâmina, durante 6 minutos à temperatura ambiente. Dip desliza rapidamente três vezes em DEPC PBS para lavagem e agite as lâminas para remover o excesso de DEPC PBS.
- Coloque 200 mL da solu ABCção em cada lâmina durante 4 minutos à temperatura ambiente. Dip desliza rapidamente em DEPC PBS 3 vezes para lavar e passar rapidamente os slides para remover o excesso de DEPC PBS.
- Preparar a solução durante 4 minutos de incubação na solução ABC DAB (3,3 'diaminobenzidina). Utilizar os reagentes fornecidos no kit (Kit DAB Peroxidase Substrate). Misturar 1 gota de tampão fornecido, 1 gota de solução de DAB e 1 gota de 30% de H 2 O 2 em 2,5 ml de água DEPC. Misture a solução por inversão.
- Tome 196 ul da solução de DAB e adicionar 4 mL (2%) de solução de inibidor de RNAse apenas antes de se espalhar sobre as lâminas. Colocar as lâminas em uma bandeja limpa (pré-tratados com uma solução de descontaminação RNAse superfície) e colocar os 200 ml de solução de DAB em slides.
Nota: A solução DAB deve reagir within1 ou 2 min. - Dip desliza rapidamente em DEPC PBS 3 vezes para lavar e colocar as lâminas durante alguns segundos em etanol absoluto. Seque as lâminas sacudindo-los no ar (ou usar um ventilador de ar). <br /> NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C para uso futuro ou processados para LCM.
Captura 5. Laser Microdissection
- Descongele os slides rapidamente sacudindo-los no ar (ou usar um ventilador de ar). Certifique-se de que os slides descongelamento etapa não exceda 5 min.
- Prossiga para a LCM. Colocar a lâmina no microscópio com o lado da amostra de frente para a tampa do tubo de coleta. Escolha o melhor de ampliação para a amostra. Ajuste o foco para ver as células de interesse.
- Definir a área de corte e começar a cortar com o laser. Recolhe células dissecadas ou pedaço de tecido na tampa do tubo de recolha cheio com 50 uL de tampão de lise (Kit de extracção de ARN). Certifique-se de que o passo de GCV não exceda 30 min.
- Extrato de RNA total a partir de células isoladas usando um kit de extração de RNA (cf. Lista de materiais). Seguir o protocolo do fabricante.
- Incubar as células recolhidas durante 30 min a 42 ° C alisar as células. Pré-condição a coluna de purificação de ARN por adição de 250 ul de tampão de condicionamento. Carga 50 ul de etanol a de células lisadas. Carregar os 100 ul de células lisadas numa coluna de purificação pré-condicionada.
- Centrifuga-se a coluna a 16.000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lava-se a coluna duas vezes com tampão de lavagem. Eluir no volume mínimo recomendado (11 ul) de RNAse-livre de água (não tratada com DEPC, uma vez que podem interferir com o Bioanalyzer). Mantenha 2 ul a qualidade do teste.
NOTA: Todas as soluções e reagentes são fornecidos no kit.
6. Síntese de cDNA e por RT-PCR quantitativa
- Reverse-transcrever as amostras de ARN a partir de células dopaminérgicas a laser capturado em ADN complementar utilizando transcriptase reversa e o oligo (dT). Seguir o protocolo do fabricante (cf. Lista de material).
- Use 1 ul de ADNc para amplificação de qRT-PCR com iniciadores específicos para o gene. Configure rea PCRCÇÕES em volume de 20 ul com uma mistura de reacção de arranque a quente de um componente para a PCR quantitativa, como recomendado pelo fabricante. Realizar cada reação em triplicado.
- Para as experiências aqui descritas, utilizar os seguintes pares de iniciadores: GAPDH-F (5'-CCA CCC TGG AGA CTG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG GTT CCT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG CTC TGT-3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / AADC-R (5'GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG 3').
- Realizar quantitativo de amplificação por RT-PCR utilizando os seguintes parâmetros de ciclagem rápida: 95 ° C durante 5 min, seguido de 45 ciclos de 10 seg 95 ° C, 10 seg a 60 ° C e 10 seg a 72 ° C. Realizar análise de curva de fusão usando a configuração padrão do instrumento para determiformação de produto homogêneo ne.
- Analisar os dados usando o software embutido.
- Normalizar os valores de genes marcadores da DA e Th AADC expressão com a expressão dos dois genes de referência GAPDH e Rpl13a para se obterem níveis de expressão relativa, conforme descrito anteriormente 14.
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Representative Results
Este procedimento permite a rápida visualização de imunomarcação de células de interesse, mantendo a integridade de ARN. A Figura 1 ilustra os passos da preparação do tecido antes da extracção do ARN. Após cryosectioning, neurónios dopaminérgicos são etiquetados usando um anticorpo dirigido contra a tirosina hidroxilase (neurónios marcados aparecer em castanho). Dependendo da causa experimental, células individuais ou maior região de interesse pode ser isolado utilizando LCM (Figura 1D - E). É importante para avaliar a qualidade do RNA extraído, como o RNA degradado terá um impacto considerável na qualidade da seguinte análise. Cada amostra é assim processado em uma plataforma baseada em Bioanalyzer microfluídica para quantificação e para verificar a integridade do RNA. A Figura 2 mostra os resultados típicos Bioanalyzer de amostras degradadas e de boa qualidade. Ambos gel digital e electroferogramas demonstrar a importância do uso de inibidor de RNAse em cada solbuição para proteger ARN. O valor esperado de RNA extraído de 500 neurônios é de cerca de 1-2 ng. Células microdissecadas a partir de várias secções de tecido podem ser combinadas no mesmo tubo para aumentar a quantidade de RNA.
Figura 1: imunomarcação rápida e captura a laser procedimento microdissection. (A) Esquema mostrando a vista sagital de um cérebro de rato no dia embrionário 15,5. Linha preta indica a localização das regiões ântero-posterior, onde os neurônios de dopamina do mesencéfalo estão localizadas. Seções finas são feitas usando um criostato e sejam recolhidos a membrana revestida lâminas de vidro. Seguindo imunomarcação, neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo são visíveis na cor marrom (B). Amostras Laser microdissectados são coletados em um tampão tubo cheio de tampão de lise (C). Região de interesse (linha azul em D)ou célula individual (E) podem ser dissecados e recuperados na tampa do tubo. Barras de escala: (D) de 250 um, (E) de 50 um.
Figura 2: Controlo de qualidade de amostra de ARN total isolado após microdissecação captura de laser, usando um kit de chip Bioanalyzer (A) O gel digitais obtidas com o Bioanalyzer (L, escada; 1, a amostra 1 sem inibidor de RNAse (RNAsine), a amostra 2 com RNAsine. ). (B) electroferogramas de amostra 1 (painel superior) que mostra ARN parcialmente degradado e da amostra 2 (painel inferior) típico de RNA de boa qualidade (RIN> 8 é aceitavelmente bom) em que os picos 18S / 28S rRNA são claramente visíveis. Níveis de expressão relativa normalizadas representados na mudança vezes para dois genes marcadores DA (TH e AADC) entre circundante unstained t (C)emissão e domínio DA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ponto mais crítico deste método consiste na marcação das células de interesse, evitando a degradação do RNA. Como RNAses estão ativos em soluções aquosas, diminuindo os tempos de incubação melhora a conservação RNA 11,15. Todas as soluções utilizadas devem ser tratada com DEPC para inactivar ARNases. Todos os materiais e as superfícies devem ser tratados com uma solução de ARNase a descontaminação de superfície para evitar a contaminação ARNases. Finalmente, em estas condições, a adição de inibidor de RNAse em todas as soluções é eficaz na conservação de ARN de ser degradado. A utilização de condições salinas elevadas aplicadas durante a incubação do anticorpo foi previamente demonstrado ser eficaz na preservação de RNA 9,10. No entanto, este método alternativo permanece limitada a coloração rápida utilizando anticorpos robustos. A espessura das secções representa outro ponto crítico e depende do tamanho da célula de interesse. Uma vez que o tamanho médio do corpo da célula dos neurónios dopaminérgicos é de cerca de 1081; m, selecionamos esta espessura de corte para obter uma camada de células.
A principal limitação desta técnica em relação ao FACS é o baixo número de células que podem ser microdissectados. É necessário o uso de kit de amplificação de RNA para experimentos de perfis gene usando RNA-seqüenciamento ou microarray 16. No entanto, de qRT-PCR pode ser realizada directamente sem o passo de amplificação (Figura 2c). Avaliação qualitativa da coloração obtida com o protocolo imunomarcação rápida deve ser sempre realizada e não deve diferir da coloração obtida usando o protocolo imunomarcação normal.
Até agora, as experiências de captura a laser foram utilizados principalmente para isolar populações de células de animais transgênicos expressando marcadores como GFP ou utilizando colorações histológicas rápidas, tais como coloração de Nissl. O método aqui apresentado, permite a visualização de células de interesse usando imuno-histoquímica. O isolamento e a aquisição do gene expressão perfil das populações quimicamente identificados de células é agora possível 17. O protocolo aqui descrito pode ser aplicado a todos os tecidos e usado com quaisquer anticorpos adequados.
No cérebro, os neurónios podem ser divididas pela sua localização geográfica, mas a maioria das regiões do cérebro contêm uma variedade de diferentes sub-populações com base na sua identidade química. O padrão de certos tipos de neurónios a expressão do gene pode ser muito diferente de um outro tipo de célula na mesma área cerebral. De acordo com o contexto biológico ou patológico, do perfil de uma população de células específico de expressão génica também pode alterar consideravelmente. Utilizando o processo descrito aqui, é possível acompanhar essas mudanças, abrindo o caminho para novas descobertas 8,18,19.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
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