Summary
Gene analyse de l'expression d'un sous-ensemble de cellules dans un tissu spécifique représente un défi majeur. Cet article décrit comment isoler l'ARN total de haute qualité à partir d'une population de cellules spécifiques en combinant une méthode de immunomarquage rapide avec microdissection laser.
Abstract
microdissection laser (LCM) permet l'isolement de cellules spécifiques de coupes de tissus minces à haute résolution spatiale. LCM efficace nécessite une identification précise des sous-populations de cellules d'un tissu hétérogène. Identification des cellules d'intérêt pour LCM est généralement basée sur des critères morphologiques ou journalistes de protéines fluorescentes. La combinaison de LCM et immunomarquage rapide offre un moyen alternatives et efficaces pour visualiser des types cellulaires spécifiques et de les isoler du tissu environnant. L'ARN de haute qualité peut alors être extraite d'une population cellulaire pur et un traitement supplémentaire pour des applications en aval, y compris l'ARN-séquençage, ou puce à ADN qRT-PCR. Cette approche a déjà été effectuée et a brièvement décrit dans quelques publications. Le but de cet article est d'illustrer comment effectuer immunomarquage rapide d'une population de cellules tout en conservant l'intégrité de l'ARN, et comment isoler ces cellules spécifiques en utilisant LCM. Ici, nous illustronsd de cette procédure à étapes multiples et la capture par immunomarquage des cellules dopaminergiques dans le tissu cérébral de souris une jours d'âge. Nous soulignons étapes critiques clés qui méritent une attention particulière. Ce protocole peut être adapté à une variété de tissus et de cellules d'intérêt. Des chercheurs de différents domaines seront probablement bénéficier de la démonstration de cette approche.
Introduction
Le cerveau est composé d'une grande variété de différents types de neurones formant des réseaux complexes. Ces neurones sont organisés en groupes et sous-groupes distincts en fonction de leur morphologie, la connectivité et l'expression du gène modèle 1. Le développement de puces à ADN, séquençage de nouvelle génération, et qRT-PCR offrir la possibilité de comparer les profils d'expression génique de populations neuronales dans différents contextes biologiques 1,2. Ces analyses sensibles nécessitent l'identification précise et l'isolement de types de cellules d'intérêt tout en maintenant l'intégrité de l'ARN 2-4. Tri cellulaire (FACS) fluorescent activé technique a été largement utilisée pour isoler des types de cellules spécifiques sur la base de marqueurs et / ou morphologie de surface cellulaire. FACS nécessite une étape de dissociation de cellules avant le tri, qui se traduit par une perte complète de 5 résolution spatiale. De nombreux sous-populations neuronales se distinguent les unes des autres en fonction de leur distribution anatomique dans the cerveau. microdissection laser appliqué sur des coupes de cerveau minces fournit une option appropriée pour l'isolement spécifique de cellules à haute résolution spatiale 6-8. Une limite importante de LCM a été la nécessité d'identifier les cellules d'intérêt en fonction de critères morphologiques ou journalistes de protéines fluorescentes génétiquement modifiées dans des modèles animaux. Le développement de nouvelles techniques pour réaliser les méthodes d'immunomarquage rapides qui conservaient l'intégrité de l'ARN, en combinaison avec LCM, permet maintenant l'isolement des sous-populations de cellules pour procéder à des expériences de profilage de gène.
Cette approche a déjà été effectuée et a brièvement décrit dans quelques publications 1,9-13. Ici, nous démontrons une procédure détaillée pour obtenir l'ARN de haute qualité à partir d'un sous-ensemble spécifique de cellules dans une structure de tissus complexes en combinant immunomarquage rapide avec LCM. Nous montrons comment effectuer les étapes clés essentielles pour obtenir la récupération de l'ARN maximale et d'éviter la dégradation de l'ARN comme il peut sigsignificative gène d'impact profilage d'expression.
Pour la démonstration de ce protocole, les neurones dopaminergiques du mésencéphale de la souris d'un jour vieux ont été ciblés. Les neurones dopaminergiques peuvent être immunomarquées utilisant un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (TH), l'enzyme limitant la vitesse pour la synthèse de la dopamine. Suite à une immunocoloration TH, des groupes de neurones dopaminergiques individuel ou peut ensuite être isolé en utilisant LCM. Microdisséquées cellules sont recueillies dans le tampon de lyse, et l'ARN est extrait en utilisant un kit d'isolement d'ARN. Qualité et quantité de l'ARN extrait sont mesurées en utilisant un bioanalyseur 5. Une analyse plus poussée de l'expression génique en utilisant le séquençage d'ARN, puce à ADN, ou qRT-PCR peut ensuite être effectuée 2,4,6. A titre d'exemple, en deux étapes une qRT-PCR est mise en évidence sur les domaines capturé laser dopaminergiques isolé. Quantification relative des niveaux de gènes marqueurs de deux neurones dopaminergiques d'expression illustre la sélectivité de ce protocole.
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Protocol
NOTE: Les expériences ont été effectuées en conformité avec le Guide canadien pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux Laval Université.
Préparation de l'échantillon 1.
NOTE: Dans cet exemple, nous avons utilisé des cerveaux de souris au jour postnatal 1.
- Utilisez l'hypothermie anesthésie glace pilée pendant 3 à 4 min pour les chiots, puis disséquer le cerveau le plus rapidement possible dans un milieu de L15 glacée. Effectuez cette étape à moins de 2 min.
- Transfert disséqué les cerveaux en intégrant moule (cf. La liste du matériel) et remplir avec les médias tissu congelé enrobage en prenant soin d'orienter l'échantillon dans la position souhaitée. Congeler les échantillons immédiatement dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C. Effectuez cette étape dans les 30 secondes.
NOTE: Les échantillons peuvent être conservés quelques mois sans compromettre la qualité de l'ARN.
2. sectionnement
- Traiter coa à membranelames de verre TED (cf. la liste de matériel) avec une solution RNAse de surface de décontamination afin d'éliminer toute trace de RNAses. Laver les lames dans de l'eau DEPC et les laisser sécher. Alternativement, diapositives cuire pendant une nuit à 200 ° C.
- Transférer les échantillons congelés dans un cryostat préalablement nettoyée avec une solution surface RNAse de décontamination. Réglez la température de la chambre cryostat à -20 ° C et tranche spécimens à 10 um d'épaisseur. Recueillir des coupes de tissus sur les lames de membrane enduite et les laisser sécher 10 min avant la coloration. Alternativement, magasin glisse à -80 ° C jusqu'à coloration.
3. Préparation des solutions de coloration
- Préparer toutes les solutions juste avant le début de l'expérience, et en utilisant un inhibiteur de RNAse dans toutes les solutions de coloration (à l'exception des solutions de lavage) afin d'empêcher la dégradation de l'ARN.
- Préparation de la solution tampon. Utiliser le même dans toutes les solutions tampon (composée de RNAse-free solution saline tamponnée au phosphate (PBS) additionné de 1% de BSA,0,2% de Triton et l'inhibiteur de RNAse 2%). Pour chaque lame, préparer 400 ul de solution tampon (200 pi pour la première et 200 ul d'anticorps secondaires).
- Préparer la solution de fixation: utiliser 70% d'éthanol maintenue à -20 ° C. Gardez tissus procédure de fixation minimale pour éviter une réduction drastique du rendement d'extraction de l'ARN.
NOTE: Vous pouvez également utiliser une solution d'éthanol à 95% complété d'acide acétique de 5% maintenue à -20 ° C. - Préparer la solution d'anticorps primaire par dilution de l'anticorps primaire dans la solution tampon. Pour l'étiquetage des neurones dopaminergiques, utiliser un anticorps ciblant la protéine tyrosine hydroxylase (TH, enzyme limitant pour la production de dopamine taux). Utiliser une forte concentration d'anticorps pour compenser le temps d'incubation rapide. Utilisation anticorps TH à une dilution de 1:25.
NOTE: Dans le protocole d'immunofluorescence normale, cet anticorps donne un signal fort quand incubé pendant une nuit à une dilution de 1: 1000. Dans ce protocole, il est utilisé 40X plus concentrated en raison du temps d'incubation est courte. En raison de la forte concentration d'anticorps utilisé pour cette méthode, effectuer une immunocoloration norme en parallèle afin de vérifier toute augmentation de marquage non spécifique. - Préparer la solution d'anticorps secondaire en diluant l'anticorps secondaire dans la solution tampon. Utilisation d'un anticorps secondaire biotinylé à une concentration de 1: 100.
NOTE: Dans cet exemple, nous avons utilisé un anticorps biotinylé anti-lapin. - Préparation du complexe (ABC) solution avidine-biotine pour la détection d'anticorps secondaires biotinylés. Faire ABC solution en ajoutant le composé A et le composé B à une concentration de 1: 100 dilué dans du PBS supplémenté avec du DEPC inhibiteur de RNAse à 2%. Préparation du complexe avidine-biotine 30 min avant de l'ajouter aux diapositives.
4. coloration
- Décongeler une ou deux diapositives à l'époque de -80 ° C en les feuilletant rapidement dans l'air (ou utilisez un ventilateur). Sections surround, avec un hydrophobestylo barrière et laisser sécher pendant quelques secondes.
- Mettre les lames dans la solution de fixateur froid pour pas plus de 5 minutes à -20 ° C. Agiter une fois dans l'air pour éliminer l'excès de solution de fixation, puis, rapidement plonger diapositives en temps DEPC PBS 6-8 pour le lavage.
- Feuilletez les diapositives pour enlever l'excès de DEPC PBS. Veiller à ce que les diapositives étape de dégivrage ne dépasse pas 5 min.
- Placer les lames sur un plateau propre (prétraité avec une solution de décontamination RNAse surface pour éliminer toute trace de RNAses) et mis 200 ul de la solution d'anticorps primaire sur chaque lame (lapin anti-TH) pendant 10 min à température ambiante. Tremper les lames rapidement DEPC PBS trois fois pour le lavage et feuilleter les diapositives une fois pour éliminer l'excès de DEPC PBS.
- Mettre 200 ul de la solution d'anticorps secondaire sur chaque lame pendant 6 min à température ambiante. Tremper les lames rapidement trois fois dans DEPC PBS pour le lavage et feuilleter les diapositives à éliminer l'excès de DEPC PBS.
- Mettez 200 pi de la solu ABCtion sur chaque lame pendant 4 min à température ambiante. Tremper les lames rapidement DEPC PBS trois fois pour le lavage et feuilleter les diapositives pour enlever l'excès DEPC PBS.
- Préparer le DAB (3,3 'diaminobenzidine) la solution pendant 4 min d'incubation dans la solution ABC. Utilisez les réactifs fournis dans le kit (kit DAB substrat de peroxydase). Mélanger une goutte de tampon fourni, une goutte de solution DAB et une baisse de 30% de H 2 O 2 dans 2,5 ml d'eau DEPC. Mélanger la solution en inversant.
- Prendre 196 ul de la solution de DAB et ajoute 4 ul (2%) de solution d'inhibiteur d'ARNase avant étalement sur des lames. Placer les lames sur un plateau propre (prétraité avec une solution de décontamination de RNAse de surface) et mis les 200 pi de solution DAB sur des lames.
NOTE: solution DAB doit réagir within1 ou 2 min. - Tremper les lames rapidement DEPC PBS trois fois pour le lavage et mis diapositives pendant quelques secondes dans de l'éthanol absolu. Sécher les diapositives en les feuilletant dans l'air (ou utilisez un ventilateur). <br /> NOTE: Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou traitées à LCM.
5. Microdissection laser
- Décongelez diapositives rapidement en les feuilletant dans l'air (ou utilisez un ventilateur). Veiller à ce que les diapositives étape de dégivrage ne dépasse pas 5 min.
- Passez à LCM. Placer la lame sous le microscope avec le côté faisant face à l'échantillon le bouchon du tube de collecte. Choisissez le meilleur grossissement pour l'échantillon. Réglez la mise pour voir les cellules d'intérêt.
- Définir la zone de coupe et de commencer à couper avec le laser. Recueillir les cellules disséquées ou un morceau de tissu dans le bouchon du tube de collecte rempli avec 50 ul de tampon de lyse (du kit d'extraction d'ARN). Se assurer que l'étape de LCM ne dépasse pas 30 min.
- Extraire l'ARN total à partir de cellules isolées en utilisant un kit d'extraction d'ARN (cf. La liste des matériaux). Suivre le protocole du fabricant.
- Incuber les cellules recueillies pendant 30 min à 42 ° C etlyser les cellules. Condition préalable de la colonne de purification de l'ARN par addition de 250 ul de tampon de conditionnement. Charge 50 pi d'éthanol à cellules lysées. Charger les 100 pi de cellules lysées sur une colonne de purification préconditionné.
- Centrifuger la colonne à 16 000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. Laver la colonne deux fois avec des tampons de lavage. Eluer dans le volume minimale recommandée (11 pi) d'eau RNAse free (non dépces traités comme il peut interférer avec l'Bioanalyser). Gardez 2 pi à la qualité de test.
NOTE: Toutes les solutions et les réactifs sont fournis dans le kit.
6. Synthèse d'ADNc et RT-PCR quantitative
- Transcrire en inverse des échantillons d'ARN provenant de cellules dopaminergiques laser capturé dans l'ADN complémentaire en utilisant une transcriptase inverse et d'oligo (dT). Suivez le protocole du fabricant (cf. Liste du matériel).
- Utilisez une ul d'ADNc pour l'amplification qRT-PCR avec des amorces spécifiques de gènes. Mettre en place rea PCRctions de volume de 20 pi avec un chaud mélange réactionnel de départ à un composant pour la PCR quantitative que recommandé par le fabricant. Effectuer chaque réaction en trois exemplaires.
- Pour les expériences décrites ici, utiliser les paires d'amorces suivantes: Gapdh-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / Gapdh-R (5'-GGA TGC GAT GAT AGG GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA ACT GCC CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-AAT GAA CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
- Effectuer l'amplification RT-PCR quantitative en utilisant les paramètres de cycles rapides suivantes: 95 ° C pendant 5 min, puis de 45 cycles de 10 sec 95 ° C, 10 sec à 60 ° C et 10 sec à 72 ° C. Effectuer fusion analyse de la courbe en utilisant le réglage par défaut de l'instrument à déterNE formation homogène du produit.
- Analyser les données en utilisant le logiciel intégré.
- Normaliser les valeurs d'expression des gènes marqueurs DA Th AADC et à l'expression des deux gènes de référence GAPDH et Rpl13a pour obtenir des niveaux d'expression relatifs de la manière décrite précédemment 14.
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Representative Results
Cette procédure d'immunomarquage permet de visualiser rapidement les cellules d'intérêt tout en gardant l'intégrité de l'ARN. La figure 1 illustre les étapes de la préparation du tissu avant l'extraction de l'ARN. Après cryosectioning, les neurones dopaminergiques sont marquées en utilisant un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (neurones marqués apparaissent en brun). Selon de la question expérimentale, des cellules individuelles ou plus région d'intérêt peuvent être isolés en utilisant LCM (figure 1D - E). Il est important d'évaluer la qualité de l'ARN extrait, sous forme d'ARN dégradé aura un impact considérable sur la qualité de l'analyse suivante. Chaque échantillon est ainsi traitée sur une plate-forme à base de Bioanalyser microfluidique pour la quantification et pour vérifier l'intégrité de l'ARN. La figure 2 montre des résultats typiques de Bioanalyser d'échantillons dégradés et de bonne qualité. Les deux gel et électrophérogrammes numérique démontrent l'importance d'utiliser un inhibiteur de RNAse dans chaque solution de protéger l'ARN. Le montant prévu de l'ARN extrait à partir de 500 neurones est d'environ 1-2 ng. Microdisséquées cellules de plusieurs coupes de tissus peuvent être regroupés dans le même tube pour augmenter la quantité d'ARN.
Figure 1: immunomarquage rapide et par capture laser de procédure de microdissection. (A) Schéma montrant vue sagittale d'un cerveau de souris au jour embryonnaire 15,5. La ligne noire indique l'emplacement des régions antéro-postérieur où se trouvent les neurones dopaminergiques du mésencéphale. Les lames minces sont faites en utilisant un cryostat et sont collectées sur des lames de verre enduit de membrane. Après immunomarquage, les neurones dopaminergiques du mésencéphale sont visibles en brun (B). Des échantillons de microdissection laser sont recueillies dans un bouchon de tube rempli de tampon de lyse (C). Région d'intérêt (ligne bleue dans D)ou d'une cellule individuelle (E) peut être disséqué et récupérée dans le bouchon du tube. Barres d'échelle: (D) 250 um, (E) 50 pm.
Figure 2: Contrôle de la qualité de l'échantillon d'ARN total isolé après microdissection par capture laser à l'aide d'un kit de puce bioanalyseur (A) Le gel numérique obtenue avec le bioanalyseur (L, échelle; 1, Exemple 1 sans inhibiteur RNAse (RNAsine), de l'échantillon 2 avec RNAsine. ). (B) Electrophérogrammes de l'échantillon 1 (panneau supérieur) montrant ARN partiellement dégradé et l'échantillon 2 (panneau inférieur) typique de l'ARN de bonne qualité (RIN> 8 est acceptable bien) dans lequel les pics 18S / 28S sont clairement visibles. Les niveaux d'expression relatifs normalisés représentés dans le changement fois pour deux gènes marqueurs DA (TH et AADC) entre entourant tache t (C)question et DA domaine. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le point le plus critique de cette méthode consiste à étiqueter les cellules d'intérêt, tout en empêchant la dégradation des ARN. Comme RNAses sont actives dans des solutions aqueuses, ce qui diminue les temps d'incubation permet d'améliorer la conservation de l'ARN 11,15. Toutes les solutions utilisées doivent être traités avec DEPC pour inactiver RNAses. Tous les matériaux et les surfaces doivent être traités avec une solution de décontamination de surface d'ARNase pour empêcher la contamination des RNAses. Enfin, dans ces conditions, l'addition de l'inhibiteur de RNase dans toutes les solutions est efficace pour la préservation de l'ARN d'être dégradée. L'utilisation des conditions salines élevées appliquées pendant anticorps incubation a été précédemment montré pour être efficace dans la préservation de l'ARN 9,10. Cependant, cette méthode reste limitée à une coloration rapide en utilisant des anticorps robustes. L'épaisseur des sections constitue un autre point critique et dépend de la taille de la cellule d'intérêt. Étant donné que la taille moyenne du corps cellulaire des neurones dopaminergiques est d'environ 1081; m, nous sélectionnons cette épaisseur de la section pour obtenir une couche de cellules.
La principale limitation de cette technique par rapport au FACS est le faible nombre de cellules qui peuvent être micro-disséquées. L'utilisation de kit d'amplification d'ARN est nécessaire pour des expériences de profilage des gènes en utilisant l'ARN-séquençage ou microarray 16. Cependant, qRT-PCR peut être réalisée directement, sans l'étape d'amplification (Figure 2c). L'évaluation qualitative de la coloration obtenue avec le protocole de immunomarquage rapide doit toujours être effectué et ne doit pas différer de la coloration obtenue en utilisant le protocole immunomarquage normal.
Jusqu'à présent, les expériences de capture laser ont été principalement utilisés pour isoler des populations de cellules d'animaux transgéniques exprimant des marqueurs comme la GFP ou en utilisant des colorations histologiques rapides tels que coloration de Nissl. La méthode présentée ici permet de visualiser les cellules d'intérêt par immunohistochimie. L'isolement et l'acquisition de la expr géniqueprofil de ession des populations identifiées chimiquement de cellules est maintenant possible 17. Le protocole décrit ici peut être appliqué à tous les tissus et sont utilisés avec des anticorps appropriés.
Dans le cerveau, les neurones peuvent être divisés par leur localisation géographique, mais la plupart des régions du cerveau contiennent une variété de différentes sous-populations en fonction de leur dénomination chimique. Le motif d'expression génique de certains types de neurones peut être en grande partie différente d'un autre type de cellule dans la même région cérébrale. Selon le contexte biologique ou pathologique, le profil d'expression génique d'une population de cellules spécifiques peut également changer considérablement. En utilisant la procédure décrite ici, il est possible de suivre ces changements, ouvrant la voie à de nouvelles découvertes 8,18,19.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
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