Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling

doi: 10.3791/52510 Published: April 11, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Genekspresjon analyse av et undersett av celler i et bestemt vev er en stor utfordring. Denne artikkelen beskriver hvordan du isolerer høy kvalitet total RNA fra en bestemt celle befolkning ved å kombinere en rask immunolabeling metode med laser capture mikrodisseksjon.

Abstract

Laser fangst mikrodisseksjon (LCM) tillater isolering av bestemte celler fra tynne vevssnitt med høy romlig oppløsning. Effektiv LCM krever nøyaktig identifikasjon av celler subpopulasjoner fra et heterogent vev. Identifikasjon av celler av interesse for LCM er vanligvis basert på morfologiske kriterier eller på fluorescerende protein journalister. Kombinasjonen av LCM og hurtig immunolabeling tilbyr en alternativ og effektiv måte for å visualisere spesifikke celletyper, og for å isolere dem fra omgivende vev. Høy kvalitet RNA kan deretter tas ut fra en ren cellepopulasjon og bearbeides videre for nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-sekvensering, microarray eller QRT-PCR. Denne tilnærmingen har tidligere blitt utført og kort beskrevet i noen publikasjoner. Målet med denne artikkelen er å illustrere hvordan du utfører rask immunolabeling av en cellepopulasjon samtidig RNA integritet, og hvordan å isolere disse spesifikke celler ved hjelp LCM. Her, vi illustrered denne multi-trinns prosedyre ved immunolabeling og fange dopaminerge celler i hjernevev fra en-dag-gamle mus. Vi markere viktige kritiske trinn som fortjener spesiell vurdering. Denne protokollen kan tilpasses til en rekke forskjellige vev og celler av interesse. Forskere fra ulike felt vil trolig ha nytte av demonstrasjonen av denne tilnærmingen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjernen består av et stort utvalg av forskjellige typer nevroner som danner komplekse nettverk. Disse nevronene er organisert i forskjellige grupper og undergrupper i henhold til deres morfologi, tilkoblingsmuligheter og genuttrykk mønster 1. Utviklingen av mikromatriser, neste generasjons sekvensering, og QRT-PCR tilbudt muligheten til å sammenligne genekspresjonsprofiler av nevronale populasjoner i ulike biologiske sammenhenger 1,2. Disse sensitive analyser krever presis identifisering og isolering av celletyper av interesse mens du holder RNA integritet 2-4. Fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) teknikken har blitt mye brukt for å isolere spesifikke celletyper basert på celleoverflatemarkører og / eller morfologi. FACS krever en celle dissosiasjon trinn før sortering, noe som resulterer i et fullstendig tap av romlig oppløsning 5. Mange neuronal subpopulasjoner skiller seg fra hverandre i henhold til sin anatomiske fordeling i the hjernen. Laser capture mikrodisseksjon brukes på tynne hjerne seksjoner gir et passende alternativ for spesifikke isolering av celler med høy romlig oppløsning 6-8. En større begrensning av LCM har vært behovet for å identifisere celler av interesse basert på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein reportere genetisk konstruert i dyremodeller. Utvikling av nye teknikker for å utføre raske immunolabeling metoder som bevarte RNA integritet, i kombinasjon med LCM, tillater nå isolering av celleunderpopulasjoner for å fortsette med gen-profilering eksperimenter.

Denne tilnærmingen har tidligere blitt utført og kort beskrevet i noen publikasjoner 1,9-13. Her viser vi en detaljert prosedyre for å oppnå høy kvalitet på RNA fra en spesifikk undergruppe av celler i en kompleks struktur vev ved å kombinere rask immunolabeling med LCM. Vi viser hvordan du utfører viktige kritiske trinn for å oppnå maksimal RNA utvinning og unngå RNA degradering som det kan significantly innvirkning genuttrykk profilering.

For demonstrasjon av denne protokollen, ble dopaminerge nevroner fra en-dags-gamle musehjernen målrettet. Dopaminerge neuroner kan immunolabeled ved hjelp av et antistoff rettet mot tyrosin hydroksylase (TH), det hastighetsbegrensende enzym for dopamin-syntese. Etter TH farging, kan enkeltpersoner eller grupper av dopaminerge nevroner så isoleres ved hjelp av LCM. Microdissected celler er samlet i lyseringsbuffer, og RNA ble ekstrahert ved anvendelse av en RNA-isolering kit. Kvalitet og kvantitet av ekstrahert RNA måles ved hjelp av en Bioanalyzer 5. Videre analyse av genuttrykk ved bruk av: RNA sekvensering, microarray, eller QRT-PCR kan deretter utføres 2,4,6. Som et eksempel, er en to-trinns QRT-PCR demonstrert på laser fanget isolert dopaminerge domener. Relativ kvantifisering av uttrykk nivåer av to dopaminerge nevroner markørgener illustrerer selektivitet av denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Forsøkene ble utført i samsvar med den kanadiske Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Université Laval Animal Protection Committee.

1. Prøvepreparering

MERK: I dette eksemplet bruker vi mus hjerner på postnatal dag 1.

  1. Bruk hypotermi anestesi i knust is i 3 til 4 min for unger, så dissekere hjernen så raskt som mulig i iskaldt L15 medium. Utføre dette trinnet innen 2 min.
  2. Overfør dissekert hjerner i embedding mold (jf. Liste over materiell) og fyll med frossent vev embedding media ta vare for å orientere prøven i ønsket posisjon. Fryse prøver umiddelbart i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. Utføre dette trinnet innen 30 sek.
    MERK: Prøver kan lagres noen måneder uten at RNA kvalitet.

2. Seksjonering

  1. Treat membran coated glass (jf. liste av materiale) med overflate RNAse dekontaminering løsning for å eliminere alle spor av RNases. Vask lysbildene i DEPC vann og la dem tørke. Alternativt bake lysbilder over natten ved 200 ° C.
  2. Overføre frosne prøvene i en kryostat tidligere rengjøres med en overflate RNAse dekontaminering løsning. Still kryostat kammertemperatur på -20 ° C og slice prøvene ved 10 mikrometer tykkelse. Samle vevssnitt på membranen belagt lysbilder og la dem tørke 10 min før farging. Alternativt glir butikken ved -80 ° C til farging.

3. Utarbeidelse av Fargeløsninger

  1. Forberede alle løsninger like før starten av forsøket, og bruke RNAse inhibitor i alle fargeløsninger (med unntak av vaskeløsninger) for å forhindre RNA-degradering.
  2. Forbered bufferløsningen. Bruke den samme buffer i alle løsninger (sammensatt av RNAse-fri fosfat-bufret saltvann (PBS) supplert med 1% BSA,0,2% triton og 2% RNAse inhibitor). For hvert bilde, forberede 400 mL av bufferløsning (200 mikroliter for den primære og 200 mikroliter for de sekundære antistoffer).
  3. Klargjør fiksativ løsning: Bruk 70% etanol holdt ved -20 ° C. Hold vev fiksering prosedyre minimal for å unngå et drastisk reduksjon i RNA-ekstraksjon utbytte.
    MERK: Alternativt kan du bruke 95% etanol løsning supplert av 5% eddiksyre holdt ved -20 ° C.
  4. Klargjør det primære antistoff løsningen ved fortynning av det primære antistoff i bufferløsningen. For dopaminerge nevroner merking, kan du bruke et antistoff rettet mot tyrosinhydroksylase (TH, hastighetsbegrensende enzym for dopamin produksjon). Bruke en høy konsentrasjon av antistoff for å kompensere for den hurtig inkubasjonstid. Bruk TH-antistoff i en fortynning på 1:25.
    NB: I normal immunfluorescens-protokollen, dette antistoff gir et sterkt signal når inkubert over natten ved en fortynning på 1: 1000. I denne protokollen, er det brukt 40X mer Konsentratered grunn av kort inkubasjonstid. På grunn av den høye konsentrasjonen av antistoff som anvendes for denne fremgangsmåte, utføre en standard immunfarging i parallell for å kontrollere en hvilken som helst økning i ikke-spesifikk merking.
  5. Klargjør det sekundære antistoff løsningen ved fortynning av det sekundære antistoff i bufferløsningen. Bruke et biotinylert sekundært antistoff i en konsentrasjon på 1: 100.
    NB: I dette eksempel ble anvendt en anti-kanin-biotinylert antistoff.
  6. Klargjør avidin-biotin kompleks (ABC) løsning for påvisning av biotinylerte sekundære antistoffer. Gjør ABC-løsning ved tilsetning av forbindelsen A og forbindelsen B i en konsentrasjon på 1: 100 fortynnet i DEPC PBS supplert med 2% RNAse inhibitor. Forberede avidinbiotin kompleks 30 min før du legger det til lysbildene.

4. Farging

  1. Tine en eller to lysbilder på tiden fra -80 ° C ved å flikke dem i luften raskt (eller bruke en luftblåser). Surround seksjoner med en hydrofobbarriere penn og la tørke i et par sekunder.
    1. Sett lysbildene i kulden fiksativ løsning for ikke mer enn 5 min ved -20 ° C. Rist en gang i luften for å fjerne overflødig av fiksativ løsning da, raskt dyppe lysbilder i DEPC PBS 6-8 ganger for vask.
    2. Flick lysbildene for å fjerne overflødig av DEPC PBS. Sørg for at lysbildene avriming trinnet ikke overstiger 5 min.
  2. Plasser glir på en ren skuff (forbehandlet med et overflate RNAse dekontaminering løsning for å eliminere eventuelle spor av RNaser) og satt 200 ul av det primære antistoff løsning på hvert objektglass (kanin-anti-TH) i 10 minutter ved romtemperatur. Dukkert glir raskt i DEPC PBS tre ganger for vasking og flick lysbildene gang for å fjerne overskudd av DEPC PBS.
  3. Sett 200 ul av det sekundære antistoff løsning på hvert objektglass i 6 minutter ved romtemperatur. Dip glir raskt tre ganger i DEPC PBS for vasking og flick lysbildene for å fjerne overskudd av DEPC PBS.
  4. Sett 200 mL av ABC oppløsesjon på hvert objektglass i 4 min ved romtemperatur. Dukkert glir raskt i DEPC PBS tre ganger for vasking og flick lysbildene for å fjerne overflødig DEPC PBS.
  5. Klargjør DAB (3,3 'diaminobenzidin) løsning i løpet av 4 min av inkubasjon i ABC-løsning. Bruk reagenser som følger med settet (DAB peroksidasesubstrat Kit). Blande en dråpe av tilgjengelig buffer, en dråpe av DAB-oppløsning og en dråpe av 30% H 2 O 2 i 2,5 ml DEPC vann. Bland løsningen ved å snu.
  6. Ta 196 ul av DAB-løsning og tilsett 4 mL (2%) av RNAse inhibitoren løsning like før påføring av lysbilder. Plasser lysbilder på en ren brett (forbehandlet med en overflate RNAse dekontaminering løsning) og sette de 200 III DAB løsning på lysbilder.
    MERK: DAB-løsning bør reagere within1 eller 2 min.
  7. Dukkert glir raskt i DEPC PBS tre ganger for vask og sette lysbilder for noen sekunder i absolutt etanol. Tørk lysbildene ved å dra dem i luften (eller bruke en luftblåser). <br /> MERK: Slides kan lagres ved -80 ° C for fremtidig bruk eller behandlet for LCM.

5. Laser Capture mikrodisseksjon

  1. Tine lysbilder raskt ved å dra dem i luften (eller bruke en luftblåser). Sørg for at lysbildene avriming trinnet ikke overstiger 5 min.
  2. Fortsett til LCM. Legg objektglasset under mikroskop med prøvesiden som vender mot oppsamlingsrøret hetten. Velg den beste forstørrelse for prøven. Justere fokus for å se cellene av interesse.
    1. Definere klippeområdet og begynne å kutte med laser. Samle dissekert celler eller stykke vev i oppsamlingsrøret hetten fylt med 50 pl av lyseringsbuffer (fra RNA ekstraksjon kit). Sørg for at trinnet av LCM ikke overstiger 30 min.
  3. Ekstraher total RNA fra isolerte celler ved anvendelse av et RNA-ekstraksjon kit (jf. Liste over materialer). Følg produsentens protokoll.
    1. Inkuber oppsamlede celler i 30 minutter ved 42 ° C tillysere cellene. Forutsetning RNA rensekolonnen ved å tilsette 250 ul av kondisjone buffer. Lasten 50 ul etanol i lyserte celler. Laste de 100 ul av lyserte celler på en forbehandlet rensekolonnen.
    2. Sentrifuger kolonnen ved 16.000 xg i 2 min ved romtemperatur. Vask kolonnen to ganger med vaskebuffer. Elueres i den minimale anbefalte volum (11 ul) av RNase-fritt vann (ikke DEPC behandlet som den kan forstyrre den bioanalyser). Hold 2 mL å teste kvaliteten.
      MERK: Alle løsninger og reagenser er gitt i settet.

6. cDNA syntese og kvantitativ RT-PCR

  1. Reverse-transkribere RNA prøver fra laser fanget dopaminerge celler i komplementær DNA ved hjelp av revers transkriptase og oligo (dT). Følg produsentens protokoll (jf. Materialliste).
  2. Bruke en ul cDNA for QRT-PCR-amplifisering med genspesifikke primere. Sett opp PCR reactions i 20 ul volum med en en-komponent varmstart reaksjonsblanding for kvantitativ PCR som anbefalt av produsenten. Utføre hver reaksjon i tre eksemplarer.
    1. For forsøkene beskrevet her, kan du bruke følgende primerparene: 'GAPDH-R / (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3 GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3)'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / AADC-R (5'- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
  3. Utføre kvantitativ RT-PCR amplifisering ved anvendelse av følgende rask sykling parametere: 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 45 sykluser med 10 sek 95 ° C, 10 sek ved 60 ° C og 10 sek ved 72 ° C. Utføre smeltekurve analyse ved hjelp av standardinnstillingen av instrumentet til determine homogent produkt formasjon.
  4. Analysere data ved hjelp av den innebygde programvaren.
    1. Normalisere uttrykk verdier av DA markører gener Th og AADC med uttrykket av de to referanse gener GAPDH og Rpl13a å få relative uttrykk nivåer som beskrevet tidligere 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne raske immunolabeling fremgangsmåte tillater visualisering av celler av interesse, samtidig som RNA integritet. Figur 1 illustrerer de trinn vevspreparat før RNA-ekstrahering. Etter cryosectioning, er dopaminerge neuroner merket ved anvendelse av et antistoff rettet mot tyrosinhydroksylase (merkede nevroner vises i brun). Avhengig av den eksperimentelle spørsmålet kan enkle celler eller større område av interesse bli isolert ved hjelp av LCM (figur 1D - E). Det er viktig å vurdere kvaliteten på RNA ekstrahert, som degradert RNA vil ha en betydelig innvirkning på kvaliteten av følgende analyse. Hver prøve er derfor behandlet på en MicroFluidics-basert plattform bioanalyser for kvantifisering og å sjekke RNA integritet. Figur 2 viser typiske bioanalyser resultater med utarmede og god kvalitet prøver. Både digital gel og electropherograms demonstrere betydningen av å bruke RNAse hemmer i hver solution å beskytte RNA. Den forventede mengden RNA hentet fra 500 nevroner er rundt 1-2 ng. Microdissected celler fra flere vevssnitt kan samles i samme rør for å øke RNA kvantitet.

Figur 1
Figur 1: Rapid immunolabeling og laser capture mikrodisseksjon prosedyre. (A) Skjematisk viser sagittal visning av en musehjerne på embryonale dag 15.5. Svart linje angir plasseringen av de anteroposterior regioner der midthjernen dopaminneuroner er lokalisert. Tynne snitt er laget ved hjelp av en cryostat og samles på membran belagt glassplater. Etter immunolabeling, midthjernen dopaminerge nevroner er synlige i brun (B). Laser microdissected prøver er samlet i et rør hetten fylt med lyseringsbuffer (C). Regionen av interesse (blå linje i D)eller enkelt celle (E) kan dissekert og hentes i røret cap. Skala barer: (D) 250 um, (E) 50 pm.

Figur 2
Figur 2: Kvalitetskontroll av total RNA prøven isolert etter laser fangst mikrodisseksjon ved hjelp av en Bioanalyzer chip sett (A) Den digitale gel oppnådd med Bioanalyzer (L, stige, 1, sample 1, uten RNAse inhibitor (RNAsine), prøve 2 med RNAsine. ). (B) Electropherograms av prøve 1 (øvre panel) som viser delvis degradert RNA og prøve 2 (nedre panel) som er typisk for god kvalitet RNA (RIN> 8 er akseptabel god) hvori 18S / 28S rRNA toppene er klart synlig. (C) Normalisert relative uttrykk nivåer representert i ganger endring for to DA markørgener (TH og AADC) mellom omkringliggende unstained tproblemet og DA domene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den mest kritiske punkt ved denne metode består i merking av celler av interesse, mens hindrer RNA-degradering. Som RNaser er aktive i vandige oppløsninger, mink inkubasjonstider forbedrer RNA bevaring 11,15. Alle løsninger som brukes må behandles med DEPC å inaktivere RNases. Alle materialer og overflater trenger å bli behandlet med et overflate RNAse dekontaminering løsning for å hindre forurensning RNaser. Til slutt, i disse forhold, er tilsetning av RNAse inhibitoren i alle løsningene effektive i å bevare RNA fra å bli degradert. Bruken av høye saltbetingelser som anvendes under antistoff inkubasjon har tidligere blitt vist å være effektiv i å bevare RNA 9,10. Imidlertid er denne alternative metoden er begrenset til rask farging ved hjelp av robuste antistoffer. Tykkelsen av seksjonene representerer et kritisk punkt, og er avhengig av størrelsen på cellen av interesse. Siden den gjennomsnittlige størrelsen på cellelegemet av dopaminerge neuroner er rundt 1081; m, velger vi denne delen tykkelse for å få ett lag med celler.

Den viktigste begrensning av denne teknikken sammenlignet med FACS er den lave antall celler som kan bli microdissected. Bruken av RNA forsterkning sett kreves for genet profilering eksperimenter med RNA-sekvensering eller microarray 16. Imidlertid kan QRT-PCR utføres direkte uten forsterkningstrinn (figur 2c). Kvalitativ vurdering av farging oppnås med hurtig immunolabeling protokollen skal alltid utføres og bør ikke avvike fra fargingen oppnådd ved anvendelse av den normale immunolabeling protokollen.

Inntil nå, var laser capture eksperimenter mest brukt til å isolere populasjoner av celler fra transgene dyr som uttrykker markører som GFP eller ved hjelp av raske histologiske colorations som Nissl farging. Metoden som presenteres her lar visualisere celler av interesse ved hjelp av immunhistokjemi. Isolere og anskaffe genet expression profilen til kjemisk identifiserte populasjoner av celler er nå mulig 17. Protokollen er beskrevet her kan brukes på alle vev og brukes med hvilke som helst egnede antistoffer.

I hjernen, kan neuroner deles av deres geografiske lokalisering, men de fleste områder av hjernen inneholder en rekke forskjellige subpopulasjoner basert på deres kjemiske identitet. Genekspresjonen mønster av visse typer av nevroner kan være i stor grad forskjellig fra en annen celletype i samme hjerneområdet. I henhold til den biologiske eller patologisk sammenheng kan genekspresjon profil av en bestemt cellepopulasjon også endres betydelig. Ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet her, er det mulig å overvåke disse endringene, banet vei for nye funn 8,18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Membrane coated slides  Leica Biosystems 11505158 MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution Life technologies AM9780 RNaseZap
Fixative 70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH  Pel-Freez P40101  1:25
RNAse free buffer DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor Promega N2615 Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated Vector Laboratories BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard Vector Laboratories PK-6100 8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit  Vector Laboratories SK-4100
RNA isolation kit Life technologies KIT0204 Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30% Sigma HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system Leica microsystems Model AS-LMD
DEPC Alfa Aesar B22753-14
Bioanalyzer Agilent Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold  Leica Biosystems 14702218311 6x8mm
Hydrophobic barrier pen  Vector Laboratories H-4000
Frozen tissue embedding media Tissue-Tek 4583
Bioanalyzer chip Aligent Technologies 5067-1513 RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR Roche 6402712001 Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase Life technologies 11752-050 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133, (Pt 7), 2022-2031 (2010).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21, (1), 31-47 (2013).
  3. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
  4. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7, (5), 647-657 (2007).
  5. Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53, (9), 666-672 (2000).
  6. Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40, (4), 241-250 (2009).
  7. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21, (3), 120-125 (2010).
  8. Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
  9. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, (12), 2364-2374 (2009).
  10. Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
  11. Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58, (3), 1346-1353 (2000).
  12. Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18, (1), 19-31 (2005).
  13. Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27, (31), 8314-8323 (2007).
  14. Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
  15. Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8, (2), 246-253 (2006).
  16. Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54, (5), 381-389 (2012).
  17. Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124, (6), 513-521 (2010).
  18. Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
  19. Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1, (6), 475-488 (2008).
RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chabrat, A., Doucet-Beaupré, H., Lévesque, M. RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling. J. Vis. Exp. (98), e52510, doi:10.3791/52510 (2015).More

Chabrat, A., Doucet-Beaupré, H., Lévesque, M. RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling. J. Vis. Exp. (98), e52510, doi:10.3791/52510 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter