Summary
Genekspressionsanalyse af en delmængde af celler i et specifikt væv er en stor udfordring. I denne artikel beskrives, hvordan du isolere høj kvalitet total RNA fra en bestemt celle population ved at kombinere en hurtig immunolabeling metode med laser capture mikrodissektion.
Abstract
Laser capture mikrodissektion (LCM) muliggør isolering af specifikke celler fra tynde vævssnit med høj rumlig opløsning. Effektiv LCM kræver præcis identifikation af celler subpopulationer fra en heterogen væv. Identifikation af celler af interesse for LCM er normalt baseret på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein journalister. Kombinationen af LCM og hurtig immunolabeling tilbyder et alternativ og effektive midler til at visualisere bestemte celletyper og isolere dem fra omgivende væv. Høj kvalitet RNA kan derefter udvindes fra en ren cellepopulation og viderebehandles for downstream-applikationer, herunder RNA-sekventering, microarray eller QRT-PCR. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet udført, og kort beskrevet i nogle publikationer. Målet med denne artikel er at illustrere, hvordan du udfører hurtig immunolabeling af en celle population samtidig holde RNA integritet, og hvordan man isolere disse specifikke celler ved anvendelse LCM. Heri vi illustrered denne multi-trins procedure immunolabeling og opfange dopaminerge celler i hjernevæv fra en dag gamle mus. Vi fremhæve vigtige kritiske skridt, der fortjener særlig opmærksomhed. Denne protokol kan tilpasses til en række af væv og celler af interesse. Forskere fra forskellige områder vil sandsynligvis drage fordel af demonstration af denne fremgangsmåde.
Introduction
Hjernen består af en lang række forskellige neuron typer danner komplekse netværk. Disse neuroner er organiseret i forskellige grupper og undergrupper efter deres morfologi, tilslutningsmuligheder og genekspression mønster 1. Udviklingen af microarrays, næste generation sekventering, og QRT-PCR tilbydes mulighed for at sammenligne genekspression profiler af neuronale populationer i forskellige biologiske sammenhænge 1,2. Disse følsomme analyser kræver præcis identifikation og isolering af celletyper af interesse samtidig holde RNA integritet 2-4. Fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) teknik er i vid udstrækning blevet anvendt til at isolere specifikke celletyper baseret på celleoverflademarkører og / eller morfologi. FACS kræver en celle dissociation trin forud for sortering, hvilket resulterer i et fuldstændigt tab af rumlig opløsning 5. Mange neuronale subpopulationer skelnes fra hinanden efter deres anatomiske fordeling i the hjernen. Laser capture mikrodissektion anvendt på tynde hjernesnit giver en passende mulighed for specifik isolering af celler med høj rumlig opløsning 6-8. En væsentlig begrænsning af LCM har været behovet for at identificere celler af interesse baseret på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein reportere gensplejsede i dyremodeller. Udviklingen af nye teknikker til at udføre hurtige immunolabeling metoder, bevarede RNA integritet, kombineret med LCM, tillader nu isolering af cellesubpopulationer at gå videre med gen-profilering eksperimenter.
Denne fremgangsmåde er tidligere blevet udført, og kort beskrevet i nogle publikationer 1,9-13. Her viser vi en detaljeret procedure for at opnå høj kvalitet RNA fra en specifik undergruppe af celler i en kompleks vævsstruktur ved at kombinere hurtig immunmærkning med LCM. Vi viser, hvordan du udfører vigtige kritiske skridt til at opnå maksimal RNA genvinding og undgå RNA nedbrydning, da det kan SIGligt effekt genekspression profilering.
Til demonstration af denne protokol blev dopaminerge neuroner fra en dage gammel mus midthjernen målrettet. Dopaminerge neuroner kan immunolabeled anvendelse af et antistof rettet mod tyrosin hydroxylase (TH), det hastighedsbegrænsende enzym for dopamin-syntese. Efter TH immunfarvning, kan enkelte eller grupper af dopaminerge neuroner derefter isoleres ved hjælp af LCM. Mikrodissekterede celler opsamles i lysepuffer, og RNA ekstraheres ved hjælp af en RNA isolation kit. Kvaliteten og mængden af ekstraheret RNA måles ved hjælp af en Bioanalyzer 5. Yderligere analyse af genekspression ved anvendelse: RNA-sekventering, microarray, eller QRT-PCR kan efterfølgende udføres 2,4,6. Som et eksempel, er en to-trins QRT-PCR demonstreret på laser fanget isoleret dopaminerge domæner. Relativ kvantificering af ekspressionsniveauer af to dopaminerge neuron markørgener illustrerer selektivitet af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Forsøgene blev udført i overensstemmelse med den canadiske Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Udvalget for Université Laval Animal Protection.
1. Prøvefremstilling
BEMÆRK: I dette eksempel brugte vi hjerner musen på postnatal dag 1.
- Brug hypotermi anæstesi i knust is i 3 til 4 min for hvalpe, så dissekere hjerner så hurtigt som muligt i iskold L15 medium. Udfør dette trin inden for 2 min.
- Overfør dissekeret hjerner i indlejring skimmel (jf. Liste over materiel) og fyld med frosne væv indlejring medier tog sig til at orientere prøven i den ønskede position. Frys prøver straks i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Udfør dette trin inden for 30 sek.
Bemærk: Prøver kan opbevares måneder uden at kompromittere RNA kvalitet.
2. Sektionsinddeling
- Treat membran CoATed objektglas (jf. listen over materialer) med overflade RNAse dekontaminering løsning til at fjerne ethvert spor af RNAser. Vask dias i DEPC vand og lad dem tørre. Alternativt bage slides natten over ved 200 ° C.
- Overførsel frosne prøver i en kryostat forvejen er renset med en overflade RNAse dekontaminering opløsning. Indstil kryostatkammeret temperatur på -20 ° C og skive prøver på 10 um tykkelse. Saml vævssnit på membranen coatede objektglas og lad dem tørre 10 min før farvning. Alternativt butik glider ved -80 ° C indtil farvning.
3. Fremstilling af farvningsopløsninger
- Forbered alle opløsninger lige før starten af eksperimentet og anvende RNAse-inhibitor i alle farvningsopløsninger (undtagen vaskeopløsninger) for at forhindre RNA-nedbrydning.
- Forbered bufferopløsning. Brug samme buffer i alle opløsninger (sammensat af RNAse-fri phosphatbufret saltvand (PBS) suppleret med 1% BSA,0,2% Triton og 2% RNAse inhibitor). For hvert dias, forberede 400 pi bufferopløsning (200 pi til de primære og 200 pi for de sekundære antistoffer).
- Forbered fikseringsopløsning: Brug 70% ethanol holdt ved -20 ° C. Vævsfiksering procedure Hold minimal for at undgå en drastisk reduktion i RNA-ekstraktion udbytte.
Bemærkning: Alternativt bruge 95% ethanol opløsning suppleret med 5% eddikesyre holdt ved -20 ° C. - Forbered det primære antistof ved at fortynde det primære antistof i pufferopløsningen. For dopaminerge neuroner mærkning bruge et antistof rettet mod tyrosinhydroxylase (TH, hastighedsbegrænsende enzym for dopamin produktion). Brug en høj koncentration af antistof til at kompensere for den hurtige inkubationstid. Brug TH antistof ved en fortynding på 1:25.
BEMÆRK: Ved normal immunofluorescens-protokol, dette antistof giver et stærkt signal, når de inkuberes natten over ved en fortynding på 1: 1.000. I denne protokol, er det brugt 40X mere koncentrated grund af den korte inkubationstid. På grund af den høje koncentration af antistof, der anvendes til denne fremgangsmåde, udføre en standard immunfarvning parallelt for at kontrollere enhver stigning i ikke-specifik mærkning. - Forbered det sekundære antistof ved at fortynde det sekundære antistof i pufferopløsningen. Brug et biotinyleret sekundært antistof ved en koncentration på 1: 100.
BEMÆRK: I dette eksempel anvendte vi et anti-kanin biotinyleret antistof. - Forbered avidin-biotin-kompleks (ABC) opløsning til påvisning af biotinylerede sekundære antistoffer. Gør ABC opløsning ved tilsætning af forbindelsen A og forbindelsen B ved en koncentration på 1: 100 fortyndet i DEPC PBS suppleret med 2% RNAse inhibitor. Forbered Avidin-biotin kompleks 30 min før du tilføjer den til dias.
4. Farvning
- Optø en eller to glider på tidspunktet fra -80 ° C ved hurtigt zappe dem i luften (eller bruge en luft blæser). Surround sektioner med en hydrofobbarriere pen og lad tørre i et par sekunder.
- Sæt objektglassene i kulden fikseringsopløsning for ikke mere end 5 minutter ved -20 ° C. Ryst gang i luften for at fjerne overskud af fikseringsopløsning derefter hurtigt dyppe slides i DEPC PBS 6-8 gange vask.
- Flick dias for at fjerne overskud af DEPC PBS. Sørg for, at dias afrimning skridt ikke overstiger 5 min.
- Glassene anbringes på en ren bakke (forbehandlet med en overflade RNAse dekontaminering løsning for at fjerne ethvert spor af RNAser) og sat 200 pi af det primære antistof løsning på hvert objektglas (kanin-anti-TH) i 10 minutter ved stuetemperatur. Dip glider hurtigt i DEPC PBS 3 gange vask og bladre gliderne gang for at fjerne overskuddet af DEPC PBS.
- Sæt 200 pi af det sekundære antistof løsning på hvert objektglas i 6 min ved stuetemperatur. Dip glider hurtigt 3 gange i DEPC PBS til vask og svirp dias for at fjerne overskud af DEPC PBS.
- Sæt 200 pi af ABC Solution på hvert objektglas i 4 minutter ved stuetemperatur. Dip glider hurtigt i DEPC PBS 3 gange til vask og svirp dias for at fjerne den overskydende DEPC PBS.
- Forbered DAB (3,3 'diaminobenzidin) opløsning i 4 min inkubation i ABC-opløsning. Brug reagenserne leveret i kittet (DAB peroxidasesubstrat Kit). Bland 1 dråbe billede buffer, 1 dråbe DAB-opløsning og 1 dråbe af 30% H 2 O 2 i 2,5 ml DEPC vand. Bland opløsningen ved at vende.
- Tag 196 pi af DAB og der tilsættes 4 pi (2%) af RNAse inhibitor opløsning lige før spredning på objektglas. Glassene anbringes på en ren bakke (forbehandlet med en overflade RNAse dekontaminering opløsning) og sætte 200 pi DAB løsning på dias.
BEMÆRK: DAB opløsning skal reagere within1 eller 2 min. - Dip glider hurtigt i DEPC PBS 3 gange til vask og sætte dias for få sekunder i absolut ethanol. Tør dias ved at bladre dem i luften (eller bruge en luft blæser). <br /> BEMÆRK: Slides kan opbevares ved -80 ° C til senere brug eller forarbejdet til LCM.
5. Laser Capture mikrodissektion
- Afrimning slides hurtigt ved at svirpe dem i luften (eller bruge en luft blæser). Sørg for, at dias afrimning skridt ikke overstiger 5 min.
- Fortsæt til LCM. Placer dias under mikroskop med prøven side mod indsamling rør cap. Vælg den bedste forstørrelse for prøven. Juster fokus at se cellerne af interesse.
- Definer skæreområdet og begynde at skære med laser. Saml dissekerede celler eller stykke væv i indsamling hætten fyldt med 50 pi lysisbuffer (fra RNA-ekstraktion kit). Kontroller, at trinnet med LCM ikke overstiger 30 min.
- Uddrag total RNA fra isolerede celler under anvendelse af et RNA-ekstraktionskit (jf. Liste over materialer). Følg producentens protokol.
- Inkuber opsamlede celler i 30 minutter ved 42 ° C tillysere cellerne. Pre-tilstand RNA oprensningssøjle ved tilsætning 250 pi conditioning buffer. Load 50 pi ethanol til lyserede celler. Indlæs 100 pi lyserede celler på en prækonditionerede oprensningssøjle.
- Centrifugeres søjlen ved 16.000 xg i 2 min ved stuetemperatur. Vask kolonnen to gange med vaskebuffere. Elueres i den minimale anbefalede volumen (11 pl) af RNAse-frit vand (ikke DEPC behandlet, da det kan forstyrre bioanalyser). Hold 2 pi til test kvalitet.
BEMÆRK: Alle løsninger og reagenser findes i sættet.
6. cDNA-syntese og kvantitativ RT-PCR
- Reverse-transskribere RNA-prøver fra laser fanget dopaminerge celler i komplementært DNA under anvendelse af revers transkriptase og oligo (dT). Følg producentens protokol (jf. Liste af materiale).
- Brug 1 pi cDNA for QRT-PCR-amplifikation med genspecifikke primere. Opsæt PCR reaKTIONER i 20 pi volumen med en enkomponent hot start reaktionsblanding til kvantitativ PCR som anbefalet af producenten. Udfør hver reaktion i tre eksemplarer.
- For forsøgene her beskrevne, bruge følgende primerpar: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC-3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'CAT GAG AGC TTC TGC FTT TC -3) / AADC-R (5'GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3).
- Udfør kvantitativ RT-PCR-amplifikation under anvendelse af følgende hurtige cyklusparametre: 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 45 cykler af 10 sek 95 ° C, 10 sekunder ved 60 ° C og 10 sekunder ved 72 ° C. Udfør smeltekurveanalyse hjælp standardindstillingen af instrumentet til determine homogent produkt formation.
- Analysere dataene ved hjælp af den indbyggede software.
- Normalisere udtrykket værdier for DA-markører gener Th og AADC med ekspressionen af de to referencepunkter gener GAPDH og Rpl13a at opnå relative ekspressionsniveauer som beskrevet tidligere 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne hurtige immunolabeling procedure tillader visualisering af celler af interesse og samtidig holde RNA integritet. Figur 1 illustrerer trinnene forberedelse væv før RNA-ekstraktion. Efter cryosectioning er dopaminerge neuroner mærket under anvendelse af et antistof rettet mod tyrosin hydroxylase (mærkede neuroner vises i brun). Afhængig af den eksperimentelle spørgsmål, kan enkelte celler eller større område af interesse isoleres ved anvendelse af LCM (figur 1D - E). Det er vigtigt at vurdere kvaliteten af RNA ekstraheret, som forringet RNA vil have en betydelig indvirkning på kvaliteten af den følgende analyse. Hver prøve er således behandlet på en mikrofluidik-baseret platform bioanalyser til kvantificering og kontrollere RNA integritet. Figur 2 viser typiske bioanalyser resultater af nedbrudte og god kvalitet prøver. Både digital gel og elektroferogrammer demonstrere vigtigheden af at anvende RNAse inhibitor i hver solution at beskytte RNA. Den forventede mængde RNA udvundet fra 500 neuroner er omkring 1-2 ng. Mikrodissekterede celler fra flere vævssnit kan samles i det samme rør til at øge RNA mængde.
Figur 1: Hurtig immunolabeling og laser capture mikrodissektion procedure. (A) Skematisk viser sagittal afbildning af en musehjerne på embryonisk dag 15.5. Sort linje angiver placeringen af de anteroposteriore regioner, hvor midthjernen dopamin neuroner er placeret. Tynde sektioner er fremstillet under anvendelse af en kryostat og samles på membran belagt objektglas. Efter immunolabeling, midterhjernedopaminerge neuroner er synlige i brun (B). Laser mikrodissekeres opsamles i et rør hætte fyldt med lysispuffer (C). Område af interesse (blå linje i D)eller individuel celle (E) kan dissekeres og hentes i røret hætten. Scale barer: (D) 250 um, (E) 50 um.
Figur 2: Kvalitetskontrol af total RNA-prøve isoleret efter laser capture microdissection hjælp af en Bioanalyzer chip kit (A) Den digitale opnåede gel med Bioanalyzer (L, stigen; 1, prøve 1 uden RNAse inhibitor (RNAsine), prøve 2 med RNAsine. ). (B) elektroferogrammer for stikprøve 1 (øverste panel) viser delvist nedbrudt RNA og prøve 2 (nederste panel) typisk af god kvalitet RNA (RIN> 8 er acceptabel god), hvor 18S / 28S rRNA toppe er klart synlige. (C) normaliseret i forhold ekspressionsniveauer repræsenteret i fold ændring for to OB markørgener (TH og AADC) mellem omgivende uplettet tspørgsmål og DA domæne. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske punkt af denne metode består i mærkning celler af interesse samtidig forhindre RNA-nedbrydning. Da RNAser er aktive i vandige opløsninger, faldende inkubationstider forbedrer RNA bevaring 11,15. Alle reagenser, der skal behandles med DEPC at inaktivere RNAser. Alle materialer og overflader skal behandles med en overflade RNAse dekontaminering løsning for at forhindre RNAser kontaminering. Endelig, under disse betingelser, tilsætning af RNAse inhibitor i alle opløsninger er effektiv i at bevare RNA bliver nedbrudt. Anvendelsen af høje saltbetingelser anvendt i løbet af antistof inkubation er tidligere blevet vist at være effektiv i at bevare RNA 9,10. Men denne alternative metode er begrænset til hurtig farvning hjælp robuste antistoffer. Tykkelsen af sektionerne er en anden kritisk punkt og afhænger af størrelsen af cellen af interesse. Da den gennemsnitlige størrelse af cellen kroppen af dopaminerge neuroner er omkring 1081 m, vælger vi dette afsnit tykkelse for at opnå et lag af celler.
Den største begrænsning ved denne teknik i forhold til FACS er det lave antal af celler, som kan mikrodissekeret. Er påkrævet for gen profilering eksperimenter under anvendelse af RNA-sekventering eller microarray 16 Anvendelse af RNA-amplifikation kit. Imidlertid kan QRT-PCR udføres direkte uden amplifikationstrinnet (figur 2c). Kvalitativ vurdering af farvningen opnået med den hurtige immunolabeling protokollen skal altid udføres, og bør ikke afvige fra farvningen opnået ved hjælp af den normale immunolabeling protokollen.
Indtil nu blev laser capture eksperimenter meste bruges til at isolere populationer af celler fra transgene dyr, der udtrykker markører som GFP eller anvender hurtige histologiske farvninger som Nissl farvning. Den præsenteres her metode gør det muligt at visualisere celler af interesse ved hjælp af immunhistokemi. Isolering og erhverve genet expression profil kemisk identificerede populationer af celler er nu muligt 17. Den her beskrevne protokol kan anvendes til alle væv og bruges sammen med egnede antistoffer.
I hjernen kan neuroner divideres med deres geografiske lokalisering, men de fleste områder af hjernen indeholder en række forskellige subpopulationer på grundlag af deres kemiske identitet. Genet ekspressionsmønster af visse typer neuroner kan være stort set forskellig fra en anden celletype i samme cerebral område. Ifølge den biologiske eller patologisk sammenhæng kan genekspression profil af en specifik cellepopulation også ændre sig betydeligt. Ved anvendelse af proceduren er beskrevet her, er det muligt at overvåge disse ændringer, der baner vejen for nye opdagelser 8,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
