Summary
ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.
Abstract
microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר הבידוד של תאים ספציפיים מסעיפי רקמות דקים עם רזולוציה מרחבית גבוהה. LCM האפקטיבי דורש זיהוי מדויק של תת-אוכלוסיות תאים מרקמות הטרוגנית. זיהוי של תאים בעלי העניין לLCM מבוסס בדרך כלל על קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי. השילוב של LCM וimmunolabeling המהיר מציע אמצעים חלופיים ויעילים כדי להמחיש סוגי תאים מסוימים ולבודד אותם מרקמה הסובבת. RNA באיכות גבוהה אז יכול להיות שחולץ מאוכלוסיית תא טהורה ועיבוד נוסף ליישומים במורד הזרם, כולל RNA-רצף, microarray או qRT-PCR. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש כיצד לבצע immunolabeling המהיר של אוכלוסיית תא, תוך שמירה על שלמות RNA, ואיך לבודד תאים הספציפיים אלה באמצעות LCM. במסמך זה, אנו ממחישיםד הליך רב-שלבים זה על ידי immunolabeling ולכידת תאי דופאמין ברקמת מוח מעכברים ליום אחד-עשר. אנו מדגישים את שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של רקמות ותאים של עניין. חוקרים מתחומים שונים צפויים ליהנות מההפגנה של גישה זו.
Introduction
המוח מורכב ממגוון גדול של סוגים שונים נוירון יוצרים רשתות מורכבות של. נוירונים אלה מאורגנים בקבוצות ותת-קבוצות שונות בהתאם לדפוס מורפולוגיה, הקישוריות וביטוי הגנים שלהם 1. הפיתוח של microarrays, הרצף של הדור הבא, וqRT-PCR הציעו את האפשרות להשוות פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות נוירונים בהקשרים ביולוגיים שונים 1,2. ניתוחים רגישים אלה דורשים זיהוי ובידוד המדויקים של סוגי תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA 2-4. טכניקת פלורסנט הופעלה תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב לבודד את סוגי תאים ספציפיים המבוססים על סמנים על פני קרום תא ו / או מורפולוגיה. FACS דורש צעד ניתוק תא לפני המיון, שתוצאתה אובדן הרזולוציה מרחבית 5 מלא. תת-אוכלוסיות עצביות רבות נבדלות זו מזו על פי ההתפלגות האנטומי שלהם בהמוח אלקטרוני. microdissection ללכוד לייזר מיושם על חלקים במוח דקים מספק אפשרות מתאימה לבידוד ספציפי של תאים עם רזולוציה מרחבית גבוהה 6-8. מגבלה העיקרית של LCM הייתה הצורך לזהות תאים של עניין על פי קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי המהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים. הפיתוח של טכניקות חדשות לביצוע שיטות immunolabeling מהירות שהשתמרו שלמות RNA, בשילוב עם LCM, עכשיו מאפשר הבידוד של אוכלוסיות תאים להמשיך בניסויי פרופיל-גן.
גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים 1,9-13. הנה, אנחנו מדגימים נוהל מפורט להשגת RNA באיכות גבוהה מקבוצת משנה ספציפית של תאים במבנה רקמה מורכב על ידי שילוב של immunolabeling מהיר עם LCM. אנו מראים כיצד לבצע שלבים קריטיים מפתח להשגת התאוששות RNA מקסימאלי ולהימנע משפלת RNA כפי שהוא עשוי sigהפרופיל של התבטאות הגנים השפעת nificantly.
להפגנה של פרוטוקול זה, נוירונים דופאמין מהמוח תיכון עכבר יום אחד-עשר היו ממוקדים. ניתן immunolabeled נוירונים דופאמין באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (TH), אנזים שער הגבלה לסינתזת דופמין. בעקבות immunostaining TH, בודד או קבוצות של נוירונים דופאמין אז יכול להיות מבודדות באמצעות LCM. תאי microdissected נאספים במאגר תמוגה, ו- RNA מופק באמצעות ערכת בידוד RNA. איכות וכמות של RNA שחולץ נמדדות באמצעות bioanalyzer 5. ניתוח נוסף של ביטוי גנים באמצעות: רצף RNA, microarray, או qRT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע 2,4,6. כדוגמא, שני שלבים qRT-PCR בא לידי הביטוי בתחומי דופאמין המבודד הלייזר שנתפס. כימות יחסי של רמות הביטוי של גני סמן נוירון שני דופאמין ממחיש את הסלקטיביות של פרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הניסויים בוצעו בהתאם למדריך הקנדי לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים Laval Université ההגנה.
הכנת 1. לדוגמא
הערה: בדוגמא זו, השתמשנו המוח של עכבר ביום הלידה 1.
- השתמש בהרדמת היפותרמיה בקרח כתוש במשך 3 עד 4 דקות לגורים, ואז לנתח את המוח במהירות אפשרית במדיום L15 קר כקרח. לבצע שלב זה תוך 2 דקות.
- מוח העברה גזור בהטבעת עובש (cf. רשימה של אמצעי) ולמלא עם תקשורת רקמה קפוא הטבעה מקפידה לכוון את הדגימה במיקום הרצוי. להקפיא דגימות מייד בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לבצע שלב זה תוך 30 שניות.
ניתן לאחסן דגימות כמה חודשים מבלי להתפשר על איכות RNA: הערה.
2. חתך
- תעודת המקוריות קרום פינוקשקופיות זכוכית טד (cf. רשימה של חומר) עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses. שטוף את השקופיות במי DEPC ולתת להם להתייבש. לחלופין, מגלשות לאפות הלילה ב 200 ° C.
- העבר את הדגימות קפואות בcryostat ניקתה בעבר עם פתרון טיהור RNAse פני השטח. טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ב -20 דגימות C ° ופרוסה בעובי 10 מיקרומטר. לאסוף חלקי רקמות בשקופיות הקרום מצופה ולתת להם להתייבש 10 דקות לפני הצביעה. לחלופין, חנות מחליקה ב -80 ° C עד צביעה.
3. הכנת פתרונות מכתים
- הכן את כל הפתרונות רק לפני תחילת הניסוי, ולהשתמש במעכב RNAse בכל הפתרונות מכתים (פרט לפתרוני כביסה) כדי למנוע השפלה RNA.
- הכן את פתרון החיץ. השתמש באותו החיץ בכל הפתרונות (מורכב מפוספט שנאגרו מלוח RNAse חינם (PBS) בתוספת של BSA 1%,טריטון 0.2% ו -2% מעכב RNAse). עבור כל שקופית, להכין 400 μl של פתרון חיץ (200 μl לעיקרי ו -200 μl לנוגדנים משני).
- הכן את הפתרון מקבע: להשתמש באתנול 70% המשיך ב -20 ° C. שמור הליך קיבעון רקמות מינימאלי כדי למנוע ירידה דרסטית בתשואות הפקת RNA.
הערה: לחלופין, להשתמש 95% אתנול פתרון בתוספת של 5% חומצה אצטית המשיך ב -20 ° C. - הכן את פתרון הנוגדן הראשוני על ידי דילול הנוגדן הראשוני בפתרון החיץ. לתיוג נוירונים דופאמין, להשתמש נוגדן מיקוד hydroxylase טירוזין (TH, שיעור הגבלת אנזים לייצור דופמין). השתמש בריכוז גבוה של נוגדנים, כדי לפצות על זמן דגירה מהיר. השתמש נוגדן TH בדילול של 01:25.
הערה: בפרוטוקול immunofluorescence נורמלי, נוגדן זה נותן איתות חזקה כאשר מודגרות לילה בדילול של 1: 1,000. בפרוטוקול זה, הוא משמש 40X תרכיזי יותראד בשל זמן דגירה הקצר. בשל הריכוז הגבוה של נוגדן המשמש לשיטה זו, לבצע immunostaining סטנדרטי במקביל על מנת לבדוק כל גידול בתיוג שאינו ספציפי. - הכן את פתרון נוגדנים משני על ידי דילול הנוגדנים משני בפתרון החיץ. השתמש נוגדנים משני biotinylated בריכוז של 1: 100.
הערה: בדוגמא זו, השתמשנו נוגדני biotinylated נגד ארנב. - הכן את פתרון avidin ביוטין המורכב (ABC) לצורך זיהוי של נוגדנים משני biotinylated. הפוך פתרון ABC על ידי הוספת המתחם והמתחם B בריכוז של 1: 2% מעכב RNAse 100 מדוללים בDEPC PBS בתוספת. הכן את 30 דקות המורכבות avidin-ביוטין לפני הוספתו לשקופיות.
4. מכתים
- להפשיר שקופיות אחד או שתיים בזמן מ-80 ° C על ידי מצליף אותם באוויר במהירות (או להשתמש במפוח אוויר). חלקי Surround עם הידרופוביעט ומחסום לתת יבש למשך כמה שניות.
- שים את השקופיות בפתרון מקבע הקר ללא יותר מ 5 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לנער פעם אחת באוויר כדי להסיר את העודפים של פתרון מקבע אז, במהירות לטבול שקופיות בזמנים DEPC PBS 6-8 לשטיפה.
- גרור את השקופיות כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS. ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות.
- מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses) ולשים 200 μl של פתרון הנוגדן הראשוני על כל שקופית (ארנב נגד TH) במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות פעם אחת כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS.
- שים 200 μl של פתרון נוגדנים משני על כל שקופית במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות 3 פעמים בDEPC PBS לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את עודף DEPC PBS.
- שים 200 μl של solu ABCtion על כל שקופית במשך 4 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את DEPC עודף PBS.
- הכן את DAB (diaminobenzidine 3,3) פתרון בדקות 4 של דגירה בפתרון ABC. השתמש בחומרים הכימיים המסופקים בערכה (קיט DAB Peroxidase מצע). לערבב 1 טיפה של חיץ סיפק, 1 טיפה של פתרון DAB ו1 טיפה של 30% H 2 O 2 ב2.5ml מים DEPC. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך.
- קח 196 μl של פתרון DAB ולהוסיף 4 μl (2%) של פתרון מעכב RNAse רק לפני הפצה בשקופיות. מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse משטח) ולשים 200 μl של פתרון DAB בשקופיות.
הערה: פתרון DAB צריך להגיב within1 או 2 דקות. - טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה ולשים שקופיות לכמה שניות באתנול מוחלט. ייבש את השקופיות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). <br /> הערה: שקופיות ניתן לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי או מעובד לLCM.
Microdissection לכידה 5. לייזר
- להפשיר שקופיות במהירות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות.
- המשך LCM. מניחים את השקף מתחת למיקרוסקופ עם צד המדגם מול כובע צינור האיסוף. בחר את ההגדלה הטובה ביותר למדגם. התאם את המיקוד כדי לראות את התאים של עניין.
- הגדר את אזור החיתוך ולהתחיל לחתוך עם הלייזר. איסוף תאים או פיסת הרקמה בכובע צינור איסוף מלא 50 μl של חיץ תמוגה (מערכת חילוץ RNA) גזורים. ודא שהצעד של LCM אינו עולה על 30 דקות.
- לחלץ RNA הכולל מהתאים מבודדים באמצעות ערכת חילוץ RNA (cf. רשימת חומרים). עקוב הפרוטוקול של היצרן.
- דגירה תאים שנאספו במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס לlyse התאים. תנאי מוקדם עמודת טיהור RNA על ידי הוספת 250 μl של חיץ אוויר. עומס 50 μl של אתנול לתאי lysed. לטעון תאי lysed 100 μl על עמודת טיהור preconditioned.
- צנטריפוגה העמודה ב16,000 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף את העמודה פעמיים עם מאגרי כביסה. Elute בהיקף המינימלי המומלץ (11 μl) של המים RNase חינם (לא טופל DEPC כפי שעלול להפריע לbioanalyser). שמור 2 μl לאיכות בדיקה.
הערה: כל הפתרונות לאספקת מים מסופקים בערכה.
6. cDNA סינתזה וכמוני RT-PCR
- הפוך-לתמלל דגימות RNA מתאי דופאמין לייזר שנתפס לתוך ה- DNA משלים באמצעות transcriptase ההפוך ואוליגו (DT). עקוב הפרוטוקול של היצרן (cf. רשימה של חומר).
- השתמש 1 μl של cDNA להגברת qRT-PCR עם פריימרים גן ספציפי. מחשבה PCR להגדירctions ב -20 μl נפח עם תערובת תגובת ההתחלה חמה אחד מרכיבים לPCR כמותי כפי שהומלץ על ידי היצרן. לבצע כל תגובה בשלושת עותקים.
- לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בזוגות פריימר הבאים: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); ה-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); Aadc-F (5'- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / Aadc-R (5'- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3 ").
- לבצע הגברה RT-PCR באמצעות פרמטרי הרכיבה מהירים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 45 מחזורים של 10 שניות 95 ° C, 10 שניות על 60 מעלות צלזיוס ו -10 שניות על 72 מעלות צלזיוס. לבצע ניתוח עקום התכה באמצעות הגדרת ברירת המחדל של המכשיר לdetermiהיווצרות מוצר הומוגני ne.
- לנתח את הנתונים באמצעות התוכנה מובנית.
- לנרמל את ערכי הביטוי של גני סמני DA Th וAadc עם הביטוי של שני גני התייחסות GAPDH וRpl13a להשיג רמות ביטוי היחסית כפי שתואר לעיל 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך immunolabeling מהיר זו מאפשר הדמיה של תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA. איור 1 מדגים את השלבים של הכנת רקמה לפני מיצוי RNA. לאחר cryosectioning, נוירונים דופאמין מסומנים באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (נוירונים שכותרתו מופיעים בחום). בהתאם לשאלה הניסיונית, יכולים להיות מבודד תאים בודדים או באזור גדול יותר של עניין באמצעות LCM (1D איור - E). חשוב להעריך את איכות RNA חילוץ, כRNA המושפל יהיה השפעה ניכרת על איכות הניתוח הבא. כל דגימת מעובד כך בbioanalyser פלטפורמה מבוסס מיקרופלואידיקה לכימות ולבדוק את שלמות RNA. איור 2 מראה תוצאות bioanalyser טיפוסיות של דגימות מושפלים ואיכות טובה. שני ג'ל וelectropherograms הדיגיטליים להדגים את החשיבות של שימוש במעכב RNAse בכל solution להגן RNA. הסכום הצפוי של RNA שחולץ מן 500 נוירונים הוא סביב 1-2 ng. תאי microdissected מכמה סעיפי רקמות ניתן נקוו באותו הצינור להגדיל כמות RNA.
איור 1: immunolabeling המהיר ולכידת לייזר הליך microdissection. (א) סכמטי המציג מבט sagittal של מוח עכבר ביום עוברי 15.5. קו שחור מציין את מיקומו של אזורי anteroposterior בי נוירונים דופמין המוח התיכון נמצאים. חלקים דקים מבוצעים באמצעות cryostat ונאספים על שקופיות זכוכית מצופה קרום. בעקבות immunolabeling, נוירונים דופאמין המוח התיכון נראים בחום (B). דגימות לייזר microdissected נאספות בכובע צינור מלא במאגר תמוגה (C). אזור של עניין (קו כחול בD)או תא בודד (E) יכול להיות גזור והוציא בכובע הצינור. 50μm 250μm (D), (E): ברים סולם.
איור 2: בקרת איכות מדגם RNA הכולל המבודדים לאחר microdissection ללכוד לייזר באמצעות ערכת שבבי bioanalyzer () ג'ל הדיגיטלי שהושג עם bioanalyzer (L, סולם; 1, מדגם 1 ללא מעכב RNAse (RNAsine), מדגם 2 עם RNAsine. ). (ב) Electropherograms של מדגם 1 (פנל עליון) מראה RNA ומדגם 2 (פנל תחתון) טיפוסי של RNA באיכות טובה מושפלים באופן חלקי (רין> 8 הוא טוב מקובל) שבו פסגות 18S / 28S rRNA גלויות לעין. (ג) הרמות מנורמלות ביחס הביטוי מיוצג בשינוי של פי לשני גני DA סמן (TH וAADC) בין t בלא כתם המקיףנושא ותחום DA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנקודה של שיטה זו הקריטית ביותר מורכבת בתיוג תאים של עניין תוך מניעת השפלה RNA. כRNAses פעיל בתמיסות מימיות, הפחתת זמני דגירה משפרת שימור RNA 11,15. כל הפתרונות המשמשים צריכים להיות מטופל בDEPC כדי להשבית RNAses. כל החומרים והמשטחים צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי למנוע זיהום RNAses. לבסוף, בתנאים אלה, התוספת של מעכב RNAse בכל הפתרונות יעילה בשמירה על RNA מלהיות מושפל. השימוש בתנאי מלח גבוהים מיושמים במהלך הדגירה נוגדן הוכח בעבר כיעיל בשמירה על RNA 9,10. עם זאת, בשיטה חלופית זו נותרת מוגבלת לצביעה מהירה באמצעות נוגדנים חזקים. העובי של החלקים מייצג עוד נקודה קריטית ותלוי בגודל של התא של עניין. מאז הגודל הממוצע של גוף התא של נוירונים דופאמין הוא סביב 1081; מ ', אנו בוחרים את עובי סעיף זה כדי לקבל שכבה אחת של תאים.
המגבלה העיקרית של שיטה זו בהשוואה לFACS היא המספר הנמוך של תאים שיכולים להיות microdissected. השימוש בערכת ההגברה RNA נדרש לניסויי פרופיל גנטי באמצעות RNA-רצף או microarray 16. עם זאת, ניתן לבצע qRT-PCR ישירות ללא צעד ההגברה (איור 2 ג). הערכה איכותית של הכתמים שהושגו עם פרוטוקול immunolabeling מהיר תמיד צריכה להתבצע ולא צריך להיות שונה מההכתמה שהושגה באמצעות פרוטוקול immunolabeling הנורמלי.
עד כה, ניסויים ללכוד לייזר שימשו בעיקר לבודד את האוכלוסיות של תאים מבעלי החיים מהונדסים מבטא סמנים כמו GFP או באמצעות צבעוניות היסטולוגית מהירה כגון צביעת Nissl. השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה תאים של עניין באמצעות אימונוהיסטוכימיה. בידוד ורכישת expr הגןפרופיל ession של אוכלוסיות מזוהות כימי של תאים ניתן כיום 17. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מיושם על כל רקמות ולהשתמש עם כל נוגדנים מתאימים.
במוח, ניתן לחלק את תאי עצב על ידי הלוקליזציה הגיאוגרפית שלהם אבל רוב האזורים במוח מכילים מגוון של תת-אוכלוסיות שונות המבוססות על הזהות הכימית שלהם. דפוס ביטוי גנים של סוגים מסוימים של תאי עצב יכול להיות שונה במידה רבה מסוג תא אחר באותו האזור במוח. על פי ההקשר הביולוגי או פתולוגי, פרופיל ביטוי גנים של אוכלוסיית תאים ספציפית יכול גם להשתנות באופן מהותי. באמצעות ההליך המתואר כאן, ניתן לעקוב אחר שינויים אלה, וסללו את הדרך לתגליות חדשות 8,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
