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Biology

सेल विशिष्ट उप-जनसंख्या से शाही सेना अलगाव रैपिड immunolabeling के साथ संयुक्त लेजर कब्जा Microdissection का प्रयोग

Published: April 11, 2015 doi: 10.3791/52510
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Neurosciences, Faculty of Medicine, Université Laval, 2Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec
* These authors contributed equally

Summary

एक विशिष्ट ऊतकों में कोशिकाओं के एक सबसेट के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। यह लेख लेजर कब्जा microdissection के साथ एक तेजी से immunolabeling विधि संयोजन के द्वारा एक विशेष सेल आबादी से उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना को अलग करने के लिए कैसे करें।

Abstract

लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम) उच्च स्थानिक संकल्प के साथ पतली ऊतक वर्गों से विशिष्ट कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। प्रभावी एलसीएम एक विषम ऊतक कोशिकाओं से उप-जनसंख्या की सटीक पहचान की आवश्यकता है। एलसीएम के लिए ब्याज की कोशिकाओं की पहचान आमतौर पर रूपात्मक मापदंड पर या फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं पर आधारित है। एलसीएम और तेजी से immunolabeling के संयोजन के लिए एक विकल्प और कारगर साधन विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं कल्पना करने के लिए और आसपास के ऊतकों से उन्हें अलग करने के लिए प्रदान करता है। उच्च गुणवत्ता आरएनए तो एक शुद्ध सेल की आबादी से निकाला जा सकता है और आगे शाही सेना अनुक्रमण, माइक्रोएरे या qRT- पीसीआर सहित बहाव के अनुप्रयोगों, के लिए कार्रवाई कर सकते हैं। यह दृष्टिकोण पहले से प्रदर्शन किया और संक्षेप में कुछ प्रकाशनों में वर्णित किया गया है। इस लेख का लक्ष्य कैसे एलसीएम का उपयोग कर इन विशिष्ट कोशिकाओं को अलग करने के लिए शाही सेना अखंडता रखते हुए, और जबकि एक सेल की आबादी का तेजी से immunolabeling प्रदर्शन करने के लिए कैसे वर्णन करने के लिए है। इस के साथ साथ, हम को वर्णनडी immunolabeling और एक दिन पुरानी चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में डोपामिनर्जिक कोशिकाओं पर कब्जा करके इस बहु कदम प्रक्रिया। हम विशेष विचार के लायक है कि कुंजी महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला। इस प्रोटोकॉल के ऊतकों और ब्याज की कोशिकाओं की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विभिन्न क्षेत्रों से शोधकर्ताओं की संभावना इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन करने से लाभ होगा।

Introduction

मस्तिष्क जटिल नेटवर्क के गठन के विभिन्न न्यूरॉन प्रकार की एक विशाल विविधता से बना है। इन न्यूरॉन्स उनकी आकृति विज्ञान, कनेक्टिविटी और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न एक के अनुसार अलग समूहों और उपसमूहों में आयोजित कर रहे हैं। प्रोटीन का विकास, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और QRT- पीसीआर विभिन्न जैविक संदर्भों 1,2 में neuronal आबादी के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल तुलना करने के लिए संभावना की पेशकश की। इन संवेदनशील विश्लेषण आरएनए अखंडता 2-4 रखते हुए ब्याज की सेल प्रकार की सटीक पहचान और अलगाव की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) तकनीक का व्यापक रूप से सेल सतह मार्करों और / या आकृति विज्ञान के आधार पर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। FACS के स्थानिक संकल्प 5 का एक पूरा नुकसान में जो परिणाम से पहले छँटाई करने के लिए एक सेल हदबंदी कदम की आवश्यकता है। कई न्यूरोनल उप-जनसंख्या वीं में उनके शारीरिक वितरण के अनुसार एक दूसरे से प्रतिष्ठित हैंई मस्तिष्क। पतली मस्तिष्क वर्गों पर लागू लेजर कब्जा microdissection के उच्च स्थानिक संकल्प 6-8 के साथ कोशिकाओं के विशिष्ट अलगाव के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान करता है। एलसीएम का एक प्रमुख सीमा रूपात्मक मापदंड पर या आनुवंशिक रूप से पशु मॉडल में इंजीनियर फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं के आधार पर ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करने की आवश्यकता पर किया गया है। एलसीएम के साथ संयोजन में, आरएनए अखंडता संरक्षित है कि जल्दी immunolabeling तरीकों का प्रदर्शन करने के लिए नई तकनीकों के विकास, अब जीन की रूपरेखा प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने के लिए सेल उप-जनसंख्या के अलगाव की अनुमति देता है।

यह दृष्टिकोण पहले से प्रदर्शन किया और संक्षेप में कुछ प्रकाशनों 1,9-13 में वर्णित किया गया है। यहाँ, हम एलसीएम साथ त्वरित immunolabeling संयोजन के द्वारा एक जटिल ऊतक संरचना में कोशिकाओं का एक विशिष्ट सबसेट से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदर्शित करता है। हम अधिक से अधिक शाही सेना वसूली प्राप्त करने के लिए कुंजी महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शन और यह हस्ताक्षर हो सकता है के रूप में शाही सेना गिरावट से बचने के लिए कैसे दिखाएँnificantly प्रभाव जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा।

इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के लिए, एक दिन पुरानी माउस मध्यमस्तिष्क से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स निशाना बनाया गया। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase (ध) के खिलाफ निर्देशित एक एंटीबॉडी, डोपामाइन संश्लेषण के लिए दर सीमित एंजाइम का उपयोग कर immunolabeled जा सकता है। वें immunostaining के बाद, व्यक्ति या डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के समूहों तो एलसीएम का उपयोग कर अलग किया जा सकता है। Microdissected कोशिकाओं lysis बफर में एकत्र कर रहे हैं, और शाही सेना एक आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर निकाला जाता है। गुणवत्ता और निकाले शाही सेना की मात्रा एक Bioanalyzer 5 का उपयोग कर मापा जाता है। का उपयोग करते हुए जीन अभिव्यक्ति के आगे विश्लेषण: शाही सेना अनुक्रमण, माइक्रोएरे, या qRT- पीसीआर बाद में 2,4,6 प्रदर्शन किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, एक दो कदम QRT- पीसीआर लेजर कब्जा कर लिया पृथक डोपामिनर्जिक डोमेन पर प्रदर्शन किया है। दो डोपामिनर्जिक न्यूरॉन मार्कर जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के सापेक्ष मात्रा का ठहराव इस प्रोटोकॉल के चयनात्मकता दिखाता है।

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Protocol

नोट: प्रयोगों प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए कनाडा के गाइड के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे और Université Laval पशु संरक्षण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. नमूना तैयार

नोट: इस उदाहरण में, हम प्रसव के बाद दिन 1 पर माउस दिमाग का इस्तेमाल किया।

  1. 3 पिल्ले के लिए मिनट से 4 के लिए कुचल बर्फ में हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण का प्रयोग करें, तो बहुत ठंडा l15 मध्यम में जितनी जल्दी संभव दिमाग काटना। दो मिनट के भीतर इस चरण को पूरा करें।
  2. स्थानांतरण विच्छेदित मोल्ड (MATERIEL के CF। सूची) embedding में दिमाग और इच्छित स्थिति में नमूना पूरबी ख्याल रख रही जमे हुए ऊतक embedding मीडिया के साथ भरें। -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में तुरंत नमूनों रुक। 30 सेकंड के भीतर इस चरण को पूरा करें।
    नोट: नमूने शाही सेना गुणवत्ता से समझौता किए बिना कुछ महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

2. सेक्शनिंग

  1. दावत झिल्ली सीओएटेड गिलास स्लाइड (CF। सामग्री की सूची) सतह RNase परिशोधन समाधान के साथ RNases के किसी भी ट्रेस खत्म करने के लिए। DEPC पानी में स्लाइड्स धो लें और उन्हें दो सूखी। वैकल्पिक रूप से, रातोंरात 200 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना स्लाइड।
  2. पहले एक सतह RNase परिशोधन समाधान के साथ साफ एक cryostat में जमे हुए नमूने स्थानांतरण। 10 माइक्रोन मोटाई में -20 डिग्री सेल्सियस और टुकड़ा नमूनों पर सेट cryostat के चैम्बर तापमान। झिल्ली लेपित स्लाइड पर ऊतक वर्गों लीजिए और धुंधला से पहले उन्हें सूखी 10 मिनट करते हैं। वैकल्पिक रूप से, दुकान धुंधला जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड।

धुंधला समाधान 3. तैयारी

  1. सिर्फ प्रयोग के शुरू होने से पहले सभी समाधान तैयार है, और आरएनए गिरावट को रोकने के लिए (धोने के समाधान के लिए) को छोड़कर सभी धुंधला समाधान में RNase अवरोध करनेवाला का उपयोग करें।
  2. बफर समाधान तैयार है। , 1% BSA के पूरक RNase मुक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस की रचना की सभी समाधान में एक ही बफर () का उपयोग करें0.2% ट्राइटन और 2% RNase अवरोध करनेवाला)। प्रत्येक स्लाइड के लिए, बफर समाधान के 400 μl (प्राथमिक के लिए 200 μl और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 200 μl) तैयार करते हैं।
  3. लगानेवाला समाधान तैयार: 70% इथेनॉल का उपयोग -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा। शाही सेना निकासी उपज में भारी कमी से बचने के लिए कम से कम ऊतक निर्धारण प्रक्रिया रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा 5% एसिटिक एसिड के पूरक 95% इथेनॉल समाधान का उपयोग करें।
  4. बफर समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी गिराए द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए, tyrosine hydroxylase (वें, दर डोपामाइन उत्पादन के लिए एंजाइम को सीमित) को लक्षित एक एंटीबॉडी का उपयोग करें। त्वरित ऊष्मायन समय के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए एंटीबॉडी के एक उच्च एकाग्रता का प्रयोग करें। 01:25 के कमजोर पड़ने वें एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    नोट: 1,000: सामान्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल में, इस एंटीबॉडी एक के कमजोर पड़ने पर रातोंरात incubated जब एक मजबूत संकेत देता है। इस प्रोटोकॉल में, यह 40X अधिक concentrat प्रयोग किया जाता हैकम ऊष्मायन समय की वजह से एड। इस वजह से यह विधि के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के उच्च एकाग्रता के लिए, गैर विशिष्ट लेबलिंग में कोई वृद्धि की जांच के क्रम में समानांतर में एक मानक immunostaining प्रदर्शन करते हैं।
  5. बफर समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी गिराए द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। 100: 1 की एकाग्रता में एक biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    नोट: इस उदाहरण में, हम एक विरोधी खरगोश biotinylated एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया।
  6. Biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए avidin बायोटिन परिसर (एबीसी) समाधान तैयार है। एक की एकाग्रता में परिसर में एक और यौगिक बी जोड़कर एबीसी समाधान करें: DEPC पीबीएस में पतला 100 2% RNase अवरोध करनेवाला के साथ पूरक। स्लाइड्स में जोड़ने से पहले avidin बायोटिन जटिल 30 मिनट तैयार करें।

4. धुंधला

  1. जल्दी से हवा में उन्हें flicking द्वारा डिग्री सेल्सियस -80 से समय में एक या दो स्लाइड्स पिघलना (या एक हवा धौंकनी का उपयोग करें)। एक हाइड्रोफोबिक साथ चारों वर्गोंबाधा कलम और कुछ सेकंड के लिए दो सूखी।
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए ठंडा लगानेवाला समाधान में स्लाइड्स रखो। धोने के लिए DEPC पीबीएस 6-8 बार में स्लाइड्स जल्दी, तो लगानेवाला समाधान के अतिरिक्त हटा दें डुबकी हवा में एक बार हिला।
    2. DEPC पीबीएस से अधिक दूर करने के लिए स्लाइड झटका। कदम defrosting स्लाइड 5 मिनट से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  2. एक साफ ट्रे पर प्लेस स्लाइड (एक सतह RNase परिशोधन समाधान के साथ pretreated RNases के किसी भी ट्रेस खत्म करने के लिए) और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रत्येक स्लाइड (खरगोश विरोधी वें) पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μl डाल दिया। डुबकी DEPC पीबीएस में जल्दी से धोने के लिए 3 बार स्लाइड और DEPC पीबीएस से अधिक दूर करने के लिए एक बार स्लाइड झटका।
  3. कमरे के तापमान पर छह मिनट के लिए प्रत्येक स्लाइड पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μl रखो। डुबकी जल्दी से धोने के लिए DEPC पीबीएस में 3 बार स्लाइड और DEPC पीबीएस से अधिक दूर करने के लिए स्लाइड झटका।
  4. एबीसी समाधान के 200 μl रखोकमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए प्रत्येक स्लाइड पर tion। डुबकी DEPC पीबीएस में जल्दी से धोने के लिए 3 बार स्लाइड और अतिरिक्त DEPC पीबीएस दूर करने के लिए स्लाइड झटका।
  5. थपका (3,3 'diaminobenzidine) एबीसी समाधान में ऊष्मायन के 4 मिनट के दौरान समाधान तैयार है। किट (थपका peroxidase सब्सट्रेट किट) में प्रदान की अभिकर्मकों का प्रयोग करें। उपलब्ध कराए गए बफर की एक बूंद, थपका समाधान की एक बूंद और DEPC पानी की 2.5ml में 30% एच 2 ओ 2 की एक बूंद मिलाएं। Inverting द्वारा समाधान मिलाएं।
  6. थपका समाधान के 196 μl ले लो और सिर्फ स्लाइड पर फैलने से पहले RNase अवरोध करनेवाला समाधान के 4 μl (2%) जोड़ें। प्लेस (एक सतह RNase परिशोधन समाधान के साथ pretreated) एक स्वच्छ ट्रे पर स्लाइड और स्लाइड पर थपका समाधान के 200 μl डाल दिया।
    नोट: थपका समाधान within1 या 2 मिनट प्रतिक्रिया करनी चाहिए।
  7. डुबकी DEPC पीबीएस में जल्दी से धोने के लिए 3 बार स्लाइड और निरपेक्ष इथेनॉल में कुछ सेकंड के लिए स्लाइड डाल दिया। हवा में उन्हें flicking द्वारा स्लाइड सूखा (या एक हवा धौंकनी का उपयोग करें)। <br /> नोट: स्लाइड्स भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या एलसीएम के लिए कार्रवाई की जा सकती है।

5. लेजर कैद Microdissection

  1. हवा में उन्हें flicking द्वारा जल्दी स्लाइड Defrost (या एक हवा धौंकनी का उपयोग करें)। कदम defrosting स्लाइड 5 मिनट से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  2. एलसीएम करने के लिए आगे बढ़ें। इकट्ठा करने ट्यूब टोपी का सामना करना पड़ नमूना पक्ष के साथ खुर्दबीन के नीचे स्लाइड रखें। नमूने के लिए सबसे अच्छा बढ़ाई चुनें। ब्याज की कोशिकाओं को देखने के लिए फोकस समायोजित करें।
    1. काटने के क्षेत्र को परिभाषित और लेजर के साथ काटने शुरू। विच्छेदित कोशिकाओं या (शाही सेना निकासी किट से) lysis बफर के 50 μl के साथ भरा एकत्रित ट्यूब टोपी में ऊतक का टुकड़ा ले लीजिए। एलसीएम के चरण में 30 मिनट से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  3. एक शाही सेना निकासी किट (CF। सामग्री की सूची) का उपयोग कर अलग कक्षों से कुल शाही सेना निकालें। निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।
    1. 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए करने के लिए एकत्र कोशिकाओं को सेतेकोशिकाओं lyse। पूर्व शर्त कंडीशनिंग बफर के 250 μl जोड़कर आरएनए शुद्धि स्तंभ। लोड lysed कोशिकाओं को इथेनॉल के 50 μl। एक preconditioned शुद्धि स्तंभ पर lysed कोशिकाओं के 100 μl लोड।
    2. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 16,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र। वाशिंग buffers के साथ दो बार स्तंभ धो लें। RNase मुक्त पानी की न्यूनतम सिफारिश की मात्रा (11 μl) में elute (यह bioanalyser के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में इलाज DEPC नहीं)। परीक्षण की गुणवत्ता के लिए 2 μl रखें।
      नोट: सभी समाधान और अभिकर्मकों किट में प्रदान की जाती हैं।

6. सीडीएनए संश्लेषण मात्रात्मक आरटी पीसीआर

  1. रिवर्स नक़ल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और oligo (डीटी) का उपयोग पूरक डीएनए में लेजर कब्जा कर लिया डोपामिनर्जिक कोशिकाओं से शाही सेना के नमूने। निर्माता प्रोटोकॉल (CF। सामग्री की सूची) का पालन करें।
  2. जीन विशिष्ट प्राइमरों के साथ QRT- पीसीआर प्रवर्धन के लिए सीडीएनए के एक μl का प्रयोग करें। सेट अप पीसीआर वजहमात्रात्मक पीसीआर के लिए एक एक घटक गर्म शुरू प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ 20 μl मात्रा में ctions निर्माता से सिफारिश की है। तीन प्रतियों में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले।
    1. यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, निम्न प्राइमर जोड़े का उपयोग करें: GAPDH-एफ (5'-सीसीए सीसीसी आगा आगा CTG TGG एटी-3 ') / GAPDH आर (5'-GGA टी जी सी AGG GAT GAT GTT सीटी -3'); Rpl13a-एफ (5'-एसीए जीसीसी अधिनियम CTG भूमिकाः भूमिकाः एए-3 ') / Rpl13a आर (5'-CTG सी सी टी GTT टीसीसी GTA एसीसी टीसी-3'); गु-एफ (5'-कैग TGG AGG ATG टीजीटी सीटीसी -3 ') / गु-आर (5'-GAA AAT सीएसी GGG कैग एसीए जी 3'); AADC-एफ (5'- कैट भूमिकाः एजीसी टीटीसी टी जी सी सी सी टी टीसी -3 ') / AADC आर (5'- GGA टीजीटी GGT सीसीसी कैग टीजीटी एजी -3')।
  3. निम्नलिखित तेजी से साइकिल चालन मापदंडों का उपयोग मात्रात्मक आरटी पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करना: 95 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड के 45 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड के द्वारा पीछा किया 5 मिनट के लिए। Determi के लिए साधन की डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग पिघलने वक्र विश्लेषण प्रदर्शनपूर्वोत्तर के सजातीय उत्पाद गठन।
  4. निर्मित में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण।
    1. पहले से 14 के रूप में वर्णित रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए दो संदर्भ जीन GAPDH और Rpl13a की अभिव्यक्ति के साथ डीए मार्कर जीन वें और AADC की अभिव्यक्ति मूल्यों मानक के अनुसार।

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Representative Results

यह तेजी से immunolabeling प्रक्रिया आरएनए अखंडता रखते हुए ब्याज की कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है। एक शाही सेना निकासी से पहले ऊतक तैयारी के इस कदम को दिखाता है चित्रा। Cryosectioning के बाद, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स tyrosine hydroxylase के खिलाफ निर्देशित एक एंटीबॉडी (लेबल न्यूरॉन्स भूरे रंग में दिखाई देते हैं) का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं। प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, एकल कक्षों या ब्याज के बड़े क्षेत्र एलसीएम का उपयोग कर अलग किया जा सकता है (चित्रा -1 - ई)। यह अपमानित शाही सेना निम्नलिखित विश्लेषण की गुणवत्ता पर काफी असर पड़ेगा, के रूप में निकाले शाही सेना की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रत्येक नमूना इस प्रकार मात्रा का ठहराव के लिए और आरएनए अखंडता की जाँच करने के लिए एक microfluidics आधारित प्लेटफॉर्म bioanalyser पर कार्रवाई की है। दो अपमानित और अच्छी गुणवत्ता वाले नमूनों की ठेठ bioanalyser परिणामों से पता चलता है। डिजिटल जेल और electropherograms दोनों एक प में RNase अवरोध करनेवाला का उपयोग कर के महत्व को प्रदर्शितution शाही सेना की रक्षा के लिए। 500 न्यूरॉन्स से निकाले शाही सेना की उम्मीद की राशि के आसपास 1-2 एनजी है। कई ऊतक वर्गों से microdissected कोशिकाओं आरएनए मात्रा को बढ़ाने के लिए एक ही ट्यूब में जमा किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1: रैपिड immunolabeling और लेजर कब्जा microdissection प्रक्रिया। (ए) योजनाबद्ध भ्रूण दिन 15.5 पर एक माउस मस्तिष्क के बाण के समान दृश्य दिखा। काला लाइन मध्यमस्तिष्क डोपामाइन न्यूरॉन्स स्थित हैं जहां अग्रपश्चस्थ क्षेत्रों के स्थान को इंगित करता है। पतली वर्गों एक cryostat का उपयोग किया जाता है और झिल्ली लेपित गिलास स्लाइड पर एकत्र कर रहे हैं। Immunolabeling के बाद, मध्यमस्तिष्क डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स ब्राउन (बी) में दिखाई दे रहे हैं। लेजर microdissected नमूनों lysis बफर (सी) के साथ भरा एक ट्यूब की टोपी में एकत्र कर रहे हैं। ब्याज के क्षेत्र (डी में नीली रेखा)या अलग-अलग सेल (ई) विच्छेदित और ट्यूब टोपी में लिया जा सकता है। स्केल सलाखों: (डी) 250μm, (ई) 50μm।

चित्र 2
चित्रा 2: एक Bioanalyzer चिप किट का उपयोग लेजर कब्जा microdissection के बाद अलग-थलग कुल शाही सेना के नमूने की गुणवत्ता नियंत्रण (ए) Bioanalyzer (एल, सीढ़ी के साथ प्राप्त डिजिटल जेल, 1, नमूना एक RNAsine साथ RNase अवरोध करनेवाला (RNAsine), नमूना दो के बिना। )। आंशिक रूप से अपमानित शाही सेना और अच्छी गुणवत्ता वाले शाही सेना के विशिष्ट नमूना 2 (कम पैनल) दिखा नमूना 1 (ऊपरी पैनल) (बी) Electropherograms जिसमें 18S / 28S rRNA चोटियों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं (Rin> 8 स्वीकार्य अच्छा है)। (सी) के आसपास के बेदाग टी के बीच दो डीए मार्कर जीन (वीं और AADC) के लिए गुना परिवर्तन में प्रतिनिधित्व सामान्यीकृत रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तरमुद्दा और महंगाई भत्ते डोमेन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस विधि के सबसे महत्वपूर्ण बिंदु आरएनए गिरावट को रोकने, जबकि ब्याज की कोशिकाओं लेबलिंग में होते हैं। RNases जलीय समाधान में सक्रिय हैं, ऊष्मायन बार घटते शाही सेना संरक्षण 11,15 में सुधार। उपयोग किए गए सभी समाधान RNases निष्क्रिय करने के लिए DEPC के साथ इलाज किया जाना चाहिए। सभी सामग्री और सतहों RNases प्रदूषण को रोकने के लिए एक सतह RNase परिशोधन समाधान के साथ इलाज किया जाना चाहिए। अंत में, इन परिस्थितियों में, सभी समाधान में RNase अवरोध करनेवाला के अलावा अपमानित किए जाने से शाही सेना के संरक्षण में प्रभावी है। एंटीबॉडी ऊष्मायन के दौरान लागू उच्च नमक शर्तों का उपयोग पहले से शाही सेना 9,10 के संरक्षण में प्रभावी होना दिखाया गया है। हालांकि, इस वैकल्पिक पद्धति मजबूत एंटीबॉडी का उपयोग कर त्वरित धुंधला करने के लिए सीमित रहता है। वर्गों की मोटाई एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है और ब्याज की कोशिका के आकार पर निर्भर करता है। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सेल शरीर का औसत आकार लगभग 10 के बाद से81, एम, हम कोशिकाओं की एक परत प्राप्त करने के लिए इस खंड मोटाई का चयन करें।

FACS की तुलना में इस तकनीक की प्रमुख सीमा microdissected जा सकता है कि कोशिकाओं की संख्या कम है। आरएनए प्रवर्धन किट का उपयोग आरएनए अनुक्रमण या माइक्रोएरे 16 का उपयोग जीन की रूपरेखा प्रयोगों के लिए आवश्यक है। हालांकि, QRT- पीसीआर प्रवर्धन कदम (चित्रा -2 सी) के बिना सीधे किया जा सकता है। त्वरित immunolabeling प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त धुंधला के गुणात्मक मूल्यांकन हमेशा प्रदर्शन किया जाना चाहिए और सामान्य immunolabeling प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त धुंधला से अलग नहीं किया जाना चाहिए।

अब तक, लेजर कब्जा प्रयोगों ज्यादातर GFP तरह मार्करों व्यक्त या ऐसे Nissl धुंधला के रूप में जल्दी ऊतकीय colorations का उपयोग कर ट्रांसजेनिक जानवरों से कोशिकाओं की आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया। यहाँ प्रस्तुत विधि immunohistochemistry का उपयोग कर ब्याज की कोशिकाओं visualizing की अनुमति देता है। अलग और जीन expr प्राप्तकोशिकाओं के रासायनिक पहचान की आबादी के ession प्रोफ़ाइल अब 17 संभव है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल किसी भी ऊतकों को लागू किया है और किसी भी उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

मस्तिष्क में, न्यूरॉन्स उनके भौगोलिक स्थानीयकरण द्वारा विभाजित लेकिन सबसे मस्तिष्क क्षेत्रों उनकी रासायनिक पहचान के आधार पर अलग-अलग उप-जनसंख्या की एक किस्म के होते जा सकता है। न्यूरॉन्स के कुछ प्रकार के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में एक और सेल प्रकार से काफी हद तक अलग-अलग हो सकता है। जैविक या रोग प्रसंग के अनुसार, एक विशेष सेल आबादी के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल भी काफी बदल सकते हैं। यहाँ वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करना, यह नई खोजों 8,18,19 करने के लिए जिस तरह फ़र्श, इन परिवर्तनों पर नजर रखने के लिए संभव है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Membrane coated slides  Leica Biosystems 11505158 MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution Life technologies AM9780 RNaseZap
Fixative 70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH  Pel-Freez P40101  1:25
RNAse free buffer DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor Promega N2615 Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated Vector Laboratories BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard Vector Laboratories PK-6100 8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit  Vector Laboratories SK-4100
RNA isolation kit Life technologies KIT0204 Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30% Sigma HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system Leica microsystems Model AS-LMD
DEPC Alfa Aesar B22753-14
Bioanalyzer Agilent Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold  Leica Biosystems 14702218311 6x8mm
Hydrophobic barrier pen  Vector Laboratories H-4000
Frozen tissue embedding media Tissue-Tek 4583
Bioanalyzer chip Aligent Technologies 5067-1513 RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR Roche 6402712001 Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase Life technologies 11752-050 SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
  4. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  5. Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
  6. Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
  7. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
  8. Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
  9. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
  10. Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
  11. Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
  12. Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
  13. Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
  14. Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
  15. Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
  16. Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
  17. Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
  18. Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
  19. Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 98 लेजर कब्जा microdissection mRNA immunolabeling जीन अभिव्यक्ति डोपामाइन न्यूरॉन्स शाही सेना अनुक्रमण QRT- पीसीआर
सेल विशिष्ट उप-जनसंख्या से शाही सेना अलगाव रैपिड immunolabeling के साथ संयुक्त लेजर कब्जा Microdissection का प्रयोग
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Chabrat, A., Doucet-Beaupré,… More

Chabrat, A., Doucet-Beaupré, H., Lévesque, M. RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling. J. Vis. Exp. (98), e52510, doi:10.3791/52510 (2015).

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