Summary
Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.
Abstract
Microdissezione laser (LCM) permette l'isolamento di cellule specifiche da sezioni di tessuto sottili con alta risoluzione spaziale. LCM efficace richiede una precisa identificazione di cellule sottopopolazioni da un tessuto eterogeneo. Identificazione di cellule di interesse per LCM è di solito basato su criteri morfologici o reporter proteina fluorescente. La combinazione di LCM e rapido immunomarcatura offre un mezzo alternativo ed efficace di visualizzare specifici tipi cellulari e di isolarli dal tessuto circostante. RNA di alta qualità può essere estratto da una popolazione di cellule puro e ulteriormente trattati per applicazioni a valle, tra cui RNA-sequencing, microarray o qRT-PCR. Questo approccio è stato già eseguito e brevemente descritto in alcune pubblicazioni. L'obiettivo di questo articolo è quello di illustrare come eseguire una rapida immunomarcatura di una popolazione di cellule, mantenendo l'integrità dell'RNA, e come isolare queste cellule specifici utilizzando LCM. Qui, illustriamod questa procedura multi-passo immunomarcatura e catturando cellule dopaminergiche nel tessuto cerebrale da un giorno d'età topi. Evidenziamo chiave passaggi critici che meritano particolare attenzione. Questo protocollo può essere adattato ad una varietà di tessuti e cellule di interesse. I ricercatori di diversi settori probabilmente beneficiare della dimostrazione di questo approccio.
Introduction
Il cervello è composto da una grande varietà di diversi tipi di neuroni che formano reti complesse. Questi neuroni sono organizzati in gruppi distinti e sottogruppi in base alla loro morfologia, la connettività e l'espressione genica modello 1. Lo sviluppo di microarrays, sequenziamento di prossima generazione, e qRT-PCR offerta la possibilità di confrontare i profili di espressione genica di popolazioni neuronali in differenti contesti biologici 1,2. Queste analisi sensibili richiedono l'identificazione precisa e l'isolamento di tipi cellulari di interesse, mantenendo l'integrità RNA 2-4. Fluorescente cell sorting (FACS) tecnica attivato è stato ampiamente utilizzato per isolare specifici tipi cellulari basati su marcatori di superficie cellulare e / o morfologia. FACS richiede una fase di dissociazione cellulare prima di smistamento, che si traduce in una perdita completa della risoluzione spaziale 5. Molti sottopopolazioni neuronali si distinguono gli uni dagli altri in base alla loro distribuzione anatomica in the cervello. Microdissezione laser applicata su sezioni di cervello sottili fornisce un'opzione adeguata per specifico isolamento di cellule con alta risoluzione spaziale 6-8. Una limitazione importante di LCM è stata la necessità di individuare le cellule di interesse sulla base di criteri morfologici o reporter di proteine fluorescenti geneticamente in modelli animali. Lo sviluppo di nuove tecniche per eseguire metodi immunomarcatura veloci che conservano l'integrità dell'RNA, in combinazione con LCM, consente ora l'isolamento delle sottopopolazioni di cellule di procedere con esperimenti-genica.
Questo approccio è stato già eseguito e brevemente descritti in poche pubblicazioni 1,9-13. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata per ottenere RNA di alta qualità da uno specifico sottogruppo di cellule in una struttura del tessuto complessa combinando immunomarcatura rapido con LCM. Mostriamo come eseguire principali passaggi critici per ottenere il recupero RNA massima e di evitare la degradazione dell'RNA come può sigsignificativamente gene impatto profilo di espressione.
Per la dimostrazione di questo protocollo, i neuroni dopaminergici da un giorno-vecchio mouse mesencefalo stati presi di mira. Neuroni dopaminergici possono essere immunolabeled utilizzando un anticorpo diretto contro la tirosina idrossilasi (TH), l'enzima limitante per la sintesi della dopamina. Dopo immunostaining TH, individuali o gruppi di neuroni dopaminergici possono quindi essere isolato con LCM. Microdissezione cellule sono raccolte in tampone di lisi, e RNA viene estratto utilizzando un kit di isolamento di RNA. Qualità e quantità di RNA estratto sono misurati utilizzando un Bioanalyzer 5. Ulteriori analisi dell'espressione genica utilizzando: RNA sequencing, microarray, o qRT-PCR può essere successivamente eseguita 2,4,6. Come esempio, in due fasi qRT-PCR è dimostrata sulle laser catturato domini isolati dopaminergici. Quantificazione relativa dei livelli di espressione di due geni marcatori dopaminergici neuron illustra la selettività di questo protocollo.
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Protocol
NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la guida canadese per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato per la protezione degli animali Laval Université.
Preparazione 1. Campione
NOTA: In questo esempio, abbiamo usato il cervello di topo al giorno postnatale 1.
- Utilizzare l'anestesia ipotermia in ghiaccio tritato da 3 a 4 min per cuccioli, poi sezionare cervello più rapidamente possibile in mezzo L15 ghiacciata. Eseguire questo passaggio all'interno di 2 min.
- Trasferimento sezionato cervelli in embedding muffa (cfr. Elenco di materiale) e riempire con i media tessuti congelati embedding avendo cura di orientare il campione nella posizione desiderata. Congelare i campioni immediatamente in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Eseguire questo passaggio entro 30 sec.
NOTA: I campioni possono essere conservati alcuni mesi, senza compromettere la qualità dell'RNA.
2. Sezioni
- Membrana Treat coavetrini ted vetro (cfr. elenco di materiale) con la soluzione di RNAse superficie di decontaminazione per eliminare ogni traccia di RNasi. Lavare i vetrini in acqua DEPC e lasciarli asciugare. In alternativa, i vetrini cuocere overnight a 200 ° C.
- Trasferire i campioni congelati in un criostato precedentemente pulito con una soluzione di superficie RNAse decontaminazione. Impostare la temperatura della camera criostato a -20 ° C e fetta campioni a 10 micron di spessore. Raccogliere sezioni di tessuto sulle slitte membrana rivestita e lasciarli asciugare 10 minuti prima della colorazione. In alternativa, negozio scivola a -80 ° C fino a colorazione.
3. Preparazione di colorazione Solutions
- Preparare tutte le soluzioni appena prima dell'inizio dell'esperimento, e utilizzare inibitore RNAse in tutte le soluzioni di colorazione (tranne per le soluzioni di lavaggio) per prevenire la degradazione dell'RNA.
- Preparare la soluzione tampone. Utilizzare lo stesso buffer in tutte le soluzioni (composto da PBS RNasi-free (PBS) supplementato del 1% BSA,0,2% triton e inibitore RNAse 2%). Per ciascun vetrino, preparare 400 ml di soluzione tampone (200 microlitri per il primario e 200 microlitri per gli anticorpi secondari).
- Preparare la soluzione fissativa: utilizzare il 70% di etanolo mantenuto a -20 ° C. Mantenere tessuto procedura di sintesi minima per evitare una drastica riduzione della resa di estrazione dell'RNA.
NOTA: In alternativa, usare una soluzione di etanolo al 95% integrata del 5% di acido acetico conservato a -20 ° C. - Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo l'anticorpo primario nella soluzione tampone. Per l'etichettatura dei neuroni dopaminergici, utilizzare un anticorpo targeting tirosina idrossilasi (TH, enzima limitante per la produzione di dopamina). Utilizzare un'alta concentrazione di anticorpi per compensare il tempo di incubazione rapido. Utilizzare anticorpo TH ad una diluizione 1:25.
NOTA: Nel normale protocollo immunofluorescenza, questo anticorpo dà un forte segnale quando incubato overnight a una diluizione di 1: 1000. In questo protocollo, è usato 40X più concentratcato a causa del breve tempo di incubazione. Data l'elevata concentrazione di anticorpo utilizzato per questo metodo, eseguire una immunocolorazione normale in parallelo per controllare qualsiasi aumento etichettatura non specifico. - Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo l'anticorpo secondario nella soluzione tampone. Utilizzare un anticorpo secondario biotinilato ad una concentrazione di 1: 100.
NOTA: In questo esempio, abbiamo utilizzato un anticorpo biotinilato anti-coniglio. - Preparare la soluzione avidina-biotina complesso (ABC) per la rilevazione di anticorpi secondari biotinilati. Preparare la soluzione ABC aggiungendo il composto A e il composto B ad una concentrazione di 1: 100 diluito in PBS DEPC completato con inibitore RNAse 2%. Preparare l'avidina-biotina complesso 30 minuti prima di aggiungerlo alle diapositive.
4. Colorazione
- Scongelare uno o due scivoli al momento da -80 ° C da loro sfogliando in aria velocemente (o utilizzare un getto d'aria). Sezioni Surround con idrofobicapenna barriera e lasciare asciugare per alcuni secondi.
- Mettere i vetrini nella soluzione di fissativo freddo per non più di 5 minuti a -20 ° C. Agitare volta in aria per rimuovere l'eccesso di soluzione di fissativo poi, rapidamente immergere i vetrini in tempi DEPC PBS 6-8 per il lavaggio.
- Flick le diapositive per rimuovere l'eccesso di DEPC PBS. Assicurarsi che le diapositive sbrinamento passo non superi i 5 min.
- Collocare i vetrini su un vassoio pulito (pretrattato con una soluzione di superficie RNAse decontaminazione per eliminare ogni traccia di RNasi) e mettere 200 microlitri della soluzione di anticorpo primario su ciascuna slitta (coniglio anti-TH) per 10 min a temperatura ambiente. Dip scorre rapidamente in DEPC PBS 3 volte per il lavaggio e aspirare i vetrini volta per rimuovere l'eccesso di DEPC PBS.
- Mettere 200 microlitri della soluzione di anticorpo secondario su ciascun vetrino per 6 minuti a temperatura ambiente. Dip scorre rapidamente 3 volte in PBS DEPC per il lavaggio e aspirare i vetrini per rimuovere l'eccesso di DEPC PBS.
- Mettere 200 ml di Solu ABCzione su ciascun vetrino per 4 minuti a temperatura ambiente. Dip scivola rapidamente in DEPC PBS 3 volte per il lavaggio e flick le diapositive per rimuovere l'eccesso DEPC PBS.
- Preparare il DAB (3,3 'diaminobenzidina) soluzione durante la 4 min di incubazione nella soluzione ABC. Utilizzare i reagenti forniti nel kit (Kit DAB perossidasi substrato). Miscelare 1 goccia di tampone fornito, 1 goccia di soluzione DAB e 1 goccia di 30% H 2 O 2 in 2,5 ml di acqua DEPC. Miscelare la soluzione capovolgendo.
- Prendere 196 microlitri della soluzione DAB e aggiungere 4 microlitri (2%) di soluzione inibitore RNAse appena prima stesura su vetrini. Collocare i vetrini su un vassoio pulito (pretrattati con una soluzione di decontaminazione RNAse superficie) e mettere i 200 ml di soluzione di DAB su vetrini.
NOTA: la soluzione DAB dovrebbe reagire within1 o 2 min. - Dip scivola rapidamente in DEPC PBS 3 volte per il lavaggio e mettere i vetrini per alcuni secondi in etanolo assoluto. Asciugare i vetrini da essi sfogliando in aria (o utilizzare un getto d'aria). <br /> NOTA: Le diapositive possono essere conservati a -80 ° C per un uso futuro o trattati per LCM.
5. Laser Capture Microdissection
- Scongelare scivoli rapidamente da loro sfogliando in aria (o utilizzare un getto d'aria). Assicurarsi che le diapositive sbrinamento passo non superi i 5 min.
- Procedere alla LCM. Posizionare il vetrino sotto il microscopio con il lato del campione di fronte al tappo del tubo di raccolta. Scegliere il migliore di ingrandimento per il campione. Regolare il fuoco per vedere le cellule di interesse.
- Definire la zona di taglio e iniziare il taglio con il laser. Raccogliere le cellule sezionato o pezzo di tessuto nel tappo della provetta di raccolta riempito con 50 ml di tampone di lisi (dal kit di estrazione RNA). Assicurarsi che la fase di LCM non superi il 30 min.
- Estratto RNA totale da cellule isolate utilizzando un kit di estrazione di RNA (cfr. Elenco dei materiali). Seguire il protocollo del produttore.
- Incubare le cellule raccolte per 30 minuti a 42 ° C perlisare le cellule. Pre-condizione RNA depurazione colonna aggiungendo 250 ml di tampone di condizionamento. Carico 50 ml di etanolo a cellule lisate. Caricare i 100 ml di cellule lisate su una colonna di purificazione Precondizionato.
- Centrifugare la colonna a 16.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Lavare la colonna due volte con tamponi di lavaggio. Eluire nel volume consigliato minimo (11 ml) di acqua RNase-free (non DEPC trattati come potrebbe interferire con il bioanalyser). Tenere 2 ml per verificare qualità.
NOTA: Tutte le soluzioni ei reagenti sono forniti nel kit.
6. cDNA Synthesis e quantitativa RT-PCR
- Reverse-trascrivere campioni di RNA da laser catturato cellule dopaminergiche nel DNA complementare utilizzando trascrittasi inversa e oligo (dT). Seguire il protocollo del produttore (cfr. Elenco del materiale).
- Usare 1 ml di cDNA per qRT-amplificazione PCR con primer specifici geni. Impostare rea PCRZIONI nel volume 20 microlitri di una miscela di reazione avviamento a caldo monocomponente per PCR quantitativa, come consigliato dal produttore. Effettuare ogni reazione in triplice copia.
- Per gli esperimenti descritti, utilizzare le seguenti coppie di primer: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
- Eseguire quantitativa di amplificazione RT-PCR utilizzando i seguenti parametri cicli rapidi: 95 ° C per 5 min seguita da 45 cicli di 10 secondi a 95 ° C, 10 sec a 60 ° C e 10 sec a 72 ° C. Effettuare analisi della curva di fusione con l'impostazione predefinita dello strumento di determiformazione prodotto omogeneo ne.
- Analizzare i dati utilizzando il software built-in.
- Normalizzare i valori di espressione dei geni marcatori DA Th e AADC con l'espressione dei due geni di riferimento GAPDH e Rpl13a di ottenere livelli di espressione relativi come descritto in precedenza 14.
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Representative Results
Questa procedura permette immunomarcatura rapida visualizzazione di cellule di interesse, mantenendo l'integrità dell'RNA. La Figura 1 illustra le fasi di preparazione del tessuto prima dell'estrazione dell'RNA. Dopo criosezionamento, neuroni dopaminergici vengono etichettati utilizzando un anticorpo diretto contro la tirosina idrossilasi (neuroni marcati appaiono in marrone). A seconda della domanda sperimentale, singole cellule o grande regione di interesse possono essere isolati con LCM (Figura 1D - E). È importante valutare la qualità dell'RNA estratto, come RNA degradato avrà un notevole impatto sulla qualità della seguente analisi. Ogni campione è quindi trasformato in una piattaforma basata bioanalyser microfluidica per la quantificazione e per verificare l'integrità dell'RNA. La Figura 2 mostra i risultati tipici bioanalyser di campioni degradati e di buona qualità. Sia gel digitale e elettroferogrammi dimostrano l'importanza di utilizzare inibitore RNAse in ogni solution per proteggere RNA. La quantità prevista di RNA estratto da 500 neuroni è di circa 1-2 ng. Cellule microdissezione da diverse sezioni di tessuto possono essere raggruppati nello stesso tubo per aumentare la quantità di RNA.
Figura 1: immunomarcatura veloce e cattura laser procedura microdissezione. (A) Schema che mostra vista sagittale del cervello di topo al giorno embrionale 15,5. La linea nera indica la posizione delle regioni in antero-posteriore in cui si trovano i neuroni dopaminergici del mesencefalo. Sezioni sottili sono realizzati con un criostato e sono raccolti membrana rivestita vetrini. Dopo immunomarcatura, neuroni dopaminergici del mesencefalo sono visibili in marrone (B). Campioni laser microdissezione sono raccolti in un tappo tubo riempito con tampone di lisi (C). Regione di interesse (linea blu in D)o singola cella (E) può essere sezionato e recuperate nel tappo della provetta. Bar Scala: (D) 250μm, (E) 50 micron.
Figura 2: Controllo di qualità totale del campione RNA isolato dopo microdissezione laser utilizzando un kit di chip bioanalizzatore (A) Il gel digitali ottenute con bioanalizzatore (L, scala, 1, 1 campione senza inibitore RNAse (RNAsine), campione 2 con RNAsine. ). (B) elettroferogrammi di campione 1 (pannello superiore) che mostra RNA parzialmente degradato e campione 2 (pannello inferiore) tipico di RNA di buona qualità (RIN> 8 è accettabilmente bene) in cui i picchi 18S / 28S rRNA sono chiaramente visibili. (C) normalizzati livelli di espressione relativi rappresentati nel cambiamento volte per due geni marcatori DA (TH e AADC) tra circostante macchia temissione e dominio DA. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il punto più critico di questo metodo consiste nel etichettatura cellule di interesse impedendo la degradazione dell'RNA. Come RNasi sono attivi in soluzione acquosa, diminuendo i tempi di incubazione migliora conservazione RNA 11,15. Tutte le soluzioni utilizzate devono essere trattati con DEPC per inattivare RNasi. Tutti i materiali e le superfici devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione RNAse superficie per evitare la contaminazione RNasi. Infine, in queste condizioni, l'aggiunta di inibitore RNAse in tutte le soluzioni è efficace nel preservare RNA essere degradato. L'uso di condizioni di elevato sale applicati durante anticorpo incubazione è stato precedentemente dimostrato di essere efficace nel preservare RNA 9,10. Tuttavia, questo metodo alternativo rimane limitata alle macchie pratica utilizzando anticorpi robusti. Lo spessore delle sezioni rappresenta un altro punto critico e dipende dalle dimensioni della cella di interesse. Poiché la dimensione media del corpo cellulare dei neuroni dopaminergici è di circa 1081, m, selezioniamo questo spessore sezione per ottenere uno strato di cellule.
Il principale limite di questa tecnica rispetto al FACS è il basso numero di celle che possono essere microdissezione. È richiesto l'uso di kit di RNA di amplificazione per esperimenti genica utilizzando RNA-sequencing o microarray 16. Tuttavia, qRT-PCR può essere eseguita direttamente senza la fase di amplificazione (figura 2c). Valutazione qualitativa della colorazione ottenuta con il protocollo immunomarcatura rapido deve sempre essere eseguita e non deve differire dalla colorazione ottenuta tramite il normale protocollo immunomarcatura.
Fino ad ora, gli esperimenti di cattura laser sono stati in gran parte utilizzato per isolare popolazioni di cellule da animali transgenici che esprimono i marcatori come GFP o utilizzando colorazioni istologiche rapidi quali Nissl colorazione. Il metodo presentato qui permette di visualizzare le cellule di interesse mediante immunoistochimica. Isolare e acquisendo il expr geneProfilo ESSIONE delle popolazioni individuate chimicamente di cellule è ora possibile 17. Il protocollo qui descritto può essere applicato a tutti i tessuti e utilizzato con anticorpi adatti.
Nel cervello, neuroni possono essere divisi per la loro localizzazione geografica, ma la maggior parte delle regioni cerebrali contengono una varietà di differenti sottopopolazioni in base alla loro identità chimica. Il pattern di espressione genica di alcuni tipi di neuroni può essere in gran parte diverso da un altro tipo di cellula nella stessa zona cerebrale. Secondo il contesto biologico o patologico, profilo di espressione genica di una popolazione cellulare specifico può anche cambiare notevolmente. Utilizzando la procedura qui descritta, è possibile monitorare questi cambiamenti, aprendo la strada a nuove scoperte 8,18,19.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
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