Summary
Genuttryck analys av en delmängd av celler i en specifik vävnad utgör en stor utmaning. I artikeln beskrivs hur du isolera högkvalitativa total-RNA från en specifik cellpopulation genom att kombinera en snabb immunomärkning metod med laser capture microdissection.
Abstract
Laser capture microdissection (LCM) möjliggör isolering av specifika celler från tunna sektioner vävnad med hög rumslig upplösning. Effektiv LCM kräver exakt identifiering av celler subpopulationer från en heterogen vävnad. Identifiering av celler av intresse för LCM är vanligtvis baserad på morfologiska kriterier eller fluorescerande protein reportrar. Kombinationen av LCM och snabb immunomärkning erbjuder ett alternativt och effektivt sätt att visualisera specifika celltyper och att isolera dem från omgivande vävnad. Högkvalitativ RNA kan sedan extraheras från en ren cellpopulation och bearbetas vidare för tillämpningar efter, inklusive RNA-sekvensering, microarray eller QRT-PCR. Detta synsätt har tidigare utförts och kortfattat beskrivet i några publikationer. Målet med denna artikel är att belysa hur man utför en snabb immunomärkning av en cellpopulation samtidigt RNA integritet, och hur man kan isolera dessa specifika celler med hjälp LCM. Häri vi illustrerad detta förfarande i flera steg genom immunomärkning och fånga dopaminerga celler i hjärnvävnad från en dag gamla möss. Vi belysa viktiga kritiska steg som förtjänar särskild uppmärksamhet. Detta protokoll kan anpassas till en variation av vävnader och celler av intresse. Forskare från olika områden kommer sannolikt gynnas av demonstration av denna strategi.
Introduction
Hjärnan består av ett stort utbud av olika neuron typer bildar komplexa nätverk. Dessa nervceller är organiserade i olika grupper och undergrupper enligt deras morfologi, uppkoppling och genuttryck mönster 1. Utvecklingen av mikroarrayer, nästa generations sekvensering, och QRT-PCR erbjöd möjligheten att jämföra genuttrycksprofilerna av neuronala populationer i olika biologiska sammanhang 1,2. Dessa känsliga analyser kräver exakt identifiering och isolering av celltyper av intresse samtidigt hålla RNA integritet 2-4. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) teknik har använts i stor omfattning för att isolera specifika celltyper baserade på markörer och / eller morfologi på cellytan. FACS kräver en cell dissociation steg före sortering, vilket resulterar i en fullständig förlust av rumslig upplösning 5. Många neuronala subpopulationer särskiljs från varandra enligt deras anatomiska distribution i the hjärnan. Laser capture microdissection appliceras på tunna hjärnsektioner ger ett lämpligt alternativ för specifik isolering av celler med hög rumslig upplösning 6-8. En viktig begränsning av LCM har varit behovet att identifiera celler av intresse baserade på morfologiska kriterier eller fluorescerande protein reportrar genmanipulerade i djurmodeller. Utvecklingen av nya tekniker för att utföra snabba immunomärkning metoder som bevarade RNA integritet, i kombination med LCM, gör det nu möjligt isolering av cellpopulationer att gå vidare med gen-profileringsexperiment.
Detta synsätt har tidigare utförts och beskrivs kortfattat i några publikationer 1,9-13. Här visar vi ett detaljerat förfarande för att få hög kvalitet RNA från en särskild undergrupp av celler i en komplex vävnadsstruktur genom att kombinera snabb immunomärkning med LCM. Vi visar hur du utför viktiga kritiska åtgärder för att få maximal RNA återhämtning och undvika RNA nedbrytning eftersom det kan SIGligt slag genuttryck profilering.
För demonstration av detta protokoll, var dopaminerga neuroner från en-dag-gamla mus mitthjärnan riktade. Dopaminerga neuroner kan immunolabeled användning av en antikropp riktad mot tyrosinhydroxylas (TH), det hastighetsbegränsande enzymet för dopaminsyntes. Efter TH immunfärgning, enskilda eller grupper av dopaminerga nervceller kan sedan isoleras med hjälp av LCM. Microdissected Cellerna uppsamlas i lysbuffert, och RNA extraheras med användning av ett RNA-isoleringskit. Kvalitet och kvantitet av extraherat RNA mäts med hjälp av en bioanalyzer 5. Ytterligare analys av genuttryck använder: RNA-sekvensering, microarray, eller QRT-PCR kan därefter utföras 2,4,6. Som ett exempel, är en två-stegs QRT-PCR demonstrerade på laser fångade isolerade dopaminerga domäner. Relativ kvantifiering av expressionsnivåer av två dopaminerga neuron markörgener illustrerar selektivitet detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Experimenten utfördes i enlighet med den kanadensiska Guide för skötsel och användning av försöksdjur och godkändes av Université Laval djurskyddskommitté.
1. Provframställning
OBS: I det här exemplet har vi använt mushjärnor på postnatal dag 1.
- Använd hypotermi anestesi i krossad is i 3 till 4 min för valpar, sedan dissekera hjärnor så fort som möjligt i iskallt L15 medium. Utför detta steg inom 2 min.
- Överför dissekerade hjärnor i inbäddning mögel (jfr. Förteckning över materiel) och fyll med fryst vävnad inbäddning media som tar hand att orientera förlagan i önskad position. Frys prover omedelbart i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Utför detta steg inom 30 sekunder.
OBS: Prover kan lagras några månader utan att kompromissa med RNA kvalitet.
2. Sektione
- Treat membran coated glas (lista av material cf.) glider med ytan RNAse dekontamineringslösning att eliminera alla spår av RNAs. Tvätta bilderna i DEPC vatten och låt dem torka. Alternativt baka diabilder över natten vid 200 ° C.
- Överför frysta prover i en kryostat tidigare rengöras med en yta RNAse dekontamineringslösning. Ställ kryostat kammartemperatur vid -20 ° C och skiva prover vid 10 nm tjocklek. Samla vävnadssnitt på membranbelagda diabilder och låt dem torka 10 min innan färgning. Alternativt, lagra glider vid -80 ° C tills färgning.
3. Beredning av färgningslösningar
- Bered alla lösningar strax före starten av experimentet, och använda RNas-inhibitor i alla färgningslösningar (utom för tvättlösningar) för att förhindra RNA-nedbrytning.
- Bered buffertlösningen. Använd samma buffert i alla lösningar (som består av RNAs-fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 1% BSA,0,2% triton och 2% RNas-inhibitor). För varje bild, förbereda 400 | il buffertlösning (200 | il för de primära och 200 ul för de sekundära antikroppar).
- Förbered fixeringslösning: använd 70% etanol hölls vid -20 ° C. Håll vävnadsfixering förfarande minimal för att undvika en drastisk minskning av RNA-extraktion avkastningen.
OBS: Alternativt kan du använda 95% etanollösning kompletterad med 5% ättiksyra hölls vid -20 ° C. - Förbered den primära antikroppslösningen genom spädning av primär antikropp i buffertlösningen. För dopaminerga neuroner märkning, använd en antikropp med inriktning på tyrosinhydroxylas (TH, hastighetsbegränsande enzym för dopamin produktion). Använd en hög koncentration av antikropp för att kompensera för den snabba inkubationstiden. Använd TH antikropp vid en utspädning av 1:25.
OBS: Vid normal immunofluorescens protokoll, ger denna antikropp en stark signal när de inkuberas över natten vid en utspädning av 1: 1000. I detta protokoll används det 40X mer Koncentrated grund av den korta inkubationstiden. På grund av den höga koncentrationen av antikroppar som används för denna metod, utför en standardimmunfärgning parallellt för att kontrollera eventuell ökning av icke-specifik märkning. - Förbered sekundär antikroppslösningen genom spädning av sekundär antikropp i buffertlösningen. Använd en biotinylerad sekundär antikropp vid en koncentration av 1: 100.
OBS: I detta exempel använde vi en anti-kanin biotinylerad antikropp. - Förbered avidin-biotin-komplex (ABC) lösning för detektion av biotinylerade sekundära antikroppar. Gör ABC-lösning genom tillsats av föreningen A och föreningen B vid en koncentration av 1: 100 utspätt i DEPC PBS kompletterad med 2% RNas-inhibitor. Förbered avidin-biotin komplex 30 min innan den läggs till bilderna.
4. Färgning
- Tina en eller två bilder på tiden från -80 ° C genom att ställa dem i luften snabbt (eller använd en luftfläkt). Surround sektioner med en hydrofobbarriär penna och låt torka i några sekunder.
- Placera objektglasen i den kalla fixeringslösning för högst 5 min vid -20 ° C. Skaka gång i luften för att avlägsna överskott av fixeringslösning sedan, snabbt doppa diabilder i DEPC PBS 6-8 gånger för tvätt.
- Flick bilderna för att avlägsna överskott av DEPC PBS. Se till att objektglasen avfrostning steg inte överstiger 5 minuter.
- Placera glasen på en ren bricka (förbehandlas med en yta RNAse dekontamineringslösning att eliminera alla spår av RNAs) och sätta 200 pl av den primära antikroppen lösningen på varje bild (kanin anti-TH) under 10 minuter vid rumstemperatur. Doppa glider snabbt i DEPC PBS 3 gånger för tvätt och flick bilderna en gång för att ta bort överskottet av DEPC PBS.
- Sätt 200 pl av den sekundära antikroppslösningen på varje objektglas under 6 minuter vid rumstemperatur. Dip glider snabbt 3 gånger i DEPC PBS för att tvätta och bläddra bilderna för att ta bort överskottet av DEPC PBS.
- Sätt 200 ìl av ABC lösningarning på varje objektglas under 4 min vid rumstemperatur. Doppa glider snabbt i DEPC PBS 3 gånger för tvätt och bläddra bilderna för att avlägsna överskottet DEPC PBS.
- Förbered DAB (3,3 'diaminobensidin) lösning under 4 min av inkubation i ABC-lösning. Använd reagensen tillhandahållna i kitet (DAB Peroxidase Substrate Kit). Blanda 1 droppe tillgänglig buffert, en droppe av DAB-lösning och en droppe 30% H2O 2 i 2,5 ml av DEPC vatten. Blanda lösningen genom att vända.
- Ta 196 ul av DAB-lösning och tillsätt 4 pl (2%) av RNAs-inhibitor-lösning strax före spridning på objektglas. Placera glasen på en ren bricka (förbehandlas med en yta RNAs dekontamineringslösning) och sätta 200 pl DAB-lösning på diabilder.
OBS: DAB-lösning bör reagera within1 eller 2 min. - Doppa glider snabbt i DEPC PBS 3 gånger för att tvätta och sätta diabilder för några sekunder i absolut etanol. Torka bilderna genom att snärta dem i luften (eller använd en luftfläkt). <Br /> OBS: Objektglasen kan förvaras vid -80 ° C för framtida användning eller bearbetas för LCM.
5. Laser Capture Microdissection
- Frosta diabilder snabbt genom att ställa dem i luften (eller använd en luftfläkt). Se till att objektglasen avfrostning steg inte överstiger 5 minuter.
- Gå vidare till LCM. Placera objektglaset under mikroskopet med provsidan vänd mot uppsamlingsröret locket. Välj den bästa förstoringen för provet. Justera fokus att se cellerna av intresse.
- Definiera skärområdet och börja skära med laser. Samla dissekerade celler eller bit vävnad i uppsamlingsröret locket fylldes med 50 ul av lyseringsbuffert (från RNA-extraktion satsen). Säkerställa att steget av LCM inte överstiger 30 minuter.
- Utdrag totala RNA från isolerade celler med hjälp av en RNA-extraktion kit (jfr. Materiallista). Följ tillverkarens protokoll.
- Inkubera uppsamlade cellerna under 30 min vid 42 ° C tilllysera cellerna. Pre-condition RNA reningskolonn genom att tillsätta 250 l av konditionebuffert. Load 50 pl etanol till lyserade celler. Ladda 100 pl lyserade celler på en konditionreningskolonn.
- Centrifugera kolonnen vid 16.000 xg under 2 min vid rumstemperatur. Tvätta kolonnen två gånger med tvättbuffertar. Eluera i den minimala rekommenderade volymen (11 l) av RNAs-fritt vatten (inte DEPC-behandlat eftersom det kan störa bioanalyser). Håll 2 pl till testkvalitet.
OBS: Alla lösningar och reagenser finns i satsen.
6. cDNA-syntes och Kvantitativ RT-PCR
- Omvänd-transkribera RNA-prov från laser fångade dopaminerga celler in i komplementärt DNA med hjälp av omvänt transkriptas och oligo (dT). Följ tillverkarens protokoll (jfr. Lista på material).
- Använd ett pl av cDNA för QRT-PCR-amplifiering med genspecifika primrar. Ställ in PCR reaTGÄRDER i 20 pl volym med en en-komponent hot start-reaktionsblandningen för kvantitativ PCR såsom rekommenderas av tillverkaren. Utför varje reaktion i triplikat.
- För de experiment som beskrivs här, använd följande primerpar: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG GTT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'); AADC-F (5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
- Utför kvantitativ RT-PCR-amplifiering med användning av följande snabba cyklingsparametrar: 95 ° C under 5 min följt av 45 cykler av 10 sek 95 ° C, 10 sek vid 60 ° C och 10 sek vid 72 ° C. Utför smältkurvanalys använder standardinställningen för det instrument som determine homogen produkt bildning.
- Analysera data med hjälp av den inbyggda mjukvaran.
- Normalisera uttrycksvärden för DA markörer gener Th och AADC med uttrycket av de två referens generna GAPDH och Rpl13a att få relativa uttryck nivåer som beskrivits tidigare 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta snabbförfarande immunomärkning möjliggör visualisering av celler av intresse och samtidigt hålla RNA integritet. Figur 1 visar stegen förberedelser vävnad innan RNA-extraktion. Efter cryosectioning är dopaminerga neuroner märkta med användning av en antikropp riktad mot tyrosinhydroxylas (märkta neuroner visas i brunt). Beroende av den experimentella frågan, kan enstaka celler eller större område av intresse isoleras med hjälp av LCM (Figur 1D - E). Det är viktigt att bedöma kvaliteten av RNA extraherat, som nedbrutet RNA kommer att ha en betydande inverkan på kvaliteten på följande analys. Varje prov är således behandlas på ett mikrofluidik-baserad plattform bioanalyser för kvantifiering och för att kontrollera RNA integritet. Figur 2 visar typiska bioanalyser resultaten av nedbrutna och god kvalitet prover. Både digitala gel och elektroferogram visar vikten av att använda RNAs hämmare i varje solmepannor att skydda RNA. Den förväntade mängden RNA extraherat från 500 nervceller är cirka 1-2 ng. Microdissected celler från flera vävnadssnitt kan samlas i samma rör för att öka RNA kvantitet.
Figur 1: Snabb immunomärkning och laser capture microdissection förfarande. (A) Schematisk visar sagittalvy av en mushjärna på embryonala dag 15,5. Svart linje visar var de anteroposterior regioner där mitthjärnan dopaminneuroner är belägna. Tunna sektioner görs med hjälp av en kryostat och insamlas membranbelagda glasskivor. Efter immunomärkning, mitthjärnan dopaminerga neuroner är synliga i brunt (B). Laser microdissected prover samlas i ett rör lock fylld med lyseringsbuffert (C). Regionen av intresse (blå linjen i D)eller individuell cell (E) kan dissekeras och hämtas i rörets lock. Skala barer: (D) 250 pm, (E) 50 pm.
Figur 2: Kvalitetskontroll av totala prov RNA isolerades efter laser capture microdissection använder en bioanalyzer chip kit (A) Den digitala gel erhålls med bioanalyzer (L, stege, 1, prov 1 utan RNAs hämmare (RNAsine), prov 2 med RNAsine. ). (B) elektroferogrammen prov 1 (övre panelen) visar delvis försämrat RNA och prov 2 (nedre panelen) typiska för god kvalitet RNA (RIN> 8 är acceptabelt bra) där 18S / 28S rRNA toppar syns tydligt. (C) Normaliserade relativa uttryck nivåer representerade i faldig förändring för två DA markörgener (TH och AADC) mellan omgivande ofärgade tfrågan och DA-domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiska punkten av denna metod består i att märka celler av intresse samtidigt förhindra RNA nedbrytning. Som RNAs är aktiva i vattenlösningar, minskar inkubationstider förbättrar RNA bevarande 11,15. Alla lösningar som används måste behandlas med DEPC att inaktivera RNAs. Alla material och ytor måste behandlas med en yta RNAs dekontamineringslösning att förhindra RNAs kontamination. Slutligen, under dessa förhållanden, är tillsatsen av RNAs-inhibitor i alla lösningar effektiva i att bevara RNA från att brytas ner. Användningen av höga salt villkor som tillämpas vid antikropps inkubation har tidigare visat sig vara effektiva i att bevara RNA 9,10. Dock kvarstår denna alternativa metod begränsad till snabb färgning med robusta antikroppar. Tjockleken av sektionerna representerar en annan kritisk punkt och beror på storleken på cellen av intresse. Eftersom den genomsnittliga storleken på cellkroppen av dopaminerga neuroner är ca 1081, m, väljer vi här avsnittet tjocklek för att erhålla ett lager av celler.
Den huvudsakliga begränsningen med denna teknik jämfört med FACS är det låga antalet celler som kan microdissected. Krävs användning av RNA-förstärkning kit för gen profilering experiment med RNA-sekvensering eller mikromatris 16. Emellertid kan QRT-PCR utföras direkt utan amplifieringssteget (figur 2c). Kvalitativ bedömning av färgning erhålls med snabb immunomärkning protokollet ska alltid utföras och bör inte avvika från färgning erhålls med användning av normala immunomärkning protokollet.
Hittills har laserinfångningsexperiment oftast används för att isolera populationer av celler från transgena djur som uttrycker markörer såsom GFP eller med snabba histologiska färgningar såsom Nissl-färgning. Den metod som presenteras här tillåter visualisera celler av intresse att använda immunohistokemi. Isolera och förvärva genen expression profil kemiskt identifierade populationer av celler är nu möjligt 17. Protokollet som beskrivs här kan tillämpas på alla vävnader och användas med vilka som helst lämpliga antikroppar.
I hjärnan kan nervceller delas av sin geografiska lokalisering, men de flesta områden i hjärnan innehåller en mängd olika subpopulationer baserat på deras kemiska identitet. Genuttrycksmönstret av vissa typer av neuroner kan vara olika stor del från en annan celltyp i samma hjärnområde. Enligt den biologiska eller patologiskt sammanhang kan genuttryck profil av en specifik cellpopulation också förändras avsevärt. Användning av förfarandet beskrivet här, är det möjligt att övervaka dessa förändringar, vilket banar väg för nya upptäckter 8,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
