Summary
Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.
Abstract
Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ermöglicht die Isolierung von spezifischen Zellen von Gewebedünnschnitten mit hoher räumlicher Auflösung. Effektive LCM erfordert eine genaue Identifizierung von Zellen-Subpopulationen aus einer heterogenen Gewebe. Identifizierung von Zellen von Interesse hinsichtlich LCM wird normalerweise auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierendes Protein Reporter basiert. Die Kombination von LCM und schnelle Immunomarkierung bietet eine Alternative und effizientes Mittel, um spezifische Zelltypen zu visualisieren und um sie vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Hochwertige RNA kann dann von einer reinen Zellpopulation extrahiert werden und für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR weiterverarbeitet werden. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Veröffentlichungen beschrieben. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigen, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Zellpopulation durchzuführen und dabei RNA Integrität, und wie man diese spezifischen Zellen mit LCM isolieren. Hierin zeigen wird dieses mehrstufigen Verfahrens durch Immunmarkierung und die Erfassung dopaminergen Zellen im Hirngewebe von einem Tage alten Mäusen. Wir heben Taste kritischen Schritte, die besondere Beachtung verdienen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Geweben und Zellen von Interesse angepasst werden. Forscher aus verschiedenen Bereichen wird wahrscheinlich von der Demonstration dieses Ansatzes profitieren.
Introduction
Das Gehirn ist von einer großen Vielfalt von verschiedenen Neuronentypen Bilden komplexer Netzwerke zusammen. Diese Neuronen sind in verschiedene Gruppen und Untergruppen nach ihrer Morphologie, Konnektivität und Genexpressionsmuster 1 organisiert. Die Entwicklung von Mikroarrays, der nächsten Generation Sequenzierung und qRT-PCR bot die Möglichkeit, Genexpressionsprofile von neuronaler Populationen in verschiedenen biologischen Kontexten 1,2 zu vergleichen. Diese empfindlichen Analysen erfordern die präzise Identifizierung und Isolierung von Zelltypen von Interesse während RNA Integrität 2-4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik wurde allgemein verwendet, um spezifische Zelltypen, basierend auf Zelloberflächen-Marker und / oder Morphologie zu isolieren. FACS benötigt eine Zellabtrennungsschritt vor der Sortierung, die in einem vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung 5 führt. Viele neuronalen Subpopulationen voneinander unterschieden entsprechend ihrer anatomischen Verteilung in the Gehirn. Laser Mikrodissektion auf dünnen Gehirnschnitte angewendet bietet eine geeignete Option für spezifische Isolierung von Zellen mit hoher räumlicher Auflösung 6-8. Eine Hauptbeschränkung von LCM wurde die Notwendigkeit, Zellen von Interesse, basierend auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierenden Reporterproteine genetisch in Tiermodellen entwickelt identifizieren. Die Entwicklung neuer Techniken, um schnell Immunomarkierung Methoden, die RNA-Integrität bewahrt, in Kombination mit LCM durchzuführen, erlaubt nun die Isolierung von Zellpopulationen mit Gen-Profiling-Experimente fort.
Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Publikationen 1,9-13 beschrieben. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren zu hochwertigen RNA von einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einer komplexen Gewebestruktur durch Kombinieren schnellen Immunmarkierung mit LCM erhalten. Wir zeigen, wie die wichtigsten kritischen Schritte durchführen, um eine maximale RNA-Gewinnung zu erhalten und zu vermeiden RNA-Abbau wie es siglich Auswirkungen Genexpressionsanalysen.
Zur Demonstration dieses Protokoll wurden dopaminergen Neuronen von einem Tag alten Maushirn abgezielt. Dopaminergen Neuronen kann mit Hilfe eines gegen Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörpers, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für Dopaminsynthese immunolabeled werden. Nach TH Immunfärbung können einzelne oder Gruppen von dopaminergen Neuronen dann mit LCM isoliert werden. Mikrodissezierten Zellen werden in Lysepuffer gesammelt und RNA wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit extrahiert. Qualität und Quantität der RNA extrahiert werden mit einem Bioanalyzer 5 gemessen. Die weitere Analyse der Genexpression mit: RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR kann anschließend durchgeführt 2,4,6 werden. Als ein Beispiel wird ein zweistufiger qRT-PCR von den Laser erfassten isolierten dopaminergen Domänen gezeigt. Die relative Quantifizierung der Expressionsniveaus von zwei dopaminergen Neurons Markergene zeigt die Selektivität dieses Protokolls.
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Protocol
HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den kanadischen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Université Laval Tierschutzkommission genehmigt.
1. Probenvorbereitung
HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir Mäusegehirnen bei postnatalen Tag 1.
- Verwenden Hypothermie Anästhesie in zerstoßenem Eis für 3 bis 4 Minuten für Welpen, dann zerlegen Gehirn so schnell wie möglich in eiskaltem L15 Medium. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 2 min.
- Über seziert Gehirn in das Einbetten (Liste von Gütern vgl.) Form und füllen mit gefrorenen Gewebeeinbettungsmedien darauf achten, dass die Probe in der gewünschten Position zu orientieren. Frieren Proben sofort in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Führen Sie diesen Schritt innerhalb von 30 Sekunden.
HINWEIS: Die Proben können einige Monate gelagert werden, ohne die RNA-Qualität.
2. Schnitte
- Treat Membran coated Glasobjektträger (vgl. Liste der Material) mit Oberflächen RNAse Dekontaminationslösung, um jede Spur von RNAsen zu beseitigen. Waschen Sie die Folien in DEPC-Wasser und trocknen lassen. Alternativ backen Plättchen über Nacht bei 200 ° C.
- Übertragen Sie eingefrorenen Proben in einem Kryostaten zuvor mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung gereinigt. Stellen Kryostatkammer Temperatur bei -20 ° C und in Scheiben schneiden Proben bei 10 & mgr; m Dicke. Sammeln Gewebeschnitte auf die Membran beschichteten Objektträgern und trocknen lassen 10 Minuten vor der Färbung. Alternativ gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung.
3. Herstellung von Färbelösungen
- Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Beginn des Experiments, und mit RNAse Inhibitor in allen Färbelösungen (außer Waschlösungen), um RNA-Abbau zu verhindern.
- Bereiten Sie die Pufferlösung. Verwenden des gleichen Puffers in allen Lösungen (RNase-freies Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS besteht) von 1% BSA ergänzt war,0,2% Triton und 2% RNAse-Inhibitor). Für jede Folie, bereiten 400 ul Pufferlösung (200 ul für den primären und 200 ul für die Sekundärantikörper).
- Bereiten Sie die Fixierungslösung: Verwenden Sie 70% Ethanol aufbewahrt bei -20 ° C. Halten der Gewebefixierung Verfahren minimal um eine drastische Verringerung der RNA Extraktionsausbeute zu vermeiden.
HINWEIS: Alternativ können 95% Ethanol-Lösung von 5% Essigsäure ergänzt war, bei 20 ° C gehalten. - Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung durch Verdünnen des primären Antikörpers in der Pufferlösung. Für dopaminergen Neuronen Kennzeichnung, verwenden Sie ein Antikörper, der auf die Tyrosin-Hydroxylase (TH, geschwindigkeitsbestimmende Enzym für Dopamin-Produktion). Mit einer hohen Konzentration des Antikörpers, um für die schnelle Inkubationszeit kompensieren. Verwenden TH-Antikörper in einer Verdünnung von 1:25.
HINWEIS: Im normalen Immunfluoreszenz-Protokoll, diese Antikörper gibt ein starkes Signal, wenn über Nacht bei einer Verdünnung von 1: 1000. In diesem Protokoll wird es verwendet, 40x Konzentrataufgrund der kurzen Inkubationszeit ed. Aufgrund der hohen Konzentration des Antikörpers für dieses Verfahren verwendet, führen Sie eine Standard-Immunfärbung parallel, um jede Zunahme der nicht-spezifische Markierung überprüfen. - Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung durch Verdünnung des sekundären Antikörpers in der Pufferlösung. Verwenden eines biotinylierten sekundären Antikörpers in einer Konzentration von 1: 100.
HINWEIS: In diesem Beispiel wurde ein Anti-Kaninchen-Antikörper biotinyliert. - Vorbereiten des Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Lösung zum Nachweis von biotinylierten sekundären Antikörper. Make ABC-Lösung durch Zugabe der Verbindung A und der Verbindung B in einer Konzentration von 1: 100 in DEPC PBS verdünnt, ergänzt mit 2% RNAse Inhibitor. Bereiten Sie die Avidin-Biotin-Komplex 30 Minuten, bevor Sie den Folien.
4. Die Färbung
- Tauen Sie ein oder zwei Folien zu der Zeit von -80 ° C nach schneller schnippte sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Surround Abschnitten mit einer hydrophobenBarriere Stift und lassen Sie für ein paar Sekunden trocknen.
- Die Objektträger in der kalten Fixierungslösung für nicht mehr als 5 min bei -20 ° C. Einmal schütteln, in der Luft, um mehr als Fixierungslösung anschließend in DEPC PBS 6-8 mal zum Waschen entfernen, schnell die Objektträger.
- Streichen Sie die Folien, um überschüssige DEPC PBS zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten.
- Objektträger auf eine saubere Schale (mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt, um jede Spur von RNAsen beseitigen) und setzte 200 ul des primären Antikörperlösung auf jeder Folie (Kaninchen-Anti-TH) für 10 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und Flick die Folien einmal, um den Überschuss an DEPC PBS zu entfernen.
- Setzen 200 ul des sekundären Antikörperlösung auf jedem Objektträger 6 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell 3 mal in DEPC PBS zum Waschen und Flick die Folien, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen.
- Setzen Sie 200 ul der ABC Lösungention auf jedem Objektträger für 4 min bei Raumtemperatur. Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal für das Waschen und die Folien blättern, um das überschüssige DEPC PBS zu entfernen.
- Bereiten Sie die DAB (3,3 'Diaminobenzidin) Lösung während der 4 min Inkubation in der ABC-Lösung. Verwenden Sie die Reagenzien im Kit (DAB Peroxidasesubstrat Kit) zur Verfügung gestellt. Mix 1 Tropfen vorgesehen Puffer, 1 Tropfen DAB-Lösung und 1 Tropfen 30% H 2 O 2 in 2,5 ml DEPC-Wasser. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen.
- Nehmen Sie 196 ul der DAB-Lösung und fügen Sie 4 ul (2%) von RNAse Inhibitor-Lösung kurz vor Aufbringen auf Objektträger. Die Objektträger auf einer sauberen Schale (mit einer Fläche RNAse Dekontaminationslösung vorbehandelt) und legte die 200 ul der DAB-Lösung auf den Objektträgern.
HINWEIS: DAB-Lösung sollte within1 oder 2 min reagieren. - Dip gleitet schnell in DEPC PBS 3 mal zum Waschen und legte Folien für einige Sekunden in absolutem Ethanol. Trocknen Sie die Folien durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). <br /> Hinweis: Folien können bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gelagert oder für LCM verarbeitet werden.
5. Laser Capture Mikrodissektion
- Tauen Sie gleitet schnell durch flicking sie in der Luft (oder ein Luftgebläse). Stellen Sie sicher, dass die Schieber Auftauen Schritt ist 5 Minuten nicht überschreiten.
- Fahren Sie mit LCM. Den Objektträger unter dem Mikroskop mit Blick auf das Sammelrohr Kappe der Probenseite. Wählen die beste Vergrößerung für die Probe. Stellen Sie den Fokus, um die Zellen von Interesse zu sehen.
- Legen Sie den Schnittbereich und fang an zu schneiden mit dem Laser. Sammeln seziert Zellen oder Gewebestück in der Sammelrohrkappe mit 50 ul Lysepuffer (von RNA-Extraktions-Kits) gefüllt. Sicherzustellen, dass der Schritt des LCM ist 30 min nicht übersteigt.
- Auszug Gesamt-RNA aus Zellen isoliert unter Verwendung einer RNA-Extraktions-Kits (vgl. Liste der Materialien). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
- Inkubieren gesammelten Zellen für 30 min bei 42 ° C zuLyse der Zellen. Voraussetzung der RNA Reinigungskolonne durch Zugabe von 250 ul der Konditionierungspuffer. Last 50 ul Ethanol zu lysierten Zellen. Laden Sie die 100 ul der lysierten Zellen auf eine vorkonditionierte Reinigungssäule.
- Zentrifugieren Sie die Spalte bei 16.000 g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Zweimal Die Säule wird mit Waschpuffer. Eluieren in der minimal empfohlenen Volumen (11 ul) von RNase-freies Wasser (nicht behandelt DEPC wie es mit dem Bioanalyzer stören). Halten Sie 2 ul Testqualität.
HINWEIS: Alle Lösungen und Reagenzien sind im Kit enthalten.
6. cDNA Synthese und Quantitative RT-PCR
- Reverse Transkription und RNA-Proben aus dem Laser eingefangen dopaminergen Zellen in komplementäre DNA mittels reverser Transkriptase und Oligo (dT). Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers (vgl. Liste von Material).
- Verwenden 1 ul cDNA für qRT-PCR-Amplifikation mit genspezifischen Primern. Richten PCR reactions in 20 ul Volumen mit einer einkomponentigen Heißstartreaktionsmischung für quantitative PCR, wie vom Hersteller empfohlen. Führen Sie jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung.
- Für die hier beschriebenen Experimente, die folgenden Primerpaare: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'); Th-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / Th-R (5'-GAA AAT GGG CAG ACA CAC G-3'); AADC-F (5'-CAT AGC GAG TTC TGC CCT TC-3 ') / AADC-R (5'-GGA TGT GGT CCC TGT CAG AG-3').
- Führen quantitative RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Rapid Cycling-Parameter: 95 ° C für 5 min, gefolgt von 45 Zyklen von 10 sec 95 ° C, 10 sec bei 60 ° C und 10 sec bei 72 ° C. Führen Schmelzkurvenanalyse mit dem Standard-Einstellung des Instruments auf Bestimne homogene Produktbildung.
- Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der integrierten Software.
- Normalisierung der Expressionswerte DA Marker Gene Th und AADC mit der Expression der beiden Referenzgenen GAPDH und Rpl13a um relative Expressionsniveaus zu erhalten, wie zuvor beschrieben 14.
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Representative Results
Diese schnelle Immunomarkierung Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Zellen von Interesse während RNA Integrität. 1 veranschaulicht die Schritte der Gewebeaufbereitung vor RNA-Extraktion. Nach Kryoschneiden werden dopaminergen Neuronen mit einem gegen die Tyrosin-Hydroxylase gerichteten Antikörper (markierten Neuronen in braun angezeigt) gekennzeichnet. Je nach der experimentellen Frage, können einzelne Zellen oder größere Region von Interesse mit LCM isoliert werden (1D - E). Es ist wichtig, um die Qualität der RNA extrahiert bewerten, da degradierten RNA wird erhebliche Auswirkungen auf die Qualität der folgenden Analyse haben. Jede Probe wird somit auf einem Mikrofluidik-basierten Plattform Bioanalyzer zur Quantifizierung und zur RNA-Integritätsprüfung verarbeitet. Abbildung 2 zeigt typische Bioanalyzer Ergebnisse abgebaut und von guter Qualität Proben. Sowohl digitale Gel und Elektropherogramme zeigen die Bedeutung der Verwendung RNAse Inhibitor in jedem Solution zum Schutz der RNA. Die erwartete Menge an RNA aus 500 Neuronen extrahiert ist etwa 1-2 ng. Mikrodissezierten Zellen aus mehreren Gewebeschnitte können im gleichen Röhrchen gepoolt werden, um RNA-Menge zu erhöhen.
Abbildung 1: Schnelle Immunmarkierung und die Laser Mikrodissektion Verfahren. (A) Schematische Darstellung sagittale Ansicht eines Mäusegehirns an embryonalen Tag 15,5. Schwarze Linie zeigt den Standort der anteroposterioren Regionen Hirn Dopaminneuronen befinden. Dünne Schnitte werden unter Verwendung eines Kryostat hergestellt und sind auf der Membran beschichteten Glasobjektträgern gesammelt. Nach Immunomarkierung sind dopaminergen Mittelhirnneuronen in braun (B) sichtbar. Laser Mikrodissektion Proben werden in einem Rohrkappe mit Lysepuffer (C) gefüllt gesammelt. Region of Interest (blaue Linie in D)oder Einzelzelle (E) seziert und in der Rohrkappe abgerufen werden. Maßstabsbalken: (D) 250 um, (E) 50 um.
Abbildung 2: Qualitätskontrolle von RNA-Probe, nachdem die Laser Mikrodissektion mit einem Bioanalyzer Chip Kit isoliert (A) Die digitale Gel mit dem Bioanalyzer (L, Leiter erhalten; 1, Probe 1, ohne RNAse-Inhibitor (RNAsine), Probe 2 mit RNAsine. ). (B) Elektropherogramme der Probe 1 (oben), die teilweise abgebaute RNA und Probe 2 (unten) typisch für qualitativ hochwertige RNA (RIN> 8 annehmbar gut), in der die 18S / 28S rRNA-Gipfel sind deutlich sichtbar. (C) Normalized relativen Expressionslevel zwischen umgebenden ungefärbten t in fache Veränderung für zwei DA Markergene (TH und AADC) vertretenAusgabe- und DA-Domäne. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Der kritischste Punkt dieses Verfahrens besteht darin, die Markierung von Zellen von Interesse, während verhindert RNA-Abbau. Wie RNAsen in wässrigen Lösungen aktiv sind, abnehm Inkubationszeiten verbessert RNA Erhaltung 11,15. Alle verwendeten Lösungen müssen mit DEPC, um RNasen zu inaktivieren behandelt werden. Alle Materialien und Oberflächen benötigen, um mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung zu RNAsen Kontamination zu verhindern behandelt werden. Schließlich wird in diesen Bedingungen ist der Zusatz von RNAse Inhibitor in allen Lösungen wirksam bei der Erhaltung von RNA degradiert. Die Verwendung von Hoch während Antikörperinkubation aufgebracht Salzbedingungen ist zuvor gezeigt worden, wirksam zu bewahren RNA 9,10 sein. Allerdings bleibt diese alternative Methode beschränkt sich auf schnelle Färbung mit robusten Antikörper. Die Dicke der Abschnitte ist ein weiterer kritischer Punkt und hängt von der Größe der Zelle. Da die durchschnittliche Grße der Zellkörper von dopaminergen Neuronen bei etwa 1081; m, wählen wir diesen Abschnitt Dicke einer Schicht von Zellen zu erhalten.
Die wesentliche Einschränkung dieser Technik im Vergleich zur FACS ist die geringe Anzahl von Zellen, die Mikrodissektion werden kann. Für die Gen-Profiling-Experimente unter Verwendung von RNA-Sequenzierung oder Microarray 16 ist der Einsatz von RNA-Amplifikation Kit erforderlich. Jedoch kann qRT-PCR direkt ohne Amplifikationsschritt (2c) durchgeführt werden. Qualitative Bewertung des mit dem Schnell Immunomarkierung Protokolls erhaltenen Färbung sollte immer durchgeführt werden und nicht von der Verwendung der normalen Immunmarkierung Protokoll erhalten Färbung unterscheiden.
Bisher waren Laser-Capture-Experimente meist verwendet, um Populationen von Zellen aus transgenen Tieren zum Ausdruck Marker wie GFP oder mit Schnell histologische Färbungen wie Nissl-Färbung zu isolieren. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Visualisierung interessierenden Zellen mittels Immunhistochemie. Isolierung und den Erwerb der Gen exprSession Profil chemisch identifiziert Populationen von Zellen ist nun möglich 17. Das hier beschriebene Protokoll kann auf alle Gewebe aufgebracht und mit beliebigen geeigneten Antikörpern verwendet werden.
Im Gehirn kann Neuronen durch die geographische Lokalisierung aufgeteilt werden, aber die meisten Hirnregionen enthalten eine Vielzahl verschiedener Subpopulationen auf der Basis ihrer chemischen Identität. Das Gen-Expressionsmuster von bestimmten Arten von Neuronen stark unterschiedlich von einem anderen Zelltyp in der gleichen cerebralen Bereich. Nach dem biologischen oder pathologischen Kontext können Genexpressionsprofil eines bestimmten Zellpopulation erheblich ändern. Mit der hier beschriebenen Vorgehensweise ist es möglich, diese Änderungen zu überwachen und damit den Weg zu neuen Entdeckungen 8,18,19.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
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