Summary
特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。
Abstract
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、高空間分解能を有する薄い組織切片から特定の細胞の単離を可能にする。効果的なLCMは、異種の組織からの細胞の亜集団の正確な同定を必要とします。 LCMのための目的の細胞の同定は、通常、形態学的基準や蛍光タンパク質レポーターに基づいています。 LCMおよび迅速な免疫標識の組み合わせは、特定の細胞型を視覚化し、周囲の組織から隔離するための代替的かつ効率的な手段を提供する。高品質RNAは、その後、純粋な細胞集団から抽出し、さらにRNA配列決定、マイクロアレイまたは定量RT-PCRなどの下流の適用のために処理することができる。このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物に記載されている。この記事の目的は、RNAの完全性を維持しながら、細胞集団の迅速な免疫標識を実行する方法を説明するために、どのようにLCMを用いて、これらの特定の細胞を単離することである。ここで、我々は説明するdは、この多段階手順1日齢マウスからの脳組織におけるドーパミン作動性細胞の免疫標識および捕捉することができる。我々は、特別な配慮に値する重要な重要なステップを強調表示します。このプロトコルは、目的の組織および種々の細胞に適合させることができる。異分野の研究者らは、おそらくこのアプローチのデモの恩恵を受ける。
Introduction
脳は、複雑なネットワークを形成する異なるニューロンタイプの多種多様で構成されている。これらのニューロンは、それらの形態、接続性と遺伝子発現パターン1に係る個別のグループおよびサブグループに編成されています。マイクロアレイ、次世代シーケンシング、および定量RT-PCRの開発は、異なる生物学的状況1,2におけるニューロン集団の遺伝子発現プロファイルを比較するための可能性を提供する。 RNAの完全性を維持しながら、2-4これらの高感度分析は、目的の細胞型の正確な同定および単離を必要とする。蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術が広く細胞表面マーカーおよび/または形態学に基づいて、特定の細胞型を単離するために使用されている。 FACSは、空間分解能5の完全な損失をもたらすソーティング前の細胞解離段階を必要とします。多くのニューロンの亜集団は、目での解剖学的分布に応じて互いに区別さEの脳。薄い脳切片に適用レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、高空間分解能6-8での細胞の特定の分離のための適切なオプションを提供します。 LCMの主な制限は、形態学的基準または遺伝的動物モデルで操作蛍光タンパク質レポーターに基づいて目的の細胞を同定するために必要であった。 LCMと組み合わせて、RNAの完全性を保存クイック免疫標識法を行うための新しい技術の開発が、現在、遺伝子プロファイリング実験を続行する細胞亜集団の単離を可能にする。
このアプローチは、以前に実行され、簡単に、いくつかの刊行物1,9-13に記載されている。ここでは、LCMを迅速免疫標識を組み合わせることによって、複雑な組織構造内の細胞の特定のサブセットから高品質のRNAを得るための詳細な手順を示す。我々は、最大のRNA回収率を得るために重要な重要なステップを実行し、sigができるように、RNAの分解を回避する方法を示してnificantly遺伝子発現プロファイリングに影響を与える。
このプロトコルのデモンストレーションのために、1日齢のマウスの脳からドーパミン作動性ニューロンが標的とされた。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパミン合成の律速酵素に対する抗体を用いて免疫標識することができる。 TH免疫染色に続いて、ドーパミン作動性ニューロンの個人またはグループは、その後LCMを用いて単離することができる。顕微解剖した細胞を、溶解緩衝液中に収集され、そしてRNAは、RNA単離キットを用いて抽出した。品質と抽出されたRNAの量は、バイオアナライザー5を使用して測定される。用いた遺伝子発現のさらなる分析：RNA配列決定、マイクロアレイ、または定量RT-PCRは、続いて2,4,6-を行うことができる。一例として、二段階のqRT-PCRは、単離されたドーパミン作動性ドメインを捕捉し、レーザーで実証されている。 2ドーパミン作動性ニューロンのマーカー遺伝子の発現レベルの相対的定量化は、このプロトコルの選択性を示している。
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Protocol
注：実験は、実験動物の管理と使用に関するカナダのガイドに従って行ったとラヴァル大学動物保護委員会によって承認された。
1.サンプルの調製
注：この例では、生後1日目のマウスの脳を使用していました。
- その後氷冷L15培地中で可能な限り迅速に脳を解剖、子犬のために3から4分間砕いた氷に低体温麻酔を使用してください。 2分以内に、この手順を実行します。
- 転送は、金型（物資のCF。リスト）を埋め込 んで脳を解剖し、凍結組織包埋媒体が所望の位置に試料を方向付けるように注意しながらで埋める。 -80℃で液体窒素や店舗ですぐに標本をフリーズします。 30秒以内に、この手順を実行します。
注：試料は、RNAの品質を損なうことなく、数ヶ月保存することができる。
2.セクショニング
- メンブレンCOAトリートテッドガラススライド（CF素材のリスト）表面アーゼ除染液とは、RNアーゼの痕跡を除去する。 DEPC水でスライドを洗浄し、それらを乾燥させます。代わりに、一晩200℃で焼くスライド。
- 以前に、表面のRNAse除染液で洗浄するクライオスタットで凍結サンプルを転送します。 10μmの厚さでCとスライス標本を-20℃でクライオスタットチャンバ温度を設定します。膜コーティングしたスライド上の組織切片を収集し、染色の前にそれらを乾燥10分ましょう。また、ストアは、染色まで-80℃でスライドする。
染色溶液の調製
- 単に実験の開始前に、すべての溶液を調製し、RNAの分解を防ぐために（洗浄液を除く）すべての染色溶液中のRNアーゼ阻害剤を使用する。
- 緩衝溶液を準備します。 、すべての溶液に、同じ緩衝液を使用して（1％BSAを補充した成るRNアーゼを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.2％トリトンおよび2％のRNAse阻害剤）。各スライドのために、緩衝液400μlの（一次および二次抗体の200μlのための200μl）を用意する。
- 固定液を準備し、70％エタノールを使用するには、-20℃で保存。 RNA抽出収率の大幅な低下を避けるために最小限の組織固定処置を続ける。
注：また、-20℃で保存し、5％酢酸を補充した95％エタノール溶液を使用。 - 緩衝液中で一次抗体を希釈することによって一次抗体溶液を調製する。ドーパミン作動性ニューロンの標識のために、チロシンヒドロキシラーゼ（TH、ドーパミン産生のためのレート制限酵素）を標的とする抗体を使用しています。迅速なインキュベーション時間を補償するために、高濃度の抗体を使用する。 1:25希釈でTH抗体を使用してください。
注：1,000：通常の免疫蛍光プロトコルでは、この抗体は、1の希釈で一晩インキュベート強いシグナルを与える。このプロトコルでは、40倍以上concentrat使用されている短いインキュベーション時間のために編。このための方法に使用される高濃度の抗体を、非特異的標識化の増加を確認するために並行して、標準的な免疫染色を行う。 - 緩衝液中で二次抗体を希釈することによって二次抗体溶液を調製する。 100：1の濃度のビオチン化二次抗体を使用してください。
注：この例では、抗ウサギビオチン化抗体を使用していました。 - ビオチン化二次抗体の検出のためのアビジン - ビオチン複合体（ABC）溶液を調製する。 1の濃度の化合物Aと化合物Bを添加することによってABC溶液を作製：DEPC PBSで希釈した100は、2％のRNAse阻害剤を補充した。スライドに追加する前に、アビジン - ビオチン複合体の30分を準備します。
4.染色
- すぐに空気中にそれらをフリックで-80℃から一度に1つまたは2つのスライドを解凍（または送風機を使用してください）。疎水性とサラウンドのセクションバリアペンと、数秒間乾燥させます。
- -20℃でわずか5分間冷たい固定剤溶液中にスライドを入れてください。すぐに洗浄にDEPC PBS 6-8回スライドを浸し、その後固定液の過剰を削除するには、一度空気中の振る。
- DEPC PBSの過剰を削除するスライドをフリック。ステップを解凍スライドが5分を超えていないことを確認してください。
- クリーントレイに置きスライド（表面リボヌクレアーゼ除染液で前処理をRNアーゼの痕跡を除去するため）、室温で10分間、各スライド（ウサギ抗TH）に一次抗体溶液200μlを入れた。ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、DEPC PBSの過剰を削除するには、一度スライドをフリック。
- 室温で6分間各スライド上の二次抗体溶液200μlを入れてください。ディップはすぐに洗浄のためのDEPC PBS中で3回スライドし、DEPC PBSの過剰を削除するスライドをフリック。
- ABCソル200μlのを入れて室温で4分間各スライド上る。ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、過剰DEPC PBSを除去するためのスライドをフリック。
- DAB（3,3 'ジアミノベンジジン）ABC溶液中でのインキュベーションの4分の間に溶液を準備します。キット（DABペルオキシダーゼ基質キット）で提供される試薬を使用してください。提供される緩衝液の1滴、DAB溶液を1滴及びDEPC水2.5ミリリットルの30％H 2 O 2の1滴を混合する。反転させた溶液を混合。
- DAB溶液の196μLを取り、ちょうどスライドに拡散前のRNアーゼ阻害剤溶液4μlの（2％）を追加します。置きスライド（表面リボヌクレアーゼ除染液で前処理）クリーントレイに、スライド上のDAB溶液200μlを入れた。
注：DAB溶液は以内に1または2分を反応させる必要があります。 - ディップは、洗浄のためにDEPC PBS中ですばやく3回スライドし、無水エタノールで数秒間スライドを置く。空気中にそれらをフリックでスライドを乾燥（または送風機を使用してください）。<BRの/>注：スライドを将来の使用のために-80℃で保存またはLCMのために処理することができる。
5.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション
- 空気中にそれらをフリックですばやくスライドを解凍（または送風機を使用してください）。ステップを解凍スライドが5分を超えていないことを確認してください。
- LCMに進んでください。捕集管キャップに直面して試料側で顕微鏡下でスライドを置きます。サンプルのための最高の倍率を選択してください。目的の細胞を見てピントを調整します。
- 切削領域を定義し、レーザーで切断開始。 （RNA抽出キットから）の溶解緩衝液50μlで満たされた捕集管キャップで解剖細胞または組織片を収集します。 LCMのステップが30分を超えていないことを確認してください。
- RNA抽出キット（CF。材料のリスト）を用いて単離した細胞から全RNAを抽出します。製造業者のプロトコルに従ってください。
- 42℃で30分間に収集された細胞をインキュベート細胞を溶解。コンディショニングバッファー250μLを添加することにより、RNA精製カラムを事前調整する。ロード溶解細胞にエタノールを50μlの。前処理精製カラムに溶解した細胞を100μlをロードします。
- 室温で2分間16000×gでカラムを遠心。洗浄バッファーで二回カラムを洗浄。 RNaseフリー水の最小限の推奨容量（11μL）（それはバイオアナライザーを妨げる可能性として扱わDEPCではない）で溶出する。テスト品質に2μLにしてください。
注：すべてのソリューションおよび試薬キットで提供されている。
6. cDNA合成および定量的RT-PCR
- レーザーからの逆転写RNAサンプルを逆転写酵素およびオリゴ（dT）を用いて相補DNAにドーパミン作動性細胞を捕獲した。製造業者のプロトコル（CF。材料のリスト）に従ってください。
- 遺伝子特異的プライマーを用いて定量RT-PCR増幅のためのcDNA1μlのを使用してください。 PCR REAを設定定量的PCRのための一成分ホットスタート反応ミックス20μlの容量中ctions製造業者によって推奨される。三重で各反応を行う。
- ここに記載した実験のために、以下のプライマー対を使用します。GAPDH-F（5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 '）/ GAPDH-R（5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'）; RPL13A-F（5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 '）/ RPL13A-R（5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'）;のTh-F（5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 '）/ TH-R（5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'）; AADC-F（5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 '）/ AADC-R（5'- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3'）。
- 次の急速サイクリングパラメータを用いた定量的RT-PCR増幅を行う：95℃10秒95℃、60℃で10秒、72℃で10秒を45サイクル、続いて5分間。 determiする機器のデフォルト設定を使用して、融解曲線分析を実行NE均質産物形成。
- 組み込みソフトウェアを使用してデータを分析する。
- 先に説明したように14の相対的な発現レベルを得るために、2つの参照遺伝子GAPDHおよびRPL13Aの発現DAマーカー遺伝子ThおよびAADCの発現値を正規化。
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Representative Results
RNAの完全性を維持しながら、この迅速な免疫標識手順は、目的の細胞の可視化を可能にする。 図1は、RNA抽出前に組織調製のステップを示している。凍結切片の後、ドーパミン作動性ニューロンは、（ラベルニューロンが茶色で表示されます）チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いて標識される。実験的な質問に依存、単一細胞または関心の大きい領域は、LCM（ - E図1D）を用いて単離することができる。これは、分解されたRNAは、以下の分析の質にかなりの影響を与えるように、抽出されたRNAの品質を評価することが重要である。各サンプルは、このように定量化のためのマイクロ流体ベースのプラットフォームのバイオアナライザー上で処理され、RNAの完全性をチェックする。 図2は分解され、良質なサンプルの代表的なバイオアナライザーの結果を示している。デジタルゲル電気泳動図の両方がそれぞれのゾル中のRNアーゼ阻害剤を使用することの重要性を実証RNAを保護するution。 500ニューロンから抽出されたRNAの見込額は約1〜2 NGです。いくつかの組織切片から顕微解剖した細胞は、RNA量を増加させるために同一チューブ内にプールすることができる。
図1：迅速な免疫標識とレーザーキャプチャーマイクロダイセクション手順 。 （A）概略胚15.5日のマウスの脳の矢状図を示す図。黒い線は、中脳ドーパミンニューロンが位置する前後の領域の位置を示す。薄切片をクリオスタットを使用して作製された膜で被覆されたガラススライド上に収集される。免疫標識に続いて、中脳ドーパミン作動性ニューロンは、ブラウン（B）に表示されます。レーザー顕微解剖試料を、溶解緩衝液（C）を充填したチューブのキャップに回収される。関心領域（D中青線）または個々の細胞（E）は、チューブキャップに解剖し、検索することができる。スケールバー：（D）が250μm、（E）は50μm。
図2：バイオアナライザーチップキットを使用して、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション後に単離された全RNAサンプルの品質管理（A）バイオアナライザー（L、ラダーを用いて得られたデジタルシリカゲル; 1、RNアーゼ阻害剤（RNAsine）ない試料1、RNAsineとサンプル2。 ）。良い品質RNAの代表的な部分的に分解したRNA試料2（下のパネル）を示す（B）サンプル1（上パネル）の電気泳動図は、（RIN> 8が許容可能に良いです）が18S / 28S rRNAのピークがはっきりと見える。周囲の染色されていないtの間に2つのDAマーカー遺伝子（THとAADC）のための倍率変化で表される（C）正規化された相対発現レベル問題とDAドメイン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この方法の最も重要な点は、RNAの分解を防止しながら、目的の細胞を標識することにある。 RNA分解酵素は、水溶液中でアクティブであるため、インキュベーション時間を減少させることは、RNAの保全11,15を向上させます。使用されるすべてのソリューションは、RNアーゼを不活性化するDEPCで処理しなければならない。全ての材料及び表面がRNアーゼ汚染を防ぐための表面のRNAse汚染除去溶液で処理される必要がある。最後に、これらの条件において、全ての溶液中のRNAse阻害剤の添加は、分解からRNAを保存するのに有効である。抗体インキュベーションの間に印加される高塩条件の使用は、以前にRNA 9,10を維持するのに有効であることが示されている。しかしながら、この代替方法は、ロバストな抗体を用いて迅速に染色する制限されたままである。セクションの厚さは、他の臨界点を表しており、目的の細胞の大きさに依存する。ドーパミン作動性ニューロンの細胞体の平均サイズは約10であるから81 mは、我々は、細胞の一つの層を得るために、このセクションの太さを選択します。
FACSに比べてこの技術の主な制限は、顕微解剖することができ、細胞の数が少ないです。 RNA増幅キットを使用することは、RNA配列決定またはマイクロアレイ16を使用して、遺伝子プロファイリング実験のために必要とされる。しかし、定量RT-PCRは、増幅工程（ 図2c）なしで直接行うことができる。迅速な免疫標識プロトコルを用いて得られた染色の定性的評価は必ず実行する必要があり、通常の免疫標識プロトコルを使用して得られた染色とは異なるべきではありません。
今までは、レーザー捕捉実験は主にGFPなどのマーカーを発現するかまたはそのようなニッスル染色限り迅速学的着色を用いたトランスジェニック動物からの細胞集団を単離するために使用された。ここで紹介する方法は、免疫組織化学を使用して、目的の細胞を可視化することができます。単離および遺伝子式exprを取得細胞の化学的に特定された集団のessionプロファイルは現在17可能です。ここで説明するプロトコルは、任意の組織に適用され、適切な抗体と共に使用することができる。
脳において、ニューロンは、地理的な局在化によって分割することができるが、ほとんどの脳領域は、それらの化学的同一性に基づいて、異なる集団の様々含む。神経細胞の特定の種類の遺伝子発現パターンは、同じ脳の領域内の他の細胞型とは大きく異なることができる。生物学的または病理学的な状況に応じて、特定の細胞集団の遺伝子発現プロファイルはまた、かなり変更することができる。ここに記載した手順を用いて、それが新たな発見8,18,19への道を開く、これらの変化を監視することが可能である。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
