Summary
细胞在特定组织的一个子集的基因表达分析是一个重大的挑战。本文介绍了如何通过将快速免疫标记方法与激光捕获显微切割分离，从一个特定的细胞群高质量的总RNA。
Abstract
激光捕获显微切割（LCM）允许从薄的组织切片以高空间分辨率的特定细胞的分离。有效的LCM要求从异质组织精确识别的细胞亚群。对于LCM感兴趣细胞的识别通常是基于形态学标准或荧光蛋白记者。 LCM和快速的免疫标记的组合提供了可视化特定的细胞类型，并从周围组织分离它们的替代性和有效的手段。高质量的RNA随后可以从一个纯的细胞群中提取，并进一步处理用于下游应用，包括RNA测序，微阵列或QRT-PCR。这一方法已被预先执行，并且在几个出版物简要描述。本文的目的是要说明如何执行的细胞群体的快速免疫标记，同时保持RNA的完整性，以及如何分离使用LCM这些特定细胞。在此，我们举例说明D由免疫标记，并从1日龄的小鼠采集的多巴胺能细胞的脑组织在该多步骤过程。我们强调的是特别值得考虑的关键的关键步骤。此协议可适应各种组织和感兴趣的细胞。来自不同领域的研究人员将有可能从这种方法的演示中受益。
Introduction
大脑是由大量不同形成的复杂网络的不同神经元类型。这些神经元根据其形态，连接性和基因表达模式1组织在不同的组和子组。微阵列的发展，新一代测序，和定量RT-PCR技术提供给在不同的生物的上下文1,2-比较神经元群体的基因表达图谱的可能性。这些敏感分析需要的利益，同时保持RNA的完整性2-4细胞类型的精确鉴定和分离。荧光激活细胞分选（FACS）技术已被广泛地用于分离根据细胞表面标志物和/或形态的特定细胞类型。流式细胞仪需要一个细胞解离步骤之前进行排序，这导致空间分辨率5的完全丢失。许多神经元的亚群是彼此可分辨根据它们在第解剖学分布Ë大脑。施加薄的脑切片的激光捕获显微切割提供了用于细胞以高空间分辨率6-8的特定隔离的适当选项。 LCM的一个主要限制是需要确定基于形态学标准或荧光蛋白记者基因工程在动物模型中所关注的细胞。新技术的发展，以执行保存RNA的完整性，与LCM结合快速免疫标记方法，现在允许细胞亚群的隔离进行基因分析实验。
这一方法已被预先执行，并且在几个出版物1,9-13简单说明。在这里，我们证明了详细的程序通过组合快速免疫标记与LCM获得高品质的RNA的细胞的一个复杂的组织结构的特定子集。我们将展示如何执行关键的关键步骤，以获得最大的RNA恢复，避免RNA降解，因为它可能标志贴着地影响基因表达分析。
对于该协议的示范，从一个天大的小鼠中脑多巴胺能神经元的目标。多巴胺能神经元可以使用针对酪氨酸羟化酶（TH）抗体，对多巴胺合成的限速酶免疫标记。以下TH免疫染色，从个人或多巴胺能神经元的组然后可以使用LCM隔离。显微细胞被收集在裂解缓冲液，和RNA是使用RNA分离试剂盒提取。质量和提取RNA的量使用的是生物分析仪测量5。随后可以进行定量RT-PCR检测RNA测序，微阵列，或2,4,6-：使用基因表达的进一步分析。作为一个例子，一个两步QRT-PCR证明在激光捕获分离多巴胺能域。两个多巴胺能神经元标记基因的表达水平相对定量说明了这一协议的选择性。
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Protocol
注：该实验是按照加拿大指南实验动物的护理和使用进行，并经拉瓦尔大学动物保护委员会。
1.样品制备
注意：在这个例子中，我们使用鼠标大脑在出生后第1天。
- 使用低温麻醉在碎冰为3至4分钟为幼仔，然后在冰冷的L15培养基中尽可能快地解剖大脑。执行在2分钟内该步骤。
- 在嵌入模具（物资比照列表）转让解剖大脑和填充照顾以定向标本所需的位置冰冻组织包埋媒体。在-80℃下在液态氮和存储立即冻结标本。执行在30秒内这一步。
注：样品可以在不损害RNA的质量被储存几个月。
2.切片
- 治疗膜COA泰德玻片（ 比照材料清单）与RNA酶表面净化解决方案，以消除RNA酶的任何踪迹。在DEPC水冲洗的幻灯片，让他们干。可替代地，烘烤幻灯片过夜，在200℃。
- 在转让之前与表面去污RNA酶溶液清洗低温恒温器冷冻样品。设置低温恒温室的温度在-20℃和切片标本在10微米厚。收集组织切片上的膜涂层的幻灯片，让他们干10分钟染色前。可替代地，存储幻灯片在-80℃直至染色。
3.准备染色解决方案
- 准备所有解决方案只是在实验开始前，并使用在所有染色溶液RNA酶抑制剂（除洗涤溶液），以防止RNA降解。
- 制备缓冲溶液。使用在所有的解决方案同样的缓冲液（无RNA酶的磷酸盐缓冲盐水（PBS组成），补充1％的BSA，0.2％的Triton和2％RNA酶抑制剂）。对于每个幻灯片，准备400微升缓冲液（200微升用于初级和200微升的二次抗体）。
- 制备固定剂溶液：用70％的乙醇保持在-20℃。保持组织固定过程最少，以避免急剧减少，在RNA提取收率。
注意：可替换地，可使用补充的5％乙酸的95％的乙醇溶液保持在-20℃。 - 通过在缓冲溶液稀释的第一抗体制备第一抗体溶液。为多巴胺能神经元的标记，可使用靶向酪氨酸羟化酶（TH，速率限制酶对多巴胺生产）的抗体。使用高浓度的抗体，以补偿快速孵育时间。使用TH抗体在稀释1:25。
注：在正常免疫协议，该抗体给出的稀释度1孵育过夜，当强信号：1000。在这个协议中，它是用来40X更concentrat由于短的孵育时间编由于高浓度的抗体用于此方法中，为了检查非特异性标记的任何增加执行标准的免疫染色并联。 - 通过在缓冲溶液稀释的二级抗体制备二级抗体溶液。使用生物素化的第二抗体以1:1的浓度：100。
注意：在这个例子中，我们使用抗兔生物素化的抗体。 - 制备的抗生物素蛋白 - 生物素复合物（ABC）对生物素化的二级抗体的检测溶液。使ABC溶液通过将化合物A和化合物B以1:1的浓度：100稀释于DEPC PBS中补充有2％的RNA酶抑制剂。将其添加到幻灯片之前制备抗生物素蛋白 - 生物素复合物30分钟。
4.染色
- 通过快速轻弹它们在空气中解冻，在从-80时℃的一个或两个幻灯片（或使用鼓风机）构成。用疏水性的环绕部分屏障笔，让干燥的几秒钟。
- 把载玻片在冷的固定剂溶液不超过5分钟，在-20℃下。摇一次在空气中，以除去过量的固定剂溶液然后，迅速浸载玻片于DEPC PBS 6-8次，洗涤。
- 轻弹幻灯片以去除多余的DEPC PBS的。确保幻灯片除霜步骤不超过5分钟。
- 在一个干净的托盘处的幻灯片（预处理用表面RNA酶去污溶液，以消除RNA酶的任何迹线），并把200μl的初级抗体溶液的每个滑板（兔抗TH）上，在室温下10分钟。浸迅速滑动于DEPC PBS中3次，每次洗涤和轻弹载玻片一次以除去过量的DEPC PBS中。
- 把200μl的第二抗体溶液的每张幻灯片上为6分钟，在室温下进行。浸迅速滑动3倍于DEPC PBS中洗涤并轻弹载玻片以除去过量的DEPC PBS中。
- 把200微升的ABC的SOLU灰每张幻灯片在室温下4分钟上。浸迅速滑动于DEPC PBS中3次，每次洗涤和轻弹载玻片以除去过量的DEPC PBS中。
- 准备DAB（3,3'二氨基联苯胺）培养的ABC解的4分钟内解决。使用在试剂盒（DAB过氧化物酶底物试剂盒）提供的试剂。拌1滴提供缓冲液中，1滴DAB溶液和1滴30％的H 2 O 2中的DEPC水2.5毫升。通过反转混合溶液。
- 取196微升的DAB解决方案，只是在幻灯片上蔓延之前添加的RNA酶抑制剂的解决方案4微升（2％）。在一个干净的托盘（预处理表面RNA酶净化解决方案）的地方幻灯片，把200微升的DAB解决方案的幻灯片。
注：DAB的解决方案应该反应within1或2分钟。 - 浸迅速滑动于DEPC PBS中3次，每次洗涤和放幻灯片几秒钟的无水乙醇。通过轻弹它们在空气干燥的幻灯片（或使用鼓风机）。<BR />注：幻灯片可以储存在-80°C，以备将来使用或处理的LCM。
5.激光捕获显微切割
- 通过轻弹它们在空气中快速地解冻幻灯片（或使用鼓风机）构成。确保幻灯片除霜步骤不超过5分钟。
- 进到LCM。放置幻灯片与面向收集管帽的样本面，在显微镜下。选择适合样品的最佳放大倍率。调节焦距以查看感兴趣的细胞。
- 限定在切割区域，并开始用激光切割。收集解剖的细胞或组织片在收集管帽填充有50微升裂解缓冲液（从RNA提取试剂盒）。确保LCM的步骤不超过30分钟。
- 提取使用RNA提取试剂盒（ 比照物料清单）分离细胞的总RNA。按照制造商的协议。
- 在42℃孵育收集的细胞进行30分钟至裂解细胞。先决条件，加入250微升调理缓冲器的RNA纯化柱。负载50微升乙醇溶解的细胞。加载100微升裂解的细胞到一个预条件纯化塔。
- 离心柱在16000×g离心，在室温下2分钟。用水洗两次缓冲洗柱。洗脱在无RNA酶的水的最小推荐量（11微升）（未DEPC处理，因为它可能与生物分析器干扰）。保持2微升到测试质量。
注：所有的解决方案和试剂的试剂盒中提供。
6. cDNA合成和定量RT-PCR
- 反向转录使用逆转录酶和寡（dT）的RNA样品从激光捕获多巴胺能细胞分化成互补DNA。按照制造商的协议（ 比照材料清单）。
- 使用1微升cDNA的定量RT-PCR扩增与基因特异性引物。建立PCR意图在20μl体积与单组分热启动反应混合物用于定量PCR ctions如制造商推荐的。进行一式三份的每个反应中。
- 对于这里描述的实验中，使用以下引物对：GAPDH-F（5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG的AT-3'）/ GAPDH-R（5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'）; RPL13A-F（5'-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3'）/ RPL13A-R（5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3'）; TH-F（5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC-3'）/钍-R（5'-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3'）; AADC-F（5'-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3'）/ AADC-R（5'-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3'）。
- 使用以下的快速循环参数进行定量RT-PCR扩增：95℃下5分钟，随后10秒的45个循环95℃，10秒，在60℃，10秒72℃。使用仪器的默认设置determi进行熔解曲线分析NE同质产品的形成。
- 分析使用内置的软件中的数据。
- 正常化的DA标记基因的Th和AADC的表情值与这两个参考基因GAPDH和RPL13A的表达，以获得相对表达水平如前面14所描述。
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Representative Results
这种快速免疫标记过程允许同时保持RNA的完整性的关注的细胞可视化。 图1示出的RNA提取前组织制剂的步骤。 cryosectioning后，多巴胺能神经元使用针对酪氨酸羟化酶的抗体（标记的神经元出现在棕色）标记。根据实验问题，单个细胞或更大的感兴趣区域可以使用LCM被隔离（ 图1D - E）。它评估提取的RNA的质量，因为降解的RNA会对以下分析的质量相当大的影响是重要的。因此每个样品进行处理上的微流体的平台生物分析仪进行定量，并且检查RNA的完整性， 图2示出了退化和优质的样品的典型的生物分析仪的结果。这两个数字凝胶电泳和演示使用RNA酶抑制剂中的每个溶胶的重要性ution保护RNA。从500元中提取RNA的量预计约为1-2纳克。来自几个组织切片显微细胞可在同一试管中进行合并，以增加RNA的量。
图1：快速免疫标记和激光捕获显微切割的过程 。 （ 一 ）示意图显示了小鼠大脑在胚胎15.5天矢状视图。黑线表示前后区域的地方中脑多巴胺神经元位于的位置。薄片使用的是低温恒温器制成，并收集在膜上涂覆的载玻片。继免疫标记，中脑多巴胺能神经元是褐色（B）可见。激光显微切割样品被收集在管帽填充有裂解缓冲液（C）。感兴趣区域（蓝线D）或个别细胞（E）的可解剖并在管帽检索。标尺：（D）250微米，（E）为50μm。
图2：总RNA样品用生物分析仪的芯片药盒激光捕获显微切割后，分离的质量控制（A）与生物分析仪（L，梯得到的数字凝胶; 1，样品1无RNA酶抑制剂（RNAsine），样品2具有RNAsine。 ）。样品1（上图）示出部分降解RNA和样品2（下图）的典型的良好品质的RNA（B）的电泳（RIN>图8是可接受的良好），其中18S / 28S rRNA的峰是清晰可见。 （C）未染色周围的吨两个DA标记基因（TH和AADC）为代表的倍数变化相对标准化的表达水平问题和DA域。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这种方法的最关键的一点在于，同时防止RNA降解标记所关注的细胞。如RNA酶是活性的水溶液，减少温育时间提高的RNA保护11,15。所用的所有解决方案必须用DEPC灭活RNA酶处理。所有的材料和表面需要与表面RNA酶去污溶液，以防止RNA酶污染处理。最后，在这些条件下，在所有的溶液中加入RNA酶抑制剂是有效的，从而降低维护的RNA。在使用过程中抗体孵育施加高盐条件先前已经证明是有效的在维护核糖核酸9,10。然而，这种替代方法，使用强大的抗体仍然有限，以快速染色。各部分的厚度表示另一个临界点，并取决于所感兴趣的小区的大小。因为多巴胺能神经元的细胞体的平均尺寸为约1081，男，我们选择此款厚度获得一层细胞。
这种技术相比的FACS的主要限制是细胞可显微切割的数量低。使用RNA扩增试剂盒的需要使用RNA测序或微阵列16基因剖析实验。然而，定量RT-PCR法，可直接而不扩增步骤（ 图2c）进行。与快速免疫标记协议获得的染色质的评估应始终执行，不应使用正常的免疫标记协议获得的染色不同。
直到现在，激光捕获实验主要用于从转基因动物表达GFP类似的标记或使用快速组织色彩的，如尼氏染色分离细胞群体。这里介绍的方法允许使用免疫组化可视化感兴趣的细胞。隔离和获取基因EXPR化学鉴定细胞群体的分裂国家信息现在是可能的17。此处所描述的协议可以被应用到任何组织和任何合适的抗体使用。
在大脑中，神经元可以通过它们的地理定位来划分，但大多数的大脑区域包含各种基于它们的化学特性的不同亚群的。某些类型的神经元的基因表达模式可以从在同一脑区另一种细胞类型有很大不同。根据生物或病理情况下，一个特定细胞群体的基因表达图谱也可以改变很大。使用此处描述的方法，它可以监视这些变化，铺平了道路的新发现8,18,19。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
References
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