ההדמיה המקומית Ca Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jeffrey T. Lock¹, Kyle L. Ellefsen¹, Bret Settle¹, Ian Parker^1,2, Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

Abstract

Cytosolic Ca ^{2 +} יונים להסדיר היבטים רבים של פעילות סלולרית כמעט בכל סוגי תאים, שליטה תהליכים רחבה היקף כמו שעתוק הגנים, רגישות חשמל וחלוקה של תאים. הגיוון והסגוליות של Ca ^{2 +} איתות נובעים ממנגנונים שבאמצעותם Ca ^{2 +} אותות נוצרים לפעול על סולמות זמן ומרחב שונים, הנעים בין תנודות תא-רחב וגלים המתרחשים על פני תקופות של דקות לCa ^{2 +} microdomains החולף המקומי ^{(2 +} Ca פחזנית) אלפיות שנייה קיימא. התקדמות שחלה באחרונה באלקטרון כפול CCD מצלמות (EMCCD) כעת לאפשר להדמיה של ^{2 +} אותות Ca המקומיים עם רזולוציה מרחבית 128 x 128 פיקסלים בשיעורים של> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps). גישה זו היא מקבילה מאוד ומאפשרת ניטור סימולטני של מאות ערוצים או אתרי נשיפה בניסוי יחיד. (1 PE Gb בערך עם זאת, הכמויות עצומות של נתונים שנוצרודקות r) להבהיר זיהוי חזותי וניתוח של Ca ^{2 +} אירועים המקומיים מעשי. כאן אנו מתארים ומדגימים את ההליכים לרכישה, האיתור, וניתוח של ה- IP המקומי ₃ בתיווך Ca ^{2 +} אותות בתאי יונקים שלמים עמוסים ^{2 +} אינדיקטורים Ca באמצעות שתי עלית הקרינה רחב בתחום (WF) והשתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRF). יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם שפתח בתוך Python סביבת תוכנת הקוד הפתוח שממכן את זיהוי וניתוח של Ca ^{2 +} אותות המקומיים אלה. אלגוריתם localizes אתרים של Ca ^{2 +} שחרור עם רזולוציה תת-פיקסל; מאפשר סקירת משתמש של נתונים; ופלטי רצפים של אותות יחס הקרינה זמן יחד עם משרעת ונתונים הקינטית בשולחן Excel תואם.

Introduction

יוני סידן (Ca ^{2 +)} בכל מקום להסדיר במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כוללים ביטוי גנים, הפרשה ושינויים ארוכי טווח בפלסטיות הסינפטית ^1. אחת דרכים שבאמצעותו Ca ^{2 +} יכול לפעול באופן שונה היא באמצעות דפוסי מרחב ובזמן השונים של Ca ^{2 +} אותות תא יכול לייצר. לגבה דוגמא העולמיים בcytosolic התכווצות הדק [Ca ^{2 +]} ברקמת שריר חלק ² ואילו קטן יותר, גבהים חולפים מקומיים (Ca ^{2 +} microdomains המקומי) לעורר ביטוי גנים חיוני ללמידה וזיכרון ^3.

cytosolic חינם [Ca ^{2 +]} נשמר במנוחה ~ 100 ננומטר, אבל במהירות יכול לעלות לכמה מיקרו-טוחנת הבאות הזרם של Ca ^{2 +} לcytosol דרך Ca ^{2 +} תעלות יונים -permeable ממוקמות בקרום הפלזמה ועל ידי השחרור של Ca ^{2 +} משל תאיתtores. המעבדה שלנו מתמקדת בקולט אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (IP ₃ R), אשר מהווה ערוץ הפצת Ca ^{2 +} הממוקם בקרום reticulum endoplasmic (ER). על הכריכה של שני IP ₃ וCa ^{2 +} לcytosolic הפעלת אתרים של הקולטן, ערוץ R IP ₃ נפתח לשחרור Ca ^{2 +} מוחרם בתוך לומן ER. שחרורו של Ca ^{2 +} עשוי להישאר מוגבל מרחבית למקבץ קטן של IP ₃ R כדי ליצור microdomain cytosolic מקומי של Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} נשיפה ⁴⁾ או, בהתאם לקרבה של אשכולות הסמוכות של IP ₃ Rs, רשאי להפיץ בכל תא על ידי גיוס אתרי נשיפה מרובים באמצעות תהליך של Ca ^{2 +} -release Ca ^{2 +} -induced (CICR) ^5,6.

ההקדמה של צבעי המחוון ^{2 +} מולקולה קטנה ניאון Ca שפותחה על ידי רוג'ר ⁷ Tsien, בשילוב עם imagi מיקרוסקופיה המתקדמת ng טכניקות, יש להקל באופן משמעותי את ההבנה של Ca ^{2 +} איתות שלנו. התקדמות שחלה באחרונה מצלמות המשמשות למיקרוסקופיה בחברה מאפשרת הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים חולפים כמו פחזנית עם רזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. כיום מצלמות זמינות EMCCD לאפשר הדמיה עם 128 x 128 פיקסלים ב> 500 מסגרות לשנייה ^-1 (fps) והדור החדש של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימות מצלמות (CMOS) מספקות רזולוציה גבוהה יותר פיקסל, ומהירות אפילו מהר יותר על חשבון מעט גבוה יותר רמות רעש. בשיתוף עם מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות פנימית (TIRF) ניתן כיום לתמונה Ca ^{2 +} אחד אירועי ערוץ ^8,9. גישה זו מאפשרת להדמיה של מאות ערוצים / אירועים בו זמנית, תוך יצירת קבוצות גדולות נתונים (בערך 1Gb לדקה) ההופכים את העיבוד ידני, זיהוי חזותי וניתוח מעשי ולמקם את אחריות על הפיתוח של אלגוריתמים אוטומטיים.

s = "jove_content"> כאן, אנו מציגים נהלים ופרוטוקולים להדמית Ca ^{2 +} אותות מקומיים בתאי יונקים שלמים באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. בנוסף, אנו מראים אלגוריתם שפותח בפייתון סביבת הקוד הפתוח המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של ^{2 +} Ca אירועים המקומיים צילמו על ידי שני TIRF ומיקרוסקופיה עלית הקרינה שדה רחב קונבנציונלית (WF). למרות שאנו מתארים גישות אלה בהקשר של IP ₃ -generated Ca ^{2 +} אותות, הם ניתנים בקלות ללמוד שינויים מקומיים בcytosolic [Ca ^{2 +]} הנובעים ממגוון רחב של Ca ^{2 +} תעלות יונים -permeable ממוקמות באו המשטח קרום או אברונים תוך-תאיים ^8-10.

Protocol

אנו מציגים נהלים מפורטים להדמית Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית. ניתן להתאים נהלים אלה ^ל2+ אותות תאיים תמונת Ca בסוגי תאים רבים ^8-10.

1. הכנת תאים

1. תרבות התאים להיות צילמו על פי הוראות המופיעות באתר האינטרנט של הספק שלהם.
2. כמה ימים לפני ההדמיה, תאי קציר גדלו בבקבוק תרבות רקמות באמצעות 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין / EDTA (2-3 דקות). בעקבות ניתוק, להוסיף נפח שווה של תקשורת בתרבות כדי להשבית טריפסין.
3. לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרע תאים לתוך מנות הדמיה זכוכית תחתונה בצפיפות של 3-7 x 10 ⁴ תאים לכל צלחת. בחרו את תאים לניסויי הדמיה כאשר הם מגיעים למפגש 60% (2-3 ימים).

2. הכנת פתרונות וריאגנטים

1. הכן HEPES Ca ^{2 +} המכיל נאגרתמיסת מלח (Ca ^{2 +} -HBSS) מורכב מ( מ"מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 HEPES, ו -10 גלוקוז; pH = 7.4 בטמפרטורת חדר (RT) עם NaOH. הכן -HBSS Ca ^{2 +} ללא תוספת סוכר ובחנות ב 4 ° C; להוסיף גלוקוז לפתרון מייד לפני השימוש.
2. Solubilize צורות קרום-permeant של Ca ^{2 +} מחוון ניאון קאל-520 (1 מ"מ), ci-IP ₃ (200 מיקרומטר), וEGTA (100 מ"מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO) המכיל 20% F-127 pluronic. Aliquot ריאגנטים אלה לתוך צינורות Eppendorf וחנות, מוגנים מפני לחות והאור, ב -20 ° C.

3. תאי Loading עם ממברנה-permeant קאל-520, ci-IP ₃ וEGTA

1. הכן את "מאגר הטעינה" על ידי דילול פתרונות מניות של קרום-permeant קאל-520 וci-IP ₃ לריכוז סופי של 5 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר, בהתאמה, ב-HBSS Ca ^{2 +.}
2. לשאוב מ"קתקשורת וlture לשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca ^{2 +} -HBSS שלוש פעמים.
3. הסר Ca ^{2 +} -HBSS דגירה תאים במאגר טעינה במשך 60 דקות ב RT בחושך.
4. הסר מאגר טעינה ולשטוף תאים על ידי החלפת מדיה עם Ca ^{2 +} -HBSS שלוש פעמים.
   1. אם תרצה, בשלב זה, תאי עומס עם EGTA / AM על ידי דילול מניות הפתרון לריכוז סופי של 5 מיקרומטר Ca ^{2 +} -HBSS ולאחר מכן דגירה תאים במשך 30-60 דקות ב RT בחושך. לאחר דגירה זה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם -HBSS Ca ^{2 +} לפני שתמשיך לשלב 3.5.
5. דגירה תאים ב-HBSS Ca ^{2 +} למשך 30 דקות כדי לאפשר לדה-esterification של חומרים כימיים טעונים.
6. מייד לפני ההדמיה, להחליף -HBSS Ca ^{2 + 2 +} עם -HBSS "הטרי" Ca כדי להסיר כל צבע שאולי דלף לאמבטיה במהלך הדגירה הסופית.

4. Ca ^{2 +}

1. מקום טיפה קטנה של שמן טבילה על מטרת 100X APO TIRF (NA 1.49).
2. הר צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ ההפוך ולהביא את התאים אל מוקד באמצעות אור מועבר. חשוב כדי להבטיח את צלחת ההדמיה כדי למנוע תנועה במהלך הקלטה.
3. להאיר תאים עם לייזר 488 ננומטר כדי לרגש את קאל-520 ולאסוף הקרינה נפלטת (λ> 510 ננומטר) באמצעות מצלמה EMCCD במהירות גבוהה.
   הערה: חבילת התוכנה המפעילה את המיקרוסקופ מאפשרת למשתמש לתרגם עדשה מתמקדת המאפשרת את קרן הלייזר שהציגה גם בקצה הקיצוני של הצמצם חזרה האובייקטיבי (לעירור TIRF) או מרכזי יותר (לעירור "WF").
4. שימוש בתוכנת EMCCD, להפחית תחום ההדמיה מ512 x 512 פיקסלים מלאים על מנת לאסוף נתונים ברזולוציה של הזמן הדרוש כדי ללכוד Ca ^{2 +} אירועים מקומיים.
   הערה: לדוגמא, quad מרכזרכישה של 256 x 256 פיקסלים מאיצה את קצב הרכישה ל -66 fps. אפשר גם להגדיל עוד יותר את קצב הפריימים של המצלמה EMCCD 500 fps באמצעות פונקצית מצב יבול מבודדת.
5. להגדיר את התוכנה כדי להקליט באופן אוטומטי כמה שניות של פעילות בסיסית, לספק הבזק UV לתאים ולהמשיך להקליט עוד שניות 10-30.
   הערה: פלאש UV מועבר באמצעות מקור אור קסנון הקשת הציג דרך UV משקף מראה dichroic ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. המשך ועוצמת פלאש UV מותאם באופן אמפירי לעורר תדירות רצויה של Ca ^{2 +} אירועים מקומיים.
6. לשמור קבצים בתמונת ערימות לניתוח off-line.

5. ניתוח ^{2 +} תמונה האוטומטית Ca

הערה: ניתן להציג, תהליך ולנתח נתונים שנתפסו באמצעות הרבה חבילות תוכנה מסחריות. עם זאת, יש לנו פיתחנו אלגוריתם לאוטומציה זיהוי במהירותניתוח ד של Ca ^{2 +} אותות מקומיים. תיאור מפורט של מסנני מרחב ובזמן בשימוש באלגוריתם זה, ניתן למצוא דור של ΔF / F ₀ והזדהות / ניתוח שגרה ב ^-11. אלגוריתם זה פותח כדי לרוץ על Python פלטפורמת תוכנה בקוד הפתוח, וניתן להשיג, יחד עם מדגם נתוני ניסוי והוראות למשתמש מפורטים, על ידי המחבר המקביל בדואר אלקטרוני (ismith@uci.edu).

1. המרת קבצים ללהיות מיובא לתוך האלגוריתם אישית בכתב לפורמט קובץ .tiff רב המטוס.
2. אתר את התיקייה המכילה את אלגוריתם הניתוח ולחץ לחיצה כפולה על run.exe.
3. בחר את קובץ .tiff להיות מנותח.
4. בחר פרמטרים ניתוח בתיבת הדו-שיח הפתוחה. ראה איור 2 א לפרמטרים ברירת מחדל עבור נתוני המדגם.
5. לקבוע את הרמה השחורה יש לקזז מהערימה התמונה או על ידי הזזת הסמן לחלק משדה הראייה שעושה not מכיל תא (ראה איור 2) או על ידי הזנת רמה שחורה באמצעות הפקודה 'רמת צבע השחורה בהגדרה' ידני.
6. שים לב ארבעה חלונות במסך הבאים ניתוח על ידי התוכנה (איור 2C-F). C הוא תמונה בשחור-לבן של מנוחה הקרינה מהתאים להיות מנותחת. ריבועים לבנים על גבי תמונה זו הם מקומות אירוע, שנקבעו כעמדות centroid של פונקציות גאוס דו-ממדיות המותאמות לאירועים.
7. לחץ על כל מיקום אירוע או לחץ על מקשי סמן למחזור בין אירועים. על כך מופחת רקע, גאוס החליק שינויי יחס הקרינה (ΔF / F ₀₎ בכל אחד מהאתרים הללו העדכון בחלון ד
   הערה: אדום מודגש אירועים נחושים מקורן אתר מסוים ושלא מ'לדמם דרך "מפעילות המקומית לאתרים סמוכים. העקבות הכחולות התחתונות מציינת היכן אותות הקרינה באתר שנבחר חרגו מזיהויסף, ואילו הקו השחור מזהה אירועים שמקורם באתר מסוים ש( המקביל ל האדום מודגש אירועים).
8. לחץ על אדום מודגש אירוע לעדכן E חלון המציגה את האבולוציה הזמנית של האירוע, וF חלון המציג את הפרופיל המרחבי של האירוע בממוצע לכל מהלך הזמן שלה, יחד עם הפרופיל המרחבי של פונקצית גאוס המצויד.
9. באופן ידני לסקור את האירועים שזוהו כך שניתן לדחות ממצאים מניתוח. מחק אירועים כגון על ידי לחיצה ימנית האדום מודגש אירועים.
   הערה: בידיים שלנו, Ca ^{2 +} שטף דרך ערוצי IP ₃ R יחידים מעורר אותות עם ΔF / F ₀ על 0.11, כך שכל 'אירועים' זוהו קטנים יותר במידה ניכרת מזה צפויים להיות חיובי שגוי.
10. נתוני יצוא על ידי בחירה 'שמור ל- Excel' או לייצא נתונים על בסיס לכל תא על ידי ציור סביב התא של עניין ובחירה 'שמור CellR17 ;.
    הערה: הנתונים נשמרים באותה התיקייה כמו ערימת התמונה המקורית.

Representative Results

איור 1 א מציג תמונת WF של מנוחה הקרינה קאל-520 בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y האנושיים טעונים גם עם ci-IP _3. חשיפה של תאים אלה לבזק 100 UV msec לתמונה-שחרור i-IP ₃ עוררה Ca ^{2 +} פחזניות חולפות באתרים בדידים (שצוין על ידי העיגולים הלבנים באיור 1 א). עקבות הקרינה שנמדדו באתרים אלה הראו שלב עלייה מהיר הודות לפתחים חולפים של IP ₃ Rs, ולאחר מכן שלב הרבה יותר איטי נופל (איור 1 ו1C) כCa ^{2 +} מתפזרים לאט ממקום השחרור. אדום מודגש אירועים באיור 1 הם אותות ^{2 +} Ca שנקבעו על ידי האלגוריתם כי מקורו מהאתר שנבחר. אירועים מודגשים שאינם מייצגים את זיהום Ca ^{2 +} האותות לשדר מאתרים סמוכים באופן הדוק.

כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר של Ca המקומי 2 +. זה chelates Ca ^{2 +} יונים לשדר בין אתרי נשיפה ובכך מונע את הדור של Ca ^{2 +} גלים העולמיים שלערפל את המחקר של ^{2 +} Ca פחזנית המקומי שנוצרו על ידי אשכולות בודדים של IP ₃ Rs. יתר על כן, EGTA מאיץ את קריסתה של Ca ^{2 +} microdomain המקומי, אך, בשל קינטיקה מחייבת האיטית שלה, מינימאלי מדאיג Ca ^{2 +} חופשי המקומי ו מחייב את המחוון המהיר Ca ^{2 +} בתוך אשכול. ההשפעה נטו של EGTA היא "לחדד" רשומות הקרינה של עננים במרחב ובזמן, ללא ניכר פוחת משרעת שלהם. שיפור נוסף ברזולוציה מתעורר באמצעות TIRF להגביל עירור של קאל-520 fluorophores לגל הצר (<100 ננומטר) החלוף נוצר על ידי TIRF. הסכום של שתי הגישות הללו הוא טכניקה שיעילות מנטרת Ca ^{2 +} המיידי 2 + נוכחי) ולא נפרד דולפת של Ca ^{2 +} לאחר שהוא משתחרר דרך IP ₃ Rs ומפזר משם לאט מאתר השחרור וסופו של דבר מוחרם ^9. 1D איור מציג "טביעת הרגל" של TIRF תא SH-SY5Y כאשר קאל-520 fluorophores היו רק נרגשת במרחק צר לתוך התא מcoverglass / ממשק התמיסה המימי. מהיר מחייב של Ca ^{2 +} למחוון מהירות קאל-520 צבע בתוך כרכי cytosolic attoliter נוצרו על ידי תאורת TIRF, בשיתוף עם EGTA ל'סמרטוט 'עד diffusive Ca ^{2 +,} אותות הקרינה תשואות שמתחדדים בזמן והחלל ( איור 1E ו1F).

הניתוח של ערימות תמונה שצולם באופן זה הוא הקל מאוד באמצעות אלגוריתם מותאם אישית בכתב שפותח במעבדה שלנו בריצת Python פלטפורמת תוכנה בקוד הפתוח ¹¹. איור 2 א מציג את חלון הדו-שיח הפתיחה שבו המשתמש מזין פרמטרים שישמשו לזיהוי וניתוח בדיעבד של ערימות תמונה. בעקבות זאת, המשתמש יתבקש לבחור רמה שחורה שיורד מכל ערימת התמונה לאחר שפועל אלגוריתם זיהוי וניתוח תכנית איור 2C-F, בהתאמה, אתרי subcellular של שחרור המקומי Ca ^{2 +.;} פעילות באתרים נבחרים; אירועים בודדים על לוח זמנים מורחבים; ופרופילים המרחבי של אירועי נציג (ראו איור 2 אגדה לפרטים נוספים). לאחר בדיקת משתמש של אתרים שזוהו, ניתח נתונים לכל האירועים (ראה טבלה 1) ניתן לייצא על ידי בחירת הפונקציה 'שמור ל- Excel'.

עמוסים EGTA איור 3 מוצג נתונים הממחישים את שני השיפור ברזולוציה מושגת על ידי ההדמיה TIRF בתאים בהשוואה להדמית WF בתאים טעונים, וpower של האלגוריתם בזיהוי וניתוח Ca ^{2 +} אותות מקומיים. איור 3 א מציג אירוע מקומי נציג הדמיה על ידי WF בתא הטעון רק עם קאל-520 וci-IP _3. לשם השוואה, איור 3 ב מציג אירוע דומה אבל עכשיו צילמו על ידי מיקרוסקופ TIRF בתא טעון נוסף עם EGTA. עקבות על גבי באיור 3 ג ו3D, להמחיש מקבילות זמני (C) ומרחב (D) פרופילים של אירועים שנרשמו על ידי הקרינה WF ללא EGTA (שחור) ועל ידי מיקרוסקופ TIRF עם טעינת EGTA (אדום). איור 3E חלקות מתכוונים מדידות של אמפליטודות נשיפה , פעמים ריקבון, ורוחב מרחבי תחת שני תנאים אלה, נקבעו באמצעות האלגוריתם לנתח כ 44 (WF) ו -88 אירועים (TIRF).

איור 1: IP -evoked Ca ^{2 +} המקומי אותות בתאי SH-SY5Y עמוסים קאל-520 וci-IP ₃ צילמו בשדה רחב (דרך C) וTIRF (D דרך F) מיקרוסקופ. (א) תמונה בשחור לבן של מנוחה הקרינה קאל-520 שבמקומות אתר נשיפה מסומנים על ידי עיגולים לבנים; סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר עקבות. (B) להמחיש פחזניות עוררו בשלושה אתרים שונים, ממוספרים כמו ב(). אדום מודגש אירועים הם עננים זיהו כי מקורו מאתר מסוים. החץ מצביע על זמן של הבזק UV. (C) עקבות גבי של ^{2 +} Ca פחזנית נציג כמו אלה ב( B), מיושרים ומוצגים בקנה מידה מורחבת. תמונת בשחור הלבן TIRF "טביעת רגל" של המנוחה קאל-520 הקרינה בSH (D) תאי -SY5Y עמוסים ci-IP ₃ וEGTA. עיגולים לבנים מציינים מקורות אתר נשיפה. (E) (F) עקבות גבי של ^{2 +} Ca פחזנית נציג כמו אלה ב( E), מיושרים ומוצגים בקנה מידה מורחבת.

איור 2: ממשק משתמש של קוד מותאם אישית שנועד לזהות באופן אוטומטי ולנתח ^{2 +} אותות Ca מקומיים בתאי SH-SY5Y צילמו על ידי מיקרוסקופ TIRF () פתיחת תיבת הדו-שיח שבו פרמטרים זיהוי וניתוח הם נכנסו (B) המשתמש בוחר.. . אזור של התמונה שאינה מכילה תאים כדי להגדיר את הרמה השחורה שיורד מכל המסגרות בערימת התמונה (C - F). צילומי המסך של חלונות / ניתוח זיהוי הסופי (C) תמונה של המנוחה קאל-5 20 הקרינה עליהם במקומות שבי גבי Ca ^{2 +} ארעיים זוהו (ריבועים לבנים). המשתמש יכול לעבור בין אתרים על ידי הזזת העכבר מעל התמונה או לחיצה על מקשי הסמן. (ד) יחס הקרינה חלון מראה (ΔF / F ₀₎ עקבות באירוע שנבחר. אירועים מודגשים אדומים מזוהים שכהתגלו באתר שנבחר. הפס הכחול התחתון מצביע על אירועים שיעלו על הסף לזיהוי באתר זה; אירועים לא מסומנים אדום כבר מקומיים לאתר סמוך. לחיצה על הפס הכחול לוקחת את המשתמש לאתר שאירוע. לחיצה על אירוע אדום עם העכבר פותחת שני חלונות נוספים המציגים את האבולוציה הזמנית של האירוע בלוח זמנים מורחבים (E) ופרופילים מרחבית (F) של האירוע בממוצע לכל מהלך הזמן שלה (משמאל) יחד עם הפרופיל המרחבי של גאוס המצויד (מימין)."Target =" e.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: שיפור בנאמנות של זמן ומרחב של הדמיה נשיפת מושגת על ידי שימוש במיקרוסקופ TIRF בשיתוף עם טעינה תאית של EGTA (א) תמונת תמונה של עלים שנתפסו בזמן של המשרעת שיא, על גבי תמונת רקע של מנוחה הקרינה ל. להראות את קווי המתאר התא. התמונה הושגה על ידי מיקרוסקופ WF של תא לא עמוס EGTA. תמונת נשיפה היא pseudocolored, עם ^{2 +} רמות גבוהות יותר Ca כונה על ידי יותר ויותר צבעים "חמימים". (ב) מקבילה תמונה של עלים צילמו על ידי מיקרוסקופ TIRF בתא עמוס EGTA. עקבות (C), WF (שחור) או TIRF + EGTA (אדום), מראה את השינוי המקביל בקאל-520 fluorescencדואר לאורך הזמן ^ל2+ פחזנית Ca מוצג ב() ו- (ב) לעיל. עקבות הם מנורמלים לאותו המשרעת השיא ומיושר לזמן השיא שלהם כדי להקל על השוואה של קינטיקה שלהם. הסברים להמחיש מדידות של Ca ^{2 +} פרמטרים אירוע (משרעת וזמן נפילה) לכמת ב( E). עקבות (D), WF (שחור) או TIRF + EGTA (אדום), מראה את עוצמת הקרינה של קו לסרוק באמצעות Ca ^{2 +} פחזנית מוצג ב() ו- (B). סריקות קו מנורמלות לאמפליטודות שיאם, ומרוכזת. הביאור מציג מדידה של רוחב מלא במשרעת מקסימלי מחצית (FWHM), כלכמת ב( E). גרפים (E) בר מראים אמפליטודות ממוצעת שיא (למעלה), נופלים פעמים מ 80% עד 20% מהמשרעת שיא (באמצע), ורוחב מרחבית (FWHM) של פחזניות צילמו על ידי מיקרוסקופ WF בתאים ללא EGTA (ברים פתוחים) ועל ידי מיקרוסקופיה TIRF בתאים טעון EGTA (פסים אפורים). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM עם n של לפחות 37 פחזניותלWF ו -79 לTIRF. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

א	# קבוצה	מספר זהות אתר אירוע
B.	GroupX:	אומר מיקום x תת-פיקסל של כל האירועים באתר מסוים
ג	GroupY:	אומר מיקום y תת-פיקסל של כל האירועים באתר מסוים
ד	אירועי מס ':	מס 'אירועים המתרחשים באתר במהלך הניסוי.
E.	מקס Amp:	משרעת המרבית של אירוע באתר מסוים ש( ΔF / F 0)
פ	X:	לוקליזציה x תת-פיקסל של אירוע
ג '	Y:	י.ל. תת-פיקסלocalization של אירוע
H.	T_peak:	זמן שבו האירוע מגיע המשרעת שיא (במספר מסגרת)
I.	Amplitude:	המשרעת של כל האירועים שמקורם בכל אתר (ΔF / F 0)
ג '	Sigmax:	SD X פרופיל גאוס מצויד במהלך אירוע זמן (בפיקסלים)
ק	Sigmay:	SD Y של פרופיל גאוס מצויד במהלך אירוע זמן (בפיקסלים)
L.	זווית:	זווית של הציר של הפונקציה אליפטית וכתוצאה מכך של גאוס הארוך מצויד במהלך אירוע זמן
מ	R20:	זמן לעלות ל -20% של משרעת המקסימום (במסגרות)
נ '	R50:	זמן לעלות ל -50% ממשרעת המקסימום (במסגרות)
O.	R80:	זמן לעלותעד 80% ממשרעת המקסימום (במסגרות)
P.	R100:	זמן לעלות לשל משרעת מקסימום 100% (במסגרות)
ש	F80:	זמן ליפול עד 80% ממשרעת המקסימום (במסגרות)
ר '	F50:	זמן ליפול ל -50% ממשרעת המקסימום (במסגרות)
S.	F20:	זמן ליפול ל -20% של משרעת המקסימום (במסגרות)
ט	F0:	זמן לחזור לבסיס טרום אירוע (במסגרות)

טבלה 1: נתוני פלט מאלגוריתם.

Discussion

אנו מתארים כאן פרוטוקולי הדמיה Ca ^{2 +} אירועים מקומיים בתאי יונקים בתרבית באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים ניאון. יתר על כן, אנו מתארים אלגוריתם עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אוטומצית זיהוי וניתוח של נתונים שנרכשו. ההליך המתואר כאן לנצל את Ca ^{2 +} מחוון ניאון קאל-520, אך רבים Ca ^{2 +} צבעים רגישים אחרים כגון Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 ואורגון גרין BAPTA-1 לבצע מספיק טוב לתמונת Ca ^{2 +} microdomains. טיפול אינו צריך לנקוט כדי להבטיח שגרסות זיקה הגבוהה _(ד K של ~ 200-400 ננומטר) של אינדיקטורים אלה משמשות לתמונת Ca ^{2 +} microdomains המקומי, ואת תנאי הטעינה אופטימליים של מדדים אלה צריכים להיקבע באופן אמפירי ל כל סוג תא בחקירה. מעצם טבעם Ca ^{2 +} אינדיקטורים לאגד Ca ^{2 +} ובכך לפעול כCa ^{2 +} מאגרים; ריכוזי טעינה גבוהים יותר של אינדיקהיש לי tors הפוטנציאל להפריע לאותות ^{2 +} Ca מוקלטים ו / או עשוי להיות מוחרם לאברונים תוך-תאיים, אם כי תנאי ההעמסה המתוארים כאן הם נקודת התחלה טובה. בסך הכל, ההדמיה הפעילות של Ca ^{2 +} אירועים מקומיים היא פולשנית, שמירה על הארכיטקטורה המקומית של תא וגורמים cytosolic שעשוי להסדיר את הערוצים שבבסיס Ca ^{2 +} microdomains.

הפרוטוקול שאנו מתארים כאן להדמיה ברזולוציה גבוהה של ^{2 +} אותות המקומיים Ca באמצעות מיקרוסקופ TIRF יש המגבלה הברורה בכך שהוא מגביל את המדידות לאירועים שעולים מערוצי ^{2 +} Ca שוכבים בתוך שדה החלוף. עם זאת, זה אינו מוגבל רק לערוצים בקרום הפלזמה, ואנחנו מדגימים את תחולתו לערוצים כגון R IP ₃ באברונים תוך-תאיים שנמצא להיות ממוקמים קרוב לקרום הפלזמה ¹² מועדף אבלאחרת היה בלתי נגיש להקלטת אלקטרו פעילותם בסביבה הסלולרית המקומית. ההדמיה confocal תאפשר הדמיה של אותות שנוצרה עמוקה יותר אל תוך התא, אבל יש חסרונות בהשוואה להדמית TIRF שבעובי של הסעיף האופטי רחב יותר (~ 800 ננומטר לעומת 100-200 ננומטר) ומוגבל ברזולוציה זמנית על ידי הצורך כדי לסרוק את מקום confocal (ים). בגלל הדמיה נעשית במצב עלית הקרינה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, הקלטות אופטיות של Ca ^{2 +} אותות ערוץ יחיד ומקומיים יכולות בקלות להיות משולבות עם הקלטת תיקון מהדק אלקטרו בו זמנית.

בהבעת הקרינה Ca ^{2 +} אותות כיחס של מנוחה הקרינה (ΔF / F ₀₎ אפשר להשיג מידה היחסית טובה של אמפליטודות אות. עם זאת, אנו מזהירים כיול זה של, שינויי הקרינה חולפים מקומיים במונחים של Ca ^{2 +} ריכוזים מוחלטים הואלא מתאים. הדרגתיים של מחוון -bound [Ca ^{2 +]} וCa ^{2 +} חופשי סביב ערוץ שחרור Ca ^{2 +} או מקבץ של ערוצים צר יותר מיכול להיפתר על ידי מיקרוסקופיה אופטית ובכך להיות מטושטשת על ידי פונקצית נקודת ההתפשטות של מיקרוסקופ. יתר על כן, [Ca ^{2 +]} המקומי בסביבתו הקרובה של נקבובית הערוץ ישתנה בטווח זמן המיקרו כערוץ נפתח ונסגר. לפיכך, אותות הקרינה לספק ייצוג מטושטש בלבד (במרחב ובזמן) של nanodomain Ca ^{2 +} האמיתי שבבסיס Ca ^{2 +} אותות מקומיים ^13.

האלגוריתם שתואר כאן מאוד מקל על הניתוח של אותות ^{2 +} Ca המקומיים מהדמיה מבוססת מצלמה. על ידי מיכון זיהוי וניתוח לא רק הטיה משתמש בוטלה, אבל ג'יגה של ערימות תמונה יכולה להיות מעובד תוך דקות בצורה מקבילה מאוד, מניב שני נתונים של זמן ומרחב מאירועים רבים מתא בודד בו-זמנית.

למרות נתונים בכתב היד הזה מוצגים בהקשר של IP ₃ בתיווך Ca ^{2 +} אותות, הגישות שתוארו ניתן להרחיב בקלות להדמית שינויים מקומיים בcytosolic [Ca ^{2 +]} נובע ממספר רב של סוגים שני messenger- ligand-, וCa ^{2 +} תעלות יונים -permeable מתח מגודרת. טבע התפוקה הגבוהה של האלגוריתם לזיהוי וניתוח אוטומטיים של Ca ^{2 +} אירועים מקומיים צריך גם להוכיח להיות שימושי ביותר עבור ההדמיה Ca ^{2 +} channelopathies במצבי מחלה באמצעות מודלים תא בודד כגון ההפרעה בספקטרום המחלה ואוטיזם אלצהיימר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C