Abstract
عصاري خلوي كا 2+ أيونات تنظم جوانب عديدة من النشاط الخلوي في جميع أنواع الخلايا تقريبا، والعمليات كما واسع النطاق كما النسخ الجيني، استثارة الكهربائية وتكاثر الخلايا السيطرة. تنوع وخصوصية الكالسيوم 2+ إشارات مستمد من الآليات التي يتم إنشاؤها الكالسيوم 2+ إشارات للعمل على نطاقات زمنية ومكانية مختلفة، بدءا من التذبذبات على مستوى الخلية وموجات تحدث خلال فترات دقيقة لمحلية عابرة الكالسيوم 2+ microdomains (الكالسيوم 2+ نفث) ميلي ثانية دائمة. تضاعفت التطورات الحديثة في الإلكترون CCD (EMCCD) الكاميرات تسمح الآن للتصوير من الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات مع قرار المكاني 128 × 128 بكسل وفقا لأسعار> 500 لقطة في الثانية -1 (إطارا في الثانية). هذا النهج هو مواز للغاية ويمكن رصد في وقت واحد من مئات القنوات أو المواقع نفخة في تجربة واحدة. ومع ذلك، فإن كميات هائلة من البيانات ولدت (حوالي 1 غيغابايت بيص دقيقة) تجعل التعرف البصري وتحليل الكالسيوم المحلي 2+ الأحداث عملي. نحن هنا وصف وشرح إجراءات الاستحواذ، والكشف، وتحليل IP المحلي 3 بوساطة الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة محملة الكالسيوم 2+ المؤشرات باستخدام كل واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) والانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية وضعت داخل المصدر المفتوح البرمجيات بيثون البيئة بأتمتة تحديد وتحليل هذه الكالسيوم 2+ إشارات المحلية. الخوارزمية يموضع مواقع الكالسيوم 2+ الإفراج لقرار الفرعي بكسل. يسمح للمستخدم باستعراض البيانات؛ والنواتج متواليات وقت إشارات نسبة مضان جنبا إلى جنب مع السعة والبيانات الحركية في جدول Excel متوافق مع.
Introduction
أيونات الكالسيوم (الكالسيوم 2+) تنظيم بتواجد مطلق مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، إفراز وتغييرات طويلة الأمد في اللدونة متشابك 1. طريقة واحدة يمكن من خلالها الكالسيوم 2+ يمكن أن تعمل بطريقة مختلفة يتم من خلال أنماط المكانية والزمانية مختلفة من الكالسيوم 2+ اشارات يمكن خلية تولد. على سبيل المثال الارتفاعات العالمية في عصاري خلوي [كا 2+] انكماش الزناد في أنسجة العضلات الملساء 2 في حين أن أصغر، ارتفاعات عابرة مترجم (المحلية الكالسيوم 2+ microdomains) تحفيز التعبير الجيني أساسي للتعلم والذاكرة 3.
عصاري خلوي مجانا [كا 2+] هو الحفاظ على ~ 100 نانومتر في بقية، ولكن يمكن أن يرتفع بسرعة لعدة الجزئي الضرس في أعقاب تدفق الكالسيوم 2+ في العصارة الخلوية من خلال الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable الموجود في غشاء البلازما والتي تحرير الكالسيوم 2+ من الصورة داخل الخلاياTORES. يركز مختبرنا على إينوزيتول 1،4،5-trisphosphate مستقبلات (IP 3 R)، الذي يشكل الكالسيوم 2+ قناة الإفراج الموجود في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER). على ملزمة لكلا IP 3 والكالسيوم 2+ إلى عصاري خلوي تفعيل مواقع مستقبلات، تفتح R قناة IP 3 لتحرير الكالسيوم 2+ المحتبسة داخل التجويف ER. الافراج عن الكالسيوم 2+ قد تبقى مقيدة مكانيا لمجموعة صغيرة من IP 3 روبية لتوليد microdomain عصاري خلوي المحلية من الكالسيوم 2+ (كاليفورنيا 2+ نفخة 4) أو، اعتمادا على قربها من التجمعات المجاورة IP 3 روبية، قد نشر عبر خلية من خلال تجنيد مواقع نفخة متعددة من خلال عملية الكالسيوم 2+ يسببها الكالسيوم 2+ -release (CICR) 5،6.
إدخال الأصباغ مؤشر جزيء صغير الفلورسنت الكالسيوم 2+ التي وضعتها روجر تسين 7، إلى جانب متقدمة المجهري imagi تقنيات نانوغرام، سهلت بشكل كبير فهمنا من الكالسيوم 2+ الإشارات. التطورات الحديثة في الكاميرات المستخدمة للفحص المجهري يسمح الآن لتصوير عابرة المحلية الكالسيوم 2+ أحداث مثل نفث مع القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. المتاحة حاليا الكاميرات EMCCD تمكن التصوير مع 128 × 128 بكسل في> 500 لقطة في الثانية -1 (FPS) والجيل الجديد من مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات توفر (CMOS) كاميرات دقة أعلى بكسل، وحتى سرعة أكبر على حساب ارتفاع طفيف مستويات الضوضاء. بالتعاون مع الانعكاس الكلي الداخلي (TIRF) المجهري أصبح من الممكن الآن أن صورة واحدة الكالسيوم 2+ أحداث قناة 8،9. هذا النهج يتيح للتصوير المئات من القنوات / الأحداث في وقت واحد، في حين توليد مجموعات البيانات الكبيرة (حوالي 1GB لكل دقيقة) التي تجعل المعالجة اليدوية، وتحديد البصرية والتحليل غير عملي ووضع المسؤولية على عاتق تطوير خوارزميات الآلي.
الصورة = "jove_content"> هنا، نقدم إجراءات وبروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. علينا أن نظهر المزيد من خوارزمية وضعت في بيئة بيثون المصدر المفتوح بأتمتة تحديد وتحليل المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث المصورة من قبل كل من TIRF والتقليدية مجالا واسعا برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) المجهري. على الرغم من أن وصفنا هذه النهج في سياق IP 3 -generated الكالسيوم 2+ إشارات، فهي قابلة بسهولة لدراسة التغيرات المحلية في عصاري خلوي [كا 2+] المنبثقة عن مجموعة متنوعة من الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable تقع في أي سطح غشاء أو عضيات داخل الخلايا 8-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
نقدم إجراءات تفصيلية لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في العصبية البشري خلايا SH-SY5Y. ويمكن تكييف هذه الإجراءات لصورة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ إشارات في العديد من أنواع الخلايا 8-10.
1. إعداد الخلايا
- ثقافة الخلايا ليتم تصويرها وفقا لتعليمات المدرجة على المورد الخاصة بهم على شبكة الإنترنت.
- بضعة أيام قبل التصوير، وخلايا الحصاد نمت في قارورة زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من 0.25٪ التربسين / EDTA (2-3 دقيقة). وبعد انفصال، إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام ثقافة لإبطال نشاط التربسين.
- إجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور الخلايا في أطباق التصوير أسفل الزجاج في كثافة 3-7 × 10 4 خلايا في طبق. حدد الخلايا للتجارب التصوير عندما تصل إلى 60٪ التقاء (2-3 أيام).
2. إعداد حلول والكواشف
- إعداد الكالسيوم 2+ المحتوية HEPES مخزنةمحلول الملح (كاليفورنيا 2+ -HBSS) تتكون من (مم): 135 كلوريد الصوديوم، و 5.4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 10 HEPES، و 10 الجلوكوز. الرقم الهيدروجيني = 7.4 في درجة حرارة الغرفة (RT) مع هيدروكسيد الصوديوم. إعداد الكالسيوم 2+ -HBSS بدون إضافة السكر وتخزينها في 4 ° C. إضافة الجلوكوز في حل مباشرة قبل الاستعمال.
- ذوبان أشكال غشاء نفيذ من الفلورسنت الكالسيوم 2+ مؤشر كال-520 (1 ملم)، CI-IP 3 (200 ميكرومتر)، وEGTA (100 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) تحتوي على 20٪ pluronic F-127. قسامة هذه الكواشف في أنابيب إيبندورف وتخزينها، ومحمية من الرطوبة والضوء، في -20 ° C.
3. تحميل الخلايا مع غشاء نفيذ كال-520، CI-IP 3 و EGTA
- إعداد "العازلة تحميل" عن طريق تمييع الحلول الأسهم من غشاء نفيذ كال-520 و CI-IP 3 إلى تركيز النهائي من 5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر، على التوالي، في كا 2+ -HBSS.
- نضح مكعبوسائل الإعلام lture وشطف الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع الكالسيوم 2+ -HBSS ثلاث مرات.
- إزالة الكالسيوم 2+ -HBSS واحتضان الخلايا في العازلة تحميل لمدة 60 دقيقة في RT في الظلام.
- إزالة العازلة تحميل وشطف الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع الكالسيوم 2+ -HBSS ثلاث مرات.
- إذا رغبت في ذلك، في هذه الخطوة، خلايا الحمل مع EGTA / AM عن طريق تمييع الحل الأسهم إلى التركيز النهائي من 5 ميكرومتر في كا 2+ -HBSS ثم احتضان الخلايا لمدة 30-60 دقيقة في RT في الظلام. وبعد هذه الحضانة، وشطف خلايا ثلاث مرات مع الكالسيوم 2+ -HBSS قبل الانتقال إلى الخطوة 3.5.
- احتضان خلايا في كا 2+ -HBSS لمدة 30 دقيقة للسماح دي الأسترة من الكواشف المحملة.
- مباشرة قبل التصوير، ويحل محل الكالسيوم 2+ -HBSS مع "جديدة" كا 2+ -HBSS من أجل إزالة أي صبغة يمكن أن تكون قد تسربت إلى الحمام أثناء الحضانة النهائية.
4. الكالسيوم 2+
- وضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على الهدف 100X APO TIRF (NA 1.49).
- تركيب صحن التصوير على مسرح المجهر المقلوب وجعل الخلايا في التركيز باستخدام الضوء المرسل. من المهم لتأمين طبق التصوير لمنع الحركة أثناء التسجيل.
- تضيء الخلايا مع ليزر 488 نانومتر من أجل إثارة كال-520 وجمع مضان المنبعثة (λ> 510 نانومتر) باستخدام كاميرا EMCCD عالية السرعة.
ملاحظة: حزمة البرامج التي تعمل المجهر تسمح للمستخدم لترجمة عدسة التركيز السماح شعاع الليزر ليتم إدخال إما على حافة القصوى من الفتحة الخلفية الموضوعية (لTIRF الإثارة) أو أكثر مركزيا (ل"WF" الإثارة). - باستخدام برنامج EMCCD، والحد من مجال التصوير من كامل 512 × 512 بكسل من أجل جمع البيانات على قرار الزمني اللازم لالتقاط المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث.
ملاحظة: على سبيل المثال، رباعية مركزيةالحصول على 256 × 256 بكسل بسرعة تصل نسبة الاستحواذ إلى 66 إطارا في الثانية. ومن الممكن أيضا لزيادة معدل الإطار الكاميرا EMCCD إلى 500 إطارا في الثانية باستخدام وظيفة وضع المحاصيل المعزولة. - تكوين برنامج لتسجيل تلقائيا بضع ثوان من النشاط الأساسي، وتقديم ومضة الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا وتستمر لمدة 10-30 ثانية تسجيل آخر.
ملاحظة: يتم تسليم وميض الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصدر ضوء قوس زينون قدم من خلال الأشعة فوق البنفسجية تعكس مرآة مزدوج اللون في ميناء الخلفي للالمجهر. يتم تعديل مدة وشدة فلاش للأشعة فوق البنفسجية تجريبيا لاستحضار تردد المطلوب من الكالسيوم المحلية 2+ الأحداث. - حفظ الملفات كما مداخن صورة للتحليل خارج الخط.
5. الكالسيوم الآلي تحليل 2+ صورة
ملاحظة: من الممكن لعرض ومعالجة وتحليل البيانات التي تم التقاطها باستخدام العديد من حزم البرامج التجارية. ومع ذلك، وضعنا خوارزمية لأتمتة بسرعة لتحديدتحليل د المحلية من الكالسيوم 2+ الإشارات. وصف مفصل للمرشحات المكانية والزمنية المستخدمة في هذه الخوارزمية، جيل من ΔF / F 0 وتحديد / تحليل الروتينية يمكن العثور عليها في 11. وقد تم تطوير هذه الخوارزمية لتشغيل على المصدر المفتوح منصة برمجيات بيثون، ويمكن الحصول عليها، جنبا إلى جنب مع البيانات التجريبية عينة وإرشادات تفصيلية المستخدم، من قبل المؤلف المقابل بالبريد الإلكتروني (ismith@uci.edu).
- تحويل الملفات المراد استيرادها إلى خوارزمية مكتوبة مخصصة لتنسيق الملف ومتعددة طائرة .tiff.
- حدد موقع المجلد الذي يحتوي على خوارزمية تحليل وانقر نقرا مزدوجا فوق run.exe.
- حدد الملف .tiff لتحليلها.
- اختيار المعلمات التحليل في مربع الحوار المفتوح. انظر الشكل 2A للالمعلمات الافتراضية للبيانات العينة.
- تحديد مستوى الأسود على أن يعوض من الصورة كومة إما عن طريق تحريك المؤشر إلى جزء من مجال الرؤية التي لا نبعد التمديد تحتوي على الخلية (انظر الشكل 2B) أو عن طريق الدخول على مستوى الأسود باستخدام 'تعيين مستوى الأسود' موجه يدويا.
- مراقبة أربع نوافذ على الشاشة التالية تحليل من قبل البرنامج (الشكل 2C-F). C هي صورة أحادية اللون من يستريح مضان من الخلايا التي يجري تحليلها. المربعات البيضاء فرضه على هذه الصورة هي مواقع الحدث، كما تحدد المواقف الوسطى من وظائف جاوس ثنائية الأبعاد تركيبها على الأحداث.
- انقر على كل موقع الحدث أو اضغط على مفاتيح المؤشر لدورة بين الأحداث. على القيام بذلك للطرح الخلفية، ممهدة التمويه التغييرات نسبة مضان (ΔF / F 0) في كل من هذه المواقع التحديث في نافذة D.
ملاحظة: أبرز الأحداث الأحمر مصممة على أن تنشأ من موقع معين وليس من "ينزف من خلال" من النشاط المترجمة إلى المواقع المجاورة. يشير التتبع الأزرق السفلي حيث إشارة مضان في الموقع المختار تجاوزت الكشفالعتبة، في حين يحدد خط أسود الأحداث القادمة من هذا الموقع بالذات (الموافق الحمراء أبرز الأحداث). - انقر على اللون الأحمر أبرز حدث لتحديث نافذة E الذي يعرض التطور الزمني لهذا الحدث، ونافذة F الذي يعرض الملف الشخصي المكاني للحدث على مدى متوسط الحال وقتها، جنبا إلى جنب مع الشخصية المكاني وظيفة جاوس المجهزة.
- مراجعة الأحداث التي تم تحديدها بحيث يمكن رفض القطع الأثرية من تحليل يدويا. حذف مثل هذه الأحداث من خلال النقر الحق الحمراء أبرز الأحداث.
ملاحظة: في أيدينا، كاليفورنيا 2+ تدفق من خلال قنوات IP 3 R واحدة تثير إشارات مع ΔF / F 0 حول 0.11، لذلك من المحتمل أن تكون ايجابيات كاذبة أي "الاحداث" الكشف عن أصغر بشكل ملحوظ من هذا. - تصدير البيانات عن طريق اختيار 'حفظ إلى Excel "أو تصدير البيانات على أساس لكل خلية عن طريق رسم حول الخلية من الاهتمام واختيار" حفظ CellR17 ؛.
يتم حفظ البيانات إلى نفس المجلد مثل صورة كومة الأصلي: ملاحظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1A يظهر صورة WF من الراحة كال-520 مضان في الخلايا العصبية SH-SY5Y الإنسان أيضا محملة CI-IP 3. تعرض هذه الخلايا إلى ومضة 100 مللي ثانية الأشعة فوق البنفسجية إلى الصورة الإفراج ط-IP 3 أثارت عابرة الكالسيوم 2+ نفث في مواقع منفصلة (لاحظ الدوائر البيضاء في الشكل 1A). وأظهرت آثار مضان تقاس في هذه المواقع مرحلة ارتفاع السريعة بسبب الفتحات عابرة للIP 3 روبية، تليها طور السقوط أبطأ بكثير (1B الشكل و1C)، والكالسيوم 2+ تنتشر ببطء بعيدا عن موقع الإطلاق. سلط الضوء الأحمر الأحداث في الشكل 1B هي إشارات الكالسيوم 2+ التي تم تحديدها من قبل الخوارزمية قد نشأت من الموقع المختار. أحداث غير أبرز-تمثل تلويث الكالسيوم 2+ إشارات نشرها من المواقع المجاورة عن كثب.
لتحقيق دقة عالية التصوير من الكالسيوم المحلي
ومما يسهل تحليل مداخن الصورة التي تم التقاطها في هذه الطريقة إلى حد كبير من خلال خوارزمية مخصصة مكتوبة وضعت في مختبرنا قيد التشغيل على المصدر المفتوح منصة برمجيات بيثون 11ويبين الشكل 2A نافذة الحوار فتح التي يقوم المستخدم بإدخال المعلمات ليتم استخدامها لتحديد وتحليل لاحقة من مداخن صورة. وفي أعقاب ذلك، تتم مطالبة المستخدم لتحديد مستوى الأسود أن تطرح من كامل الصورة كومة بعد ذلك تحديد وتحليل أشواط خوارزمية الشكل 2C-F المعرض، على التوالي، والمواقع التحت خلوية من الكالسيوم المحلي الإفراج 2+؛ النشاط في مواقع مختارة؛ أحداث فردية على جدول زمني موسع. وملامح المكانية للأحداث تمثيلية (انظر الشكل 2 أسطورة لمزيد من التفاصيل). وبعد استعراض المستخدم من المواقع التي تم تحديدها، بتحليل بيانات لجميع المناسبات (انظر الجدول 1) يمكن تصديرها عن طريق اختيار وظيفة "وفروا إلى Excel.
الشكل 3 يعرض البيانات التي توضح كلا من التحسن في القرار TIRF التصوير المحرز في خلايا EGTA محملة بالمقارنة مع WF التصوير في الخلايا المفرغة، وصOWER من الخوارزمية في تحديد وتحليل المحلية الكالسيوم 2+ الإشارات. ويبين الشكل 3A حدث محلي تمثيلي تصويرها من قبل WF في زنزانة تحميل فقط مع كال-520 و CI-IP 3. وعلى سبيل المقارنة، يبين الشكل 3B حدث مماثل ولكن تصويرها الآن TIRF المجهري في زنزانة أخرى محملة EGTA. آثار فرضه في الشكل 3C و 3D، توضح المقابلة الزمني (C) والمكاني (D) لمحات من الأحداث التي سجلتها WF مضان دون EGTA (أسود) وTIRF المجهري مع EGTA تحميل (الحمراء). الشكل 3E المؤامرات يعني قياسات سعة نفخة ، الاضمحلال مرات، وعرض المكاني في ظل هذه الظروف اثنين، وتحديد باستخدام خوارزمية لتحليل ما يقرب من 44 (WF) و 88 (TIRF) الأحداث.
الشكل 1: IP
الشكل 2: واجهة المستخدم التعليمات البرمجية المخصصة مصممة لتحديد تلقائيا وتحليل الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات في الخلايا SH-SY5Y تصويرها من قبل TIRF المجهري (A) مربع الحوار حيث يتم إدخال المعلمات تحديد وتحليل فتح (ب) يحدد المستخدم. . المنطقة من الصورة التي لا تحتوي على خلايا لتحديد مستوى الأسود الذي يتم طرح من جميع الأطر في الصورة كومة (C - F). قطات من النوافذ التحليل النهائي / تعريف (C) صورة يستريح كال-5 يتم فرضه 20 مضان الذي المواقع التي تم تحديدها الكالسيوم 2+ العابرين (المربعات البيضاء). يمكن للمستخدم دورة بين المواقع عن طريق تحريك الماوس فوق الصورة أو الضغط على مفاتيح المؤشر. (D) نافذة تظهر نسبة مضان (ΔF / F 0) أثر على الحدث المحدد. ويتم تحديد الأحداث الحمراء يسلط الضوء عليها بعد أن نشأت في الموقع المحدد. ويشير الشريط الأزرق السفلي الأحداث التي تتجاوز عتبة الكشف في ذلك الموقع؛ تم المترجمة الأحداث لا سلط الضوء الأحمر إلى موقع مجاور. النقر على شريط أزرق يأخذ المستخدم إلى هذا الموقع الحدث. النقر على الحدث الأحمر مع الماوس يفتح نافذتين مزيد تبين التطور الزمني للحدث على الجدول الزمني الموسعة (E) وملامح المكانية (F) من متوسط الحدث على مدى بالطبع وقتها (يسار) مع الشخصية المكاني لل والتمويه المجهزة (يمين).e.jpg من "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحسين الإخلاص الزمانية والمكانية من التصوير نفخة عن طريق استخدام TIRF المجهري بالتزامن مع تحميل داخل الخلايا EGTA حققت (A) صورة لقطة من نفخة القبض في وقت السعة الذروة، وفرضه على صورة خلفية يستريح مضان ل. عرض مخطط الخلية. تم الحصول على صورة عن طريق WF المجهري للخلية لا محملة EGTA. وpseudocolored الصورة نفخة، مع ارتفاع مستويات الكالسيوم 2+ الرمز بواسطة متزايد الألوان "الحارة". (B) الموافق صورة نفخة تصويرها من قبل TIRF المجهري في زنزانة محملة EGTA. (C) آثار، WF (أسود) أو TIRF + EGTA (الحمراء)، وتبين التغير في المقابلة كال-520 fluorescencه مع مرور الوقت لالكالسيوم 2+ نفث هو مبين في (A) و (B) أعلاه. آثار هي تطبيع لنفس السعة الذروة والانحياز إلى وقت الذروة لتسهيل المقارنة بين حركية بهم. وتوضح الشروح قياسات من الكالسيوم 2+ المعلمات الحدث (السعة وتقع الوقت) كميا في (E). (D) آثار، WF (أسود) أو TIRF + EGTA (الحمراء)، وتظهر شدة مضان من خط المسح الضوئي من خلال كا 2 + نفث هو مبين في (A) و (B). وتطبيع بمسح الخط لسعة ذروتها، وتركزت. ويبين الشرح قياس العرض الكامل بنصف السعة القصوى (FWHM)، وكميا في (E). الرسوم البيانية (E) بار تظهر سعة الذروة متوسط (أعلى)، وتندرج مرات من 80٪ إلى 20٪ من ذروة السعة (وسط)، وعرض المكاني (FWHM) من نفث تصويرها من قبل WF المجهري في الخلايا دون EGTA (الحانات مفتوحة)، و المجهر TIRF في خلايا محملة EGTA (القضبان الرمادية). وتعرض البيانات كما يعني ± SEM مع ن 37 على الأقل نفثلWF و 79 لTIRF. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| A. | مجموعة # | الحدث عدد هوية الموقع |
| B. | GroupX: | يعني بكسل فرعي العاشر موقع كل الأحداث في موقع معين |
| C. | جروب: | يعني بكسل فرعي ذ مكان كل الأحداث في موقع معين |
| D. | رقم الأحداث: | رقم لأحداث وقعت في موقع على مدار التجربة. |
| E. | ماكس الأمبير: | السعة القصوى لهذا الحدث في هذا الموقع بالذات (ΔF / F 0) |
| F. | X: | بكسل فرعي س توطين الحدث |
| G. | Y: | بكسل فرعي يلocalization الحدث |
| H. | T_peak: | الوقت الذي حدث يصل السعة الذروة (في عدد الإطار) |
| أنا. | السعة: | سعة كل الأحداث القادمة من كل موقع (ΔF / F 0) |
| J. | Sigmax: | X SD من الملف الشخصي جاوس تركيبها على مدار الساعة من الحدث (بالبكسل) |
| K. | Sigmay: | Y SD من الملف الشخصي جاوس تركيبها على مدار الساعة من الحدث (بالبكسل) |
| L. | زاوية: | زاوية محور طويل من وظيفة بيضاوي الشكل الناتج من التمويه تركيبها على مدار الساعة من الحدث |
| M. | R20: | الوقت لترتفع إلى 20٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| N. | R50: | الوقت لترتفع إلى 50٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| O. | R80: | الوقت ليرتفعإلى 80٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| P. | R100: | الوقت لترتفع إلى 100٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| Q. | F80: | الوقت أن ينخفض إلى 80٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| R. | F50: | الوقت أن ينخفض إلى 50٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| S. | F20: | الوقت أن ينخفض إلى 20٪ من أقصى سعة (في إطارات) |
| T. | F0: | الوقت للعودة إلى خط الأساس قبل الحدث (في إطارات) |
الجدول 1: بيانات الناتج من الخوارزمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف البروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في خلايا الثدييات مثقف باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية مع واجهة مستخدم بديهية بأتمتة تحديد وتحليل البيانات التي حصل عليها. الإجراء الموضح هنا الاستفادة من الفلورسنت الكالسيوم 2+ مؤشر كال-520، ولكن العديد من الكالسيوم 2+ الأصباغ الأخرى الحساسة مثل فلوو-3، فلوو-4، فلوو-8 وأوريغون الخضراء BAPTA-1 أداء جيدا بما فيه الكفاية لصورة الكالسيوم 2+ microdomains. الرعاية لا بد من اتخاذها لضمان أن الإصدارات عالية تقارب (K د من ~ 200-400 نانومتر) من هذه المؤشرات وتستخدم لصورة محلية الكالسيوم 2+ microdomains، ويجب أن يتم تحديد تجريبيا لظروف التحميل الأمثل لهذه المؤشرات كل نوع من الخلايا قيد التحقيق. بحكم طبيعتها الكالسيوم 2+ المؤشرات ربط الكالسيوم 2+ وبالتالي يكون بمثابة الكالسيوم 2+ المخازن. تركيزات أعلى من تحميل إنديكاالاختصاصات لديها القدرة على تتداخل مع إشارات الكالسيوم 2+ يتم تسجيلها و / أو قد يكون معزولا في عضيات داخل الخلايا، على الرغم من أن ظروف التحميل الموصوفة هنا هي نقطة انطلاق جيدة. وعموما، تصوير نشاط المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث هو الغازية الحد الأدنى، والحفاظ على العمارة الأم من خلية والعوامل التي قد عصاري خلوي تنظيم القنوات التي تكمن وراء الكالسيوم 2+ microdomains.
بروتوكول وصفنا هنا لارتفاع القرار التصوير من الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات باستخدام TIRF المجهري لديه الحد واضح في أنه يحد من القياسات للأحداث التي تنشأ عن قنوات الكالسيوم 2+ الكذب في مجال زائل. ومع ذلك، لا يقتصر فقط على قنوات في غشاء البلازما، وعلينا أن نظهر انطباقها على قنوات مثل R IP 3 في عضيات داخل الخلايا التي تم العثور عليها ليكون موجودا بشكل تفضيلي بالقرب من غشاء البلازما 12 ولكنوإلا سيكون الوصول إليها لتسجيل الكهربية من نشاطهم في البيئة الخلوية الأم. سيكون التصوير متحد البؤر تمكين التصوير من الإشارات ولدت في عمق الخلية، ولكن لديه عيوب بالمقارنة مع TIRF التصوير في ذلك سمك قسم البصرية وعلى نطاق أوسع (~ 800 نانومتر مقابل 100-200 نانومتر) ويقتصر في القرار الزماني بسبب الحاجة لمسح بقعة مبائر (ق). لأنه يتم التصوير في وضع برنامج التحصين الموسع ومضان باستخدام مجهر مقلوب، والتسجيلات البصرية من الكالسيوم 2+ الإشارات المحلية وعلى قناة واحدة يمكن بسهولة في وقت واحد جنبا إلى جنب مع الكهربية تسجيل التصحيح، المشبك.
بالإعراب عن مضان الكالسيوم 2+ إشارات كنسبة من يستريح مضان (ΔF / F 0) فمن الممكن الحصول على قياس نسبي لا بأس به من سعة الإشارة. ومع ذلك، فإننا نحذر من أن معايرة، والتغيرات مضان عابرة المحلية من حيث المطلقة الكالسيوم 2+ تركيزات غيرلا الاقتضاء. التدرجات حرية [كا 2+] والكالسيوم 2+ مؤشر -bound حول الافراج عن قناة أو مجموعة من قنوات الكالسيوم 2+ أضيق مما يمكن حلها بواسطة المجهر الضوئي وبالتالي سوف تكون واضحة من قبل وظيفة انتشار نقطة المجهر. وعلاوة على ذلك، المحلي [كا 2+] في مقربة من المسام قناة سيغير على الجدول الزمني ميكروثانية كما يفتح ويغلق قناة. وبالتالي، توفر إشارات مضان فقط غير واضحة (في المكان والزمان) تمثيل صحيح الكالسيوم 2+ nanodomain الكامنة المحلية الكالسيوم 2+ الإشارات 13.
الخوارزمية الموصوفة هنا كثيرا تسهل تحليل الكالسيوم المحلية 2+ إشارات من التصوير استنادا الكاميرا. من خلال أتمتة تحديد وتحليل ليس فقط هو التحيز المستخدم القضاء، ولكن يمكن معالجة غيغابايت من مداخن صورة في غضون دقائق على نحو مواز للغاية، مما أسفر كلا البيانات الزمانية والمكانية من أحداث متعددة منخلية واحدة في وقت واحد.
على الرغم من أن يتم عرض البيانات في هذه المخطوطة في سياق IP 3 بوساطة الكالسيوم 2+ إشارات، والنهج وصفها ويمكن تمديد بسهولة لتصوير التغيرات المحلية في عصاري خلوي [كا 2+] المنبثقة عن أنواع عديدة من ligand-، ثاني messenger- والجهد بوابات الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable. يجب طبيعة عالية الإنتاجية من الخوارزمية لأتمتة تحديد وتحليل المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث يثبت أيضا أن تكون مفيدة للغاية لتصوير الكالسيوم 2+ channelopathies في الحالات المرضية عن طريق نماذج وحيدة الخلية مثل مرض التوحد واضطراب الطيف الزهايمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
