Abstract
胞质的Ca 2+离子的调节在几乎所有类型的细胞的细胞活性的许多方面，控制流程作为广泛作为基因转录，电兴奋性和细胞增殖。 钙离子信号的多样性和特异性的发生在几分钟到局部瞬时钙微区的时间用来生成钙信号采取行动在不同的时间和空间尺度的机制，从细胞级振荡和电磁波派生（ 钙离子喷）持久毫秒。在电子的最新进展乘以CCD（EMCCD）相机，现在允许本地钙信号与128×128像素的空间分辨率成像为> 500帧秒-1（fps）的速率。这种方法是高度并行的，并能够在一个单一实验中同时监测数百个频道或粉扑站点的。然而，所产生的大量数据（ 约 1千兆PER最小值）渲染视觉识别本地钙和分析2+事件不可行。在这里，我们将介绍和演示程序的采集，检测，以及本地IP 3介导的钙信号加载同时使用宽视场落射荧光（WF）和全内反射钙指标完整的哺乳动物细胞分析荧光（TIRF）显微镜。此外，我们描述了开放源码的软件环境的Python，自动化这些地方的钙离子信号的识别和分析中开发了一种算法。该算法本地化的钙释放与子像素分辨率的场所;允许数据的用户查看;输出的荧光信号比时间序列与幅度和动力学数据在Excel兼容的表格。
Introduction
钙离子（ 钙 ）遍在调节生物学过程，包括基因表达，分泌和在突触可塑性1持久的变化的一个不同的范围。通过这些钙离子可以在这样一个多元化的方式行事的一种方法是通过钙离子的不同的时空格局预示着细胞可以生成。对于胞浆例如全球海拔在平滑肌组织2而较小的[Ca 2+]触发收缩，局部的暂时升高（局部钙微区）刺激基因表达的学习和记忆至关重要的3。
游离胞质内[Ca 2+]被维持在约100纳米处，休息，但能迅速通过钙上升到几个微摩尔以下的Ca 2+的流入到胞质溶胶定位于质膜和由2+ -permeable离子通道钙离子从细胞内的S中解放tores。我们实验室的重点是肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP 3 R），其形成位于内质网（ER）膜中的钙释放通道。一旦这两个IP 3和Ca 2+胞浆激活受体位点结合，将IP 3 R通道打开，释放钙离子的ER管腔内隔离。的Ca 2+的释放可保持空间限制到一小簇的IP 3卢比生成的Ca的本地胞质微区2+（钙离子粉扑4），或者，依赖于邻近簇的IP 3 Rs的接近度，可通过钙离子诱导的Ca 2+ -释放（CICR）5,6的过程中多个招聘网站噗传播在整个细胞。
荧光小分子的Ca 2+指示剂染料引入由Roger开发钱学森7，再加上先进的显微镜意马纳克技术，极大地方便了我们的Ca 2+信号的认识。在用于显微镜相机最近的进展，现在允许成像瞬态本地的Ca 2+的事件，如喷以前所未有的空间和时间分辨率。目前可用的EMCCD相机使成像128×128象素，在> 500帧秒-1（fps）的和新一代互补金属氧化物半导体的（CMOS）摄像机提供更高的像素分辨率，并且在稍高的费用，甚至更快的速度噪音水平。在与全内反射（TIRF）显微镜结合使用，现在可以像单钙通道事件8,9。这种方法允许数百同时频道/事件的成像，同时产生大的数据集（每分钟大约 1Gb的），该渲染人工处理，视觉识别和分析不可行和放置一个责任上的自动算法的发展。
钙指标成像在完整的哺乳动物细胞局部钙信号的程序和协议。我们进一步证明了开源环境的Python可以自动识别本地钙事件双方TIRF和传统的宽视场落射荧光（WF）显微成像和分析开发了一种算法。尽管我们描述了这些方法中的IP 3 -生成的Ca 2+信号的情况下，它们是很容易适合于研究在胞浆内[Ca 2+]从各种钙发出位于任一表面2+ -permeable离子通道的局部变化细胞膜或细胞内的细胞器8-10。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
我们提出了详细的程序，成像在人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞局部钙事件。这些程序可适应图像内Ca 2+信号在许多细胞类型8-10。
1.准备细胞
- 培养细胞根据他们的供应商的网站上列出的指令进行成像。
- 在成像之前的几天，收获细胞生长在用1ml的0.25％胰蛋白酶/ EDTA（2-3分钟）的组织培养瓶。下面脱离，加培养基等体积以灭活胰蛋白酶。
- 以每培养皿3-7×10 4个细胞的密度进行使用血球和种子细胞进入玻璃底成像菜细胞计数。选择细胞成像实验，当他们达到60％汇合（2-3天）。
2.准备解决方案和试剂
- 准备一个缓冲的钙含HEPES盐溶液（ 钙 -HBSS）（MM）组成：135氯化钠，氯化钾5.4，2 氯化钙 ，氯化镁1 2，10 HEPES和10葡萄糖; pH值= 7.4，在室温（RT）下用NaOH。制备的Ca 2+ -HBSS而不在4℃下加入葡萄糖和存储的;添加葡萄糖的溶液在使用前立即。
- 溶解荧光钙离子指 示剂校准- 520（1毫米）的膜透膜物的形式，CI-IP 3（200μM），和EGTA（100毫摩尔）在二甲基亚砜（DMSO）含有20％普流尼克F-127。分装这些试剂进Eppendorf管中并储存，防潮和避光，于-20℃下。
3.细胞装载膜穿透物加州-520，CI-IP 3和EGTA
- 分别稀释储备溶液膜穿透物校准-520和C的IP 3至5微米和1微米，使最终浓度，对Ca 2+ -HBSS制备“装载缓冲器”。
- 吸立方米lture媒体与钙 -HBSS三次更换介质漂洗细胞。
- 删除钙 -HBSS，并培育细胞样缓冲液在室温下在黑暗中60分钟。
- 卸下装 载的缓冲区，并通过与钙离子-HBSS三次更换介质漂洗细胞。
- 如果需要的话，在该步骤中，测力传感器用EGTA / AM通过稀释原液至5微米的Ca 2+ -HBSS终浓度，然后孵育细胞在室温在黑暗中30-60分钟。按照此孵育后，进到步骤3.5之前冲洗细胞三次， 钙 -HBSS。
- 孵育细胞中的Ca 2+ -HBSS 30分钟，以允许用于脱酯化装载试剂。
- 紧接在成像之前，取代的Ca 2+ -HBSS与“新鲜”的Ca 2+ -HBSS为了除去最后的孵化过程中可能已流入浴任何染料。
4. 钙
- 将一小滴浸油到100X APO TIRF目标（NA 1.49）。
- 安装在倒置显微镜的阶段成像盘，并使用透射光使细胞进入焦点。它以固定的成像盘，以防止在记录过程中的运动是很重要的。
- 照亮以激发校准-520，并收集用高速EMCCD相机发射的荧光（λ> 510纳米）的细胞用488nm的激光。
注：操作该显微镜软件包允许用户平移一聚焦透镜使激光束被引入或者在目标背孔（用于激发TIRF）以上集中（对于“WF”激发）的末端边缘。 - 使用EMCCD软件，从完整的512×512象素减少，以便收集数据，在必要的时间分辨率来捕捉本地的Ca 2+事件的摄像视场。
注：例如，中心四收购的256×256像素加快并购速度，以66 fps的。另外，也可以使用一个分离的作物模式功能，以进一步增加EMCCD摄像机的帧频为500帧。 - 配置软件自动记录基线活性的几秒钟，递送的UV闪光对细胞和继续录制另一10-30秒。
注：紫外线闪光灯使用通过紫外线反射在显微镜的后部端口分色镜引入氙弧光源递送。紫外线闪光的持续时间和强度被调整凭经验唤起的本地的Ca 2+事件的期望的频率。 - 将文件保存为图像叠加的离线分析。
5.自动钙图像分析
注：可以查看，处理和利用许多商业软件包，分析捕获的数据。但是，我们已经开发了一种算法，以迅速确定自动化的当地的钙信号D分析。该算法中所使用的空间和时间的过滤器的详细说明，生成的ΔF/ f 0的鉴定和/分析例程可以在11找到。该算法已经发展到在开源软件平台的Python运行，并且能够获得，连同样品的实验数据和详细的用户指令，通过电子邮件发送相应的作者（ismith@uci.edu）。
- 转换文件被导入到自定义编写算法的多平面.tiff格式的文件格式。
- 找到包含分析算法的文件夹，然后双击run.exe。
- 选择.TIFF文件进行分析。
- 选择在打开的对话框中分析参数。参见图2A为默认参数的样本数据。
- 确定的黑色电平被从图像堆栈通过移动光标到的视场的，做为n的部分偏移OT包含电池（参见图2B），或通过手动输入黑电平使用“设置黑电平”的提示。
- 观察四个窗口在屏幕上继软件（ 图2C-F）分析。 C是静止从细胞中荧光的单色图像被分析。叠加在该图像的白色方块是事件的地点，判断为装配到事件的二维高斯函数的质心位置。
- 点击每个事件的位置，或者按光标键事件之间循环。在这样的背景中减去，高斯在这些网站更新窗口D的平滑荧光强度的变化（ΔF/女0）
注：红色突出显示的事件，决心从特定网站发起，而不是从'流血通“从活动定位于相邻的站点。较低的蓝色线指示了在所选网站上的荧光信号超过检测的阈值，而黑线识别的事件，从该特定网站的始发（对应于红色突出显示事件）。 - 点击一个红色高亮显示事件更新窗口Ë显示事件的时空演化和窗口F，可以显示该事件的空间分布平均的时间过程，与拟合高斯函数的空间分布在一起。
- 手动检查已确定，这样的文物可以从分析被拒绝的事件。右键单击红色删除这些事件突出事件。
注：在我们的手中， 钙离子通量通过单一IP 3 R声道唤起信号与ΔF/ f 0的约0.11，所以任何检测“事件”明显比这更小的很可能是误报。 - 通过选择“保存到Excel”或导出数据在每个小区所感兴趣的细胞周围绘制，然后选择“保存CellR导出数据17 ;.
注：数据被保存到同一文件夹与原始图像堆栈。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1A示出了静息校准-520荧光在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞还装载了CI-IP 3的WF图像。曝光这些细胞到一个100毫秒的UV闪光灯光释放的i-IP 3引起短暂的Ca 2+喷在离散的位点（由白圈在图1A中说明）。在这些位点测得的荧光的痕迹显示由于知识产权3卢比短暂的开口，随后是慢得多的下降沿相位（ 图1B和1C），为的Ca一个快速上升的阶段2+慢慢扩散远离释放部位。红色突出显示在图1B中的事件是由该算法确定的Ca 2+信号，以源自选定站点。非突出事件代表污染钙信号从紧邻部位扩散。
为了实现本地CA更高分辨率的成像
图像栈以这种方式捕获的分析，通过对开源软件平台的Python开发11在我们的实验室运行一个自定义的书面算法大大方便了图2A示出了用户输入要用于识别和图像栈的后续分析参数的开口对话窗口。在此之后，将提示用户选择一个黑色电平被从整个图像堆栈中减去之后的识别和分析算法运行图2C-F分别示出的地方的Ca 2+释放的亚细胞位点。活动在选定的地点;在扩大的时间尺度的单个事件;和有代表性的事件的空间分布（ 见图2传奇了解详细信息）。一旦确定了网站的用户查看，分析了所有事件（ 见表1），可以通过选择“保存到Excel”功能导出数据。
图3呈现的数据表示无论是在由TIRF成像所实现的分辨率的提高相比，WF成像在空载细胞EGTA加载细胞，并在p奥尔算法的识别和分析当地的钙信号。 图3A显示了WF只装载了卡尔-520和CI-IP 3细胞成像代表本地事件。为了比较， 图3B示出了类似的事件，但现在由TIRF显微镜中进一步装入用EGTA细胞成像。在图3C和3D叠加迹线，示出了相应的时间（C）和空间（D）的无EGTA（黑色）和由TIRF显微镜用EGTA加载（红色）记录WF荧光事件的概况; 图3E重复意味着粉扑振幅的测量，衰减时间，和这两个条件下的空间的宽度，确定使用算法来分析约44（WF）和88（TIRF）事件。
图1：IP
图2：定制代码设计为自动识别和分析当地的Ca 2+信号在SH-SY5Y细胞通过TIRF显微镜成像的用户界面（A）的可开，其中鉴定和分析参数输入对话框（B）中的用户选择。 。不包含细胞来定义是从在图像堆栈中的所有帧中减去黑电平图像的区（C - F）的最终/识别分析窗口截图（C）的静止图像校准-5- 20荧光在其上叠加地点， 钙瞬变被确定（白色方块）。用户可以通过网站通过移动鼠标在图像或按光标键之间的循环。（D）窗口显示荧光强度（ΔF/女0）跟踪在选定的事件。红色高亮事件被确定为出现在所选择的部位。下方的蓝色条显示，超过阈值的检测，在该网站的活动;不高亮红事件已本地化到相邻站点。点击蓝条将用户带到了活动现场。点击红色事件用鼠标打开了两个另外的窗口上显示的扩展的时间尺度（E）和空间轮廓（F）的情况下平均的时间过程（左）事件的时间演化一起的空间分布拟合高斯（右）。e.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：改善了与EGTA细胞内装载结合使用TIRF显微镜实现粉扑成像的时间和空间 ，在保真度峰值的时间捕获的粉扑（A）快照图像，叠加在休息荧光的背景图像。显示单元的轮廓。该图像是由未装载用EGTA的细胞的WF显微镜获得。粉扑图像伪彩色，具有较高的钙离子水平表示为日益“温暖”色。（B）的通讯由TIRF显微镜装载用EGTA细胞成像的抽吸的图像。（C）的痕迹，WF（黑色）或TIRF + EGTA（红色），显示加州-520 fluorescenc相应的变化E的时间为（A）所示的钙泡芙和（B）以上。迹线是归一化到相同的峰值振幅和对准到它们的峰值的时间，以促进它们的动力学的比较。注解说明的Ca 2+事件参数测量（幅度和下降时间）量化（E）（D）的痕迹，WF（黑色）或TIRF + EGTA（红色），显示线的荧光强度通过的Ca 2扫描+中（A）所示泡芙和（B）。行扫描归其峰值幅度，并居中。注解显示全宽的测量在半数最大振幅（FWHM），作为量化（E）中。 （E）的棒图表示平均峰值幅度（上），下降时间从80％到抽吸通过WF显微镜在细胞成像的峰值幅度（中），和空间宽度（FWHM）为20％，无EGTA（空心柱）和由在EGTA加载细胞TIRF显微镜（灰色条）。数据表示为平均值±SEM具有至少37次抽吸的n为WF和79 TIRF。 请点击此处查看该图的放大版本。
| A. | 组＃ | 活动现场身份证号码 |
| B. | GroupX： | 在特定位点的意思的所有事件的子像素x的位置 |
| C. | GroupY： | 在特定位点的意思的所有事件的子像素y位置 |
| D. | 号事件： | 号在一个站点在实验的过程中发生的事件的。 |
| E. | 最大安培： | 事件在那个特定部位的最大振幅（ΔF/ f 0的） |
| F. | X： | 事件的子像素x本地化 |
| G. | Y： | 子像素基事件ocalization |
| H. | T_peak： | 时间在该事件到达峰值幅度（在帧号） |
| I. | 振幅： | 从每个站点始发的所有事件的幅度（ΔF/女0） |
| J. | Sigmax： | 高斯曲线X SD安装事件随着时间的推移（以像素为单位） |
| K. | Sigmay： | 高斯曲线ŸSD安装事件随着时间的推移（以像素为单位） |
| L. | 角度： | 高斯所得椭圆函数的长轴的角度装配到事件的时间过程 |
| M. | R20： | 时间上升到最大振幅的20％（以帧） |
| N. | R50： | 时间上升到最大振幅的50％（以帧） |
| O. | R80： | 时间上升到80％的最大振幅（在帧） |
| P. | R100： | 时间上升到最大振幅的100％（以帧） |
| Q. | F80： | 时间下降到80％，最大振幅（帧） |
| R. | F50： | 时间下降到最高幅度为50％（帧） |
| S. | F20： | 时间下降到最高幅度20％（帧） |
| T. | F0： | 时间恢复到事件前的基线（在帧） |
表1：从算法的输出数据。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里，我们描述了协议成像培养的哺乳动物细胞局部钙事件使用荧光钙指标。此外，我们描述了一种算法可以自动识别和获取的数据进行分析的直观的用户界面。这里所描述的方法利用荧光钙指标加州-520，但其他许多钙敏感染料如荧光- 3，荧光4，荧光- 8和俄勒冈州绿BAPTA-1进行足够好图像的Ca 2+微区。护理确实需要采取以确保这些指标的高亲和性的版本（的〜200-400纳米ķd）的用于图像局部钙微区，和这些指标的最佳负载条件需要根据经验确定的用于接受调查的细胞类型。其性质钙指标结合钙 ，因此作为钙缓冲区;籼稻高负荷浓度器有干扰的Ca 2+信号被记录和/或可以分布到细胞内细胞器的潜力，虽然这里所描述的加载条件是一个很好的起点。总体而言，成像的地方的Ca 2+事件的活性是微创，保持单元和胞质因子，可能调节所依据的Ca 2+微区的信道的原始结构。
我们在这里描述为使用TIRF显微镜本地钙信号的高分辨率成像的协议具有明显的局限性，因为它限制了测量过程中出现钙通道躺在渐逝领域内的事件。但是，它不仅限于在质膜通道，和我们证明它适用于信道，如IP 3中的R的胞内细胞器已发现要优先靠近质膜12，但否则将无法获得其活性的天然细胞环境中电生理记录。共焦成像将使信号成像产生更深的细胞，但也有缺点相比TIRF成像，所述光学部的厚度更宽的（〜800纳米VS 100-200纳米），并且在时间分辨率的需要的限制扫描共聚焦点（S）。因为成像使用倒置显微镜进行在落射荧光模式下，本地和单信道的Ca 2+信号的光记录可以很容易地与同步电膜片钳记录的总和。
通过表达荧光的Ca 2+信号作为静止荧光的比值（ΔF/ f 0的）也能够得到信号振幅的一个很好的相对度量。但是，我们提醒的地方，瞬态荧光变化校准绝对的Ca 2+浓度而言是不恰当的。游离的[Ca 2+]和Ca 2+ -被结合指示器周围的Ca 2+释放通道或通道的簇的梯度是窄于可通过光学显微镜得到解决，因此将通过显微镜的点扩散函数模糊。此外，当地的[Ca 2+]在通道孔的酒店附近将改变在微秒的时间尺度的通道打开和关闭。因此，荧光信号提供真实的钙离子nanodomain底层本地的Ca 2+信号13仅模糊（在空间和时间）表示。
这里描述大大的算法有利于从相机的成像基于本地钙信号的分析。通过自动化识别和分析，不仅是用户偏压消除，但图像栈的千兆字节可以在几分钟内以高度平行的方式进行处理，得到两个来自多个事件的时间和空间数据一个单细胞同时进行。
虽然在该手稿数据中的IP 3介导的Ca 2+信号的上下文中呈现，所描述的方法可以容易地扩展到成像局部变化在胞浆内[Ca 2+]从多种类型的配体，第二messenger-的射出和电压门控的Ca 2+ -permeable离子通道。的算法的局部的Ca 2+事件自动识别和分析的高通量性质也应被证明是一种用于通过单小区模型成像的Ca 2+离子通道中的疾病状态，例如阿尔茨海默氏病和孤独症谱系障碍是非常有用的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
