Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Imaging Local Ca Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

Abstract

Cytosolisk Ca2 + ioner regulere mange aspekter af cellulær aktivitet i næsten alle celletyper, kontrollerende processer vidtrækkende som gentranskription, elektrisk ophidselse og celleproliferation. Mangfoldigheden og specificitet Ca2 + signalering stammer fra mekanismer, som Ca 2 + signaler genereres til at handle over forskellige tidspunkter og rumlige skalaer, lige fra celle hele svingninger og bølger, der forekommer i løbet af de perioder minutter til lokale forbigående Ca 2 + mikrodomæner (Ca 2 + pust) varige millisekunder. Nylige fremskridt inden elektron multipliceret CCD (EMCCD) kameraer nu mulighed for billeddannelse af lokale Ca 2 + signaler med en 128 x 128 pixel rumlig opløsning på hastigheder på> 500 frames sek -1 (fps). Denne fremgangsmåde er yderst parallel og muliggør samtidig overvågning af hundreder af kanaler eller puff sites i et enkelt eksperiment. Men de umådelige mængder af data, der genereres (ca. 1 GB per min) gør visuel identifikation og analyse af lokale Ca 2 + begivenheder umuligt. Her beskriver vi, og demonstrere procedurerne for erhvervelse, afsløring og analyse af lokale IP 3 medieret Ca 2 + signaler i intakte pattedyrceller lastet med Ca 2 + indikatorer ved hjælp af både bredt felt epi-fluorescens (WF) og total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Desuden beskriver vi en algoritme udviklet i open source software miljø Python, der automatiserer identifikation og analyse af disse lokale Ca 2 + signaler. Algoritmen lokaliserer lokaliteter af Ca 2+ frigivelse med sub-pixel opløsning; giver brugeren mulighed for gennemgang af data; og udlæser tid sekvenser af fluorescensforhold signaler sammen med amplitude og kinetiske data i et Excel-kompatible tabel.

Introduction

Calcium ioner (Ca 2+) allestedsnærværende regulere en bred vifte af biologiske processer, herunder genekspression, sekretion og langvarige ændringer i synaptisk plasticitet 1. En måde, hvorigennem Ca2 + kan handle på en sådan forskelligartet måde er gennem de forskellige rumlige og tidslige mønstre af Ca 2+ signalerer en celle kan generere. For eksempel globale stigninger i cytosol [Ca2 +] trigger sammentrækning i glat muskelvæv 2 mens mindre, lokaliserede forbigående stigninger (lokale Ca 2 + mikrodomæner) stimulere genekspression af afgørende betydning for indlæring og hukommelse 3.

Fri cytosol [Ca2 +] holdes på ~ 100 nM i hvile, men kan hurtigt stige til flere mikro-molær efter tilstrømningen af Ca 2+ i cytosolen via Ca2 + -permeable ionkanaler placeret i plasmamembranen og befrielsen af Ca 2+ fra intracellulære sTores. Vores laboratorium fokuserer på inositol 1,4,5-trisphosphat receptor (IP3 R), som danner en Ca2 + release kanal beliggende i det endoplasmatiske reticulum (ER) membran. Ved binding af både IP3 og Ca2 + til cytosoliske aktiverende steder i receptoren, IP3 R kanal åbner at befri Ca 2+ afsondret inden ER lumen. Frigivelsen af Ca 2+ kan forblive rumligt begrænset til en lille klynge af IP 3 R'er til at generere en lokal cytosolisk microdomain af Ca 2+ (Ca2 + puff 4), eller, afhængigt af hvor tæt beslægtede klynger af IP 3 R'er, kan udbrede gennem en celle ved at rekruttere flere puff sites gennem en Ca 2 + -induceret Ca 2+ release (CICR) 5,6.

Indførelsen af fluorescerende lille molekyle Ca 2+ indikatorfarvestoffer udviklet af Roger Tsien 7, kombineret med avanceret mikroskopi fantasing teknikker, i høj grad har lettet vores forståelse af Ca2 + signalering. Nylige fremskridt i kameraer, der anvendes til mikroskopi nu mulighed for billeddannelse forbigående lokale Ca 2 + begivenheder som pust med hidtil uset rumlig og tidsmæssig opløsning. Aktuelt tilgængelige EMCCD kameraer gør det muligt billeddannelse med 128 x 128 pixels ved> 500 frames sek -1 (fps), og den nye generation af komplementær metal-oxid halvleder (CMOS) kameraer giver højere pixel opløsning, og endnu hurtigere hastighed på bekostning af lidt højere støjniveauer. I forbindelse med total intern refleksion (TIRF) mikroskopi er det nu muligt at billedet enkelt Ca 2+ kanal events 8,9. Denne fremgangsmåde giver mulighed for billeddannelse af hundredvis af kanaler / begivenheder samtidig, samtidig med at generere store datasæt (ca. 1 Gb per min), der gør manuel behandling, visuel identifikation og analyse praktisk muligt og placere en vægt på en udvikling af automatiserede algoritmer.

2 + signaler i intakte pattedyrceller under anvendelse af fluorescerende Ca 2 + indikatorer. Vi viser yderligere en algoritme udviklet i open source miljø Python, der automatiserer identifikation og analyse af lokale Ca 2 + arrangementer afbildet af både TIRF og konventionel bredt felt epi-fluorescens (WF) mikroskopi. Selvom vi beskrive disse metoder i forbindelse med IP 3 -generated Ca2 + signaler, de er let medgørlige at studere lokale ændringer i cytosoliske [Ca2 +], der hidrører fra en række Ca2 + -permeable ionkanaler placeret i enten overfladen membran eller intracellulære organeller 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vi præsenterer detaljerede procedurer for billeddannelse lokale Ca 2 + arrangementer i human neuroblastom SH-SY5Y celler. Disse procedurer kan tilpasses til billedet intracellulær Ca2 + signaler i mange celletyper 8-10.

1. Fremstilling af celler

  1. Kultur cellerne, der skal afbildes i henhold til vejledningen, der er opført på deres leverandørens hjemmeside.
  2. Et par dage før billeddannelse, høst celler dyrkes i en vævsdyrkningskolbe ved anvendelse af 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (2-3 min). Efter løsrivelse, tilsættes et lige volumen af ​​dyrkningsmedier til inaktivering af trypsin.
  3. Udfør en celletælling under anvendelse af et hæmocytometer og frøceller i glas-bottom billeddannende retter ved en densitet på 3-7 x 10 4 celler pr skål. Vælg celler til billeddannelse eksperimenter, når de når 60% konfluens (2-3 dage).

2. Fremstilling af opløsninger og reagenser

  1. Forbered en Ca 2+ holdige HEPES bufferetsaltopløsning (Ca 2+ -HBSS) bestående af (mM): 135 NaCl, 5,4 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, og 10 glucose; pH = 7,4 ved stuetemperatur (RT) med NaOH. Forbered Ca 2+ -HBSS uden tilsætning af glucose og opbevares ved 4 ° C; tilføje glucose til opløsningen umiddelbart før brug.
  2. Solubilisere membran-gennemtrængende former af fluorescerende Ca2 + indikator Cal-520 (1 mM), CI-IP3 (200 uM) og EGTA (100 mM) i dimethylsulfoxid (DMSO) indeholdende 20% Pluronic F-127. Alikvot disse reagenser i Eppendorf-rør og opbevares, beskyttet mod fugt og lys, ved -20 ° C.

3. Ilægning Celler med membran-gennemtrængende Cal-520, ci-IP 3 og EGTA

  1. Forbered "loading buffer" ved fortynding stamopløsninger af membran-gennemtrængende Cal-520 og CI-IP3 til en endelig koncentration på 5 uM og 1 uM i henholdsvis Ca 2+ -HBSS.
  2. Aspirer culture medier og skyl celler ved at erstatte medierne med Ca 2+ -HBSS tre gange.
  3. Fjern Ca 2+ -HBSS og inkuberes celler i loading buffer i 60 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  4. Fjern påsætningsbuffer og skyl celler ved at erstatte medierne med Ca 2+ -HBSS tre gange.
    1. Hvis det ønskes, på dette trin, vejeceller med EGTA / AM ved fortynding af stamopløsning til en endelig koncentration på 5 uM i Ca 2+ -HBSS og derefter inkuberes celler i 30-60 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter denne inkubation skylles cellerne tre gange med Ca 2+ -HBSS før du fortsætter til trin 3.5.
  5. Inkubér cellerne i Ca 2+ -HBSS i 30 minutter for at tillade de-esterificering af lastede reagenser.
  6. Umiddelbart før billeddannelse erstatte Ca2 + -HBSS med "friske" Ca 2+ -HBSS for at fjerne enhver farvestof, som kunne have lækket ind i badet under den afsluttende inkubation.

4. Ca 2+

  1. Placer en lille dråbe immersionsolie på 100X APO TIRF mål (NA 1.49).
  2. Monter imaging parabol på scenen af ​​den omvendt mikroskop og bringe cellerne i fokus ved hjælp af transmitteret lys. Det er vigtigt at sikre den billeddannende skålen for at forhindre bevægelse under optagelse.
  3. Belyse celler med en 488 nm laser for at excitere Cal-520 og indsamle udsendte fluorescens (λ> 510 nm) ved anvendelse af en high-speed EMCCD kamera.
    BEMÆRK: softwarepakke, der driver mikroskopet tillader brugeren at oversætte en fokuseringslinse tillader laserstrålen at blive indført enten ved den yderste kant af målet tilbage blænde (for TIRF excitation) eller mere centralt (for "WF" excitation).
  4. Ved hjælp af EMCCD software, reducere imaging felt fra de fulde 512 x 512 pixels, for at indsamle data på det nødvendige tidsmæssige opløsning at fange lokale Ca 2 + begivenheder.
    BEMÆRK: For eksempel center quadkøb af 256 x 256 pixels fremskynder købet sats på 66 fps. Det er også muligt yderligere at forøge rammehastighed af EMCCD kamera til 500 fps under anvendelse af en isoleret Crop funktion.
  5. Konfigurer software til automatisk at optage nogle få sekunder af baseline aktivitet, levere en UV flash til cellerne og fortsætte optagelsen for en anden 10-30 sek.
    BEMÆRK: Et UV flash leveres ved hjælp af en Xenon arc lyskilde indføres gennem et UV reflekterende dichroic spejl i den bageste port af mikroskopet. Varigheden og intensiteten af UV-flash justeres empirisk at fremkalde en ønsket frekvens af lokale Ca 2 + begivenheder.
  6. Gem filer som billede stakke til off-line analyse.

5. Automatiseret Ca 2+ Image Analysis

BEMÆRK: Det er muligt at se, bearbejde og analysere indsamlede data ved hjælp af mange kommercielle softwarepakker. Vi har imidlertid udviklet en algoritme til hurtigt automatisere identifikation end analyse af lokale Ca2 + signaler. En detaljeret beskrivelse af de rumlige og tidsmæssige filtre, der anvendes i denne algoritme, kan generation af bf / F 0 og identifikation / analyse rutiner findes i 11. Denne algoritme er udviklet til at køre på open source software platform Python, og kan fås sammen med prøven forsøgsdata og detaljerede brugsvejledning via e-mail den tilsvarende forfatter (ismith@uci.edu).

  1. Konverter filer, der skal importeres til custom-skriftlige algoritme til multi-plane .tiff filformat.
  2. Find den mappe, der indeholder analysen algoritme og dobbeltklik på run.exe.
  3. Vælg .tiff fil, der skal analyseres.
  4. Vælg analyseparametre i det åbne dialogboksen. Se figur 2A til standardparametre for eksempeldataene.
  5. Bestem sortniveauet skal forskydes fra den billedstak ved enten at flytte markøren til en del af synsfeltet, der gør not indeholder en celle (se figur 2B) eller ved manuelt at indtaste et sort niveau ved hjælp af 'Sæt Black Level' prompt.
  6. Observer fire vinduer på skærmen følgende analyse af softwaren (Figur 2C-F). C er et monokromt billede af hvilende fluorescens fra celler, der analyseres. Hvide firkanter oven på billedet er steder event, bestemt som den geometriske tyngdepunkt positioner todimensionale Gauss funktioner monteret på begivenhederne.
  7. Klik på hver begivenhed placering, eller tryk på piletasterne for at skifte mellem begivenheder. Ved at gøre dette baggrunden-korrigeret, Gauss glattede fluorescensforhold ændringer (bf / F 0) ved hver af disse steder opdatering i vinduet D.
    BEMÆRK: Rød fremhævede begivenheder er fast besluttet på at stamme fra det pågældende site og ikke fra "bløder-through" fra aktivitet lokaliseret til tilstødende sites. Den lavere blå spor angiver, hvor fluorescenssignalet ved den valgte sted overskredet påvisningtærskel, mens den sorte linje identificerer begivenheder stammer fra det pågældende site (svarende til den røde fremhævede hændelser).
  8. Klik på en rød markeret begivenhed for at opdatere vinduet E, der viser den tidsmæssige udvikling af begivenheden, og vinduet F, som viser den rumlige profil for begivenheden i gennemsnit over dennes tidsforløb sammen med den rumlige profil monteret Gauss-funktion.
  9. Manuelt at gennemgå de begivenheder, der er blevet identificeret, så artefakter kan afvises fra analysen. Slet sådanne begivenheder ved at højreklikke på den røde fremhævede begivenheder.
    BEMÆRK: I vores hænder, Ca2 + flux gennem enkelt IP 3 R-kanaler fremkalder signaler med bf / F 0 omkring 0,11, så alle fundne 'Events' mærkbart mindre end dette sandsynligvis vil være falsk positive.
  10. Eksport af data ved at vælge 'Gem til Excel' eller eksportere data på en pr celle basis ved at tegne rundt om cellen af ​​interesse og vælge 'Gem CellR17 ;.
    BEMÆRK: Data gemmes i samme mappe som det oprindelige billede stakken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser en WF billede af hvilende Cal-520 fluorescens i humane neuroblastom SH-SY5Y celler også fyldt med CI-IP 3. Eksponering af disse celler til en 100 ms UV flash til foto-release I-IP 3 fremkaldte forbigående Ca 2+ pust ved diskrete steder (med de hvide cirkler konstateret i figur 1A). Fluorescens spor målt på disse steder viste en hurtig stigende fase grund forbigående åbninger af IP 3 R'er, efterfulgt af en meget langsommere faldende fase (figur 1B og 1C) som Ca2 + langsomt spredes væk fra udsætningsstedet. Rød fremhævede begivenheder i figur 1B er Ca 2+ signaler, der blev fastsat af algoritme til at stamme fra det valgte sted. Ikke fremhævet begivenheder repræsenterer forurener Ca 2 + signaler spredende fra nært tilstødende websteder.

For at opnå højere opløsning billeddannelse af lokale Ca + buffer EGTA. Dette chelaterer Ca2 + ioner diffunderer mellem puff sites og dermed forhindrer dannelsen af globale Ca 2 + bølger, ville sløre studiet af lokale Ca 2 + pust genereret af individuelle klynger af IP 3 Rs. Endvidere EGTA accelererer sammenbrud af den lokale Ca 2+ microdomain men på grund af dens langsomme bindingskinetik, minimalt forstyrrer lokal frit Ca 2+ og dens binding til den hurtige Ca 2+ indikator i en klynge. Nettoeffekten af ​​EGTA er at "skærpe" fluorescens registreringer af sug i tid og rum, uden mærkbart mindske deres amplitude. En yderligere forbedring i opløsning opstår ved hjælp TIRF at begrænse excitation af Cal-520 fluorophorer til smalle (<100 nm) kortvarig bølge skabt af TIRF. Summen af begge disse tilgange er en teknik, der effektivt overvåger øjeblikkelig Ca2 + 2 + strøm) snarere end en utæt integral af Ca 2+, efter det er frigivet gennem IP 3 R'er og langsomt diffunderer væk fra udsætningsstedet, og i sidste ende afsondres 9. Figur 1D viser TIRF "fodaftryk" af et SH-SY5Y celle, når Cal-520 fluorophorer kun var spændt inden for et smalt stykke ind i cellen fra dækglasset / vandig opløsning interface. Rapid binding af Ca2 + til den hurtige indikator Cal-520 farvestof inden attoliter cytosoliske mængder skabt af TIRF belysning, sammenholdt med EGTA til "mop 'op diffusive Ca 2+, udbytter fluorescenssignaler, der er skærpet i både tid og rum ( Figur 1E og 1F).

Analysen af billedstakke fanget på denne måde i høj grad fremmes gennem en brugerdefineret skriftlig algoritme udviklet i vores laboratorium kører på open source software platform Python 11. Figur 2A viser åbningen dialogboksen vindue, hvor brugeren indtaster parametre, der skal anvendes til identifikation og efterfølgende analyse af billedet stakke. Herefter bliver brugeren bedt om at vælge et sort niveau, som skal trækkes fra hele billedet stakken hvorefter identifikation og analyse algoritme kører Figur 2C-F viser henholdsvis de subcellulære lokaliteter af lokale Ca 2+ frigivelse.; aktivitet på udvalgte steder; enkelte begivenheder på en udvidet tidsramme; og rumlige profiler af repræsentative hændelser (se figur 2 legende for detaljer). Efter bruger gennemgang af identificerede lokaliteter, analyserede data for alle hændelser (se tabel 1) kan eksporteres ved at vælge funktionen 'Gem i Excel.

Figur 3 viser data illustrerer både en forbedring i resolution opnås ved TIRF billeddannelse i EGTA belastede celler i forhold til WF billeddannelse i ubelastede celler, og power af algoritmen til at identificere og analysere lokale Ca 2 + signaler Figur 3A viser et repræsentativt lokal begivenhed afbildet af WF i en indlæst kun med Cal-520 og CI-IP 3 celle.. Til sammenligning, Figur 3B viser en analog begivenhed, men nu afbildet af TIRF mikroskopi i en yderligere fyldt med EGTA celle. Overlejrede spor i figur 3C og 3D, illustrerer tilsvarende tidsmæssig (C) og fysisk (D) profiler af begivenheder, der er optaget af WF fluorescens uden EGTA (sort) og ved TIRF mikroskopi med EGTA belastning (rød). Figur 3E plots: målinger af puff amplituder , henfaldstider og rumlig bredde under disse to betingelser, bestemmes ved hjælp af algoritmen til at analysere ca. 44 (WF) og 88 (TIRF) hændelser.

Figur 1
Figur 1: IP -evoked lokal Ca 2 + signaler i SH-SY5Y celler fyldt med Cal-520 og CI-IP 3 afbildet af bred-felt (A til C) og TIRF (D til F) mikroskopi. (A) Monochrome billede af hvilende Cal-520 fluorescens, som puff-steder er angivet med hvide cirkler; skala bar = 10 um. (B) Traces illustrerer sug fremkaldt ved tre forskellige steder, nummereret som i (A). Rød fremhævede begivenheder er pust identificeret at stamme fra det pågældende site. Pilen angiver tidspunktet for UV flash. (C) Overlagte spor af repræsentative Ca2 + drag som dem i (B), på linie og vist på en udvidet skala. (D) monokrom TIRF "fodaftryk" billede af hvilende Cal-520 fluorescens i SH -SY5Y celler fyldt med CI-IP 3 og EGTA. Hvide cirkler betegner puff websted oprindelse. (E) (F) Overlagte spor af repræsentative Ca2 + drag som dem i (E), på linie og vist på en udvidet skala.

Figur 2
Figur 2: brugergrænseflade brugerdefineret kode designet til automatisk at identificere og analysere lokale Ca 2 + signaler i SH-SY5Y celler afbildet af TIRF mikroskopi (A) Åbning dialogboks, hvor identifikation og analyse parametre er indtastet (B) Brugeren vælger en.. . region af billedet, der indeholder ingen celler til at definere det sorte niveau, der subtraheres fra alle rammer i billedstak (C - F). skærmbilleder af endelig / identifikation analyse windows (C) Billede af hvilende Cal-5 20 fluorescens, som overlejres steder, hvor Ca2 + transienter blev identificeret (hvide firkanter). Brugeren kan cykle mellem lokaliteter ved at flytte musen hen over billedet eller trykke på piletasterne. (D) vindue, der viser fluorescens ratio (bf / F 0) spor på den valgte begivenhed. Rød-fremhævet hændelser er identificeret som havende opstået på stedet valgt. Den nederste blå bjælke angiver begivenheder, der overskrider grænsen for detektion på dette sted; begivenheder, som ikke er fremhævet rødt er blevet lokaliseret til et tilstødende sted. Ved at klikke på den blå bjælke fører brugeren til denne begivenhed sted. Hvis du klikker på en rød begivenhed med musen åbner yderligere to vinduer, der viser den tidsmæssige udvikling i begivenheden på en udvidet tidsramme (E) og rumlige profiler (F) for begivenheden i gennemsnit over dennes tidsforløb (til venstre) sammen med den rumlige profil monteret Gauss (højre).e.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Forbedring i tidsmæssig og rumlig troskab af sug billeddannelse opnås ved brug af TIRF mikroskopi i forbindelse med intracellulær belastning af EGTA (A) snapshot billede af en puff fanget på tidspunktet for spidsamplituden, overlejret på en baggrund billede af hvilende fluorescens til. viser cellen omrids. Billedet blev opnået ved WF mikroskopi af en ikke fyldt med EGTA celle. Den pust billede pseudocolored med højere Ca 2+ niveauer betegnet med stigende 'varme' farver. (B) tilsvarende billede af et sug afbildet af TIRF mikroskopi i en fyldt med EGTA celle. (C) Spor, WF (sort) eller TIRF + EGTA (rød), viser den tilsvarende ændring i Cal-520 fluorescence over tid for Ca2 + sug er vist i (A) og (b) ovenfor. Spor normaliseres til samme peak amplitude og tilpasset til deres højdepunkt tid til at lette sammenligningen af ​​deres kinetik. Annotationer illustrerer målinger af Ca 2+ event parametre (amplitude og falde tid) kvantificeret i (E). (D) Traces, WF (sort) eller TIRF + EGTA (rød), viser fluorescensintensiteten for en linje scanne gennem Ca 2 + pust vist i (A) og (B). Liniescanninger normaliseres til deres spidsamplituder og centreret. Den påtegning viser måling af fuld bredde i halv maksimal amplitude (FWHM), som er kvantificeret i (E). (E) søjlediagram, der viser gennemsnitlige maksimale amplituder (øverst), falder gange fra 80% til 20% af top amplitude (midten) og rumlig bredde (FWHM) drag afbildes af WF mikroskopi i celler uden EGTA (åbne søjler) og TIRF mikroskopi i EGTA-loaded celler (grå søjler). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM med en n på mindst 37 dragfor WF og 79 for TIRF. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

A. Group # Begivenhed websted identifikationsnummer
B. GroupX: Mean sub-pixel x placeringen af ​​alle hændelser på et bestemt sted
C. GroupY: Mean sub-pixel y placering af alle hændelser på et bestemt sted
D. Antal begivenheder: Antal begivenheder på et sted i løbet af eksperimentet.
E. Max Amp: Maksimal amplitude af en begivenhed på det pågældende sted (bf / F 0)
F. X: Sub-pixel x lokalisering af begivenhed
G. Y: Sub-pixel vlocalization begivenhed
H. T_peak: Tidspunkt, hvor begivenheden når spidsamplituden (i ramme nummer)
I. Amplitude: Amplitude af alle hændelser fra hver side (bf / F 0)
J. Sigmax: X SD af gaussisk profil monteret på tidsforløbet af begivenhed (i pixel)
K. Sigmay: Y SD af gaussisk profil monteret på tidsforløbet af begivenhed (i pixel)
L. Vinkel: Vinkel af den lange akse af den resulterende elliptiske funktion Gaussisk monteret på tidsforløbet af begivenhed
M. R20: Tid til at stige til 20% af max amplitude (i rammer)
N. R50: Tid til at stige til 50% af max amplitude (i rammer)
O. R80: Tid til at stigetil 80% af max amplitude (i rammer)
P. R100: Tid til at stige til 100% af max amplitude (i rammer)
Q. F80: Tid til at falde til 80% af max amplitude (i rammer)
R. F50: Tid til at falde til 50% af max amplitude (i rammer)
S. F20: Tid til at falde til 20% af max amplitude (i rammer)
T. F0: Tid til at vende tilbage til pre-event baseline (i rammer)

Tabel 1: Output data fra algoritme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver her protokoller til billeddannelse af lokale Ca2 + begivenheder i dyrkede pattedyrceller under anvendelse af fluorescerende Ca2 + indikatorer. Desuden beskriver vi en algoritme med en intuitiv brugergrænseflade, der automatiserer identifikation og analyse af indsamlede data. Den her beskrevne fremgangsmåde udnytter den fluorescerende Ca2 + indikator Cal-520, men mange andre Ca 2+ følsomme farvestoffer, såsom Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 og Oregon Green BAPTA-1 udfører tilstrækkeligt billedet Ca 2+ mikrodomæner. Care behøver at blive taget for at sikre, at de høje affinitet versioner (Kd på ~ 200-400 nm) af disse indikatorer anvendes til at afbilde lokale Ca 2 + mikrodomæner, og de ​​optimale belastningsforhold af disse indikatorer skal bestemmes empirisk for hver celletype, der undersøges. Sagens natur Ca 2 + indikatorer binder Ca 2+ og dermed fungere som Ca 2 + buffere; højere koncentrationer lastning af indicatorer har potentiale til at forstyrre Ca 2+ signaler optages og / eller kan være afsondret i intracellulære organeller, selvom belastningerne er beskrevet her er en god udgangspunkt. Samlet set billeddannelse aktiviteten af lokale Ca 2 + arrangementer er minimalt invasiv og fastholde den indfødte arkitektur af en celle og cytosoliske faktorer, der kan regulere de kanaler, der ligger til grund Ca 2 + mikrodomæner.

Protokollen vi beskriver her for høj opløsning billeddannelse af lokale Ca 2 + signaler ved hjælp af TIRF mikroskopi har den indlysende begrænsning, at den begrænser målinger til begivenheder, der opstår fra Ca 2+ kanaler ligger inden for det flygtige felt. Det er imidlertid ikke kun for kanaler i plasmamembranen, og vi vise dens anvendelighed til kanaler, såsom IP-3 R i intracellulære organeller, der har vist sig at være fortrinsvis placeret tæt til plasmamembranen 12, menellers ville være utilgængelige for elektrofysiologiske optagelse af deres aktivitet i den native cellulære miljø. Konfokal afbildning ville muliggøre billeddannelse af signaler genereret dybere ind i cellen, men har ulemper i forhold til TIRF billeddannelse ved, at tykkelsen af ​​den optiske sektion er bredere (~ 800 nm vs 100-200 nm) og er begrænset i tidsmæssig opløsning af behovet at scanne det konfokale stedet (s). Fordi billedbehandling sker på en epi-fluorescens-tilstand med et omvendt mikroskop, kan optiske optagelser af lokale og single-kanals Ca 2 + signaler let kombineres med samtidig elektrofysiologisk patch-clamp optagelse.

Ved at udtrykke fluorescens Ca2 + signaler i forhold til hvilende fluorescens (bf / F 0) er det muligt at opnå en god relativt mål for signalamplituder. Men vi advarer om, at kalibrering af lokale, forbigående fluorescensændringer målt i absolutte Ca 2 + koncentrationer erikke hensigtsmæssigt. De gradienter af fri [Ca2 +] og Ca 2+ -bundet indikator omkring en Ca2 + release kanal eller klynge af kanaler er smallere end kan løses ved optisk mikroskopi og vil således blive sløret af punktspredningsfunktionen af mikroskopet. Desuden lokal [Ca2 +] i umiddelbar nærhed af kanalen pore vil ændre sig på et mikrosekund tidsskala som kanalen åbner og lukker. Således fluorescenssignalerne giver kun et sløret (i rum og tid) repræsentation af den sande Ca 2+ nanodomain underliggende lokale Ca 2 + signaler 13.

Den her beskrevne stærkt algoritme letter analysen af lokale Ca 2 + signaler fra kamera baseret billeddannelse. Ved at automatisere identifikation og analyse ikke alene er brugerens partiskhed elimineret, men gigabyte billedstakke kan behandles inden for få minutter i en meget parallelt, hvilket giver både tidsmæssige og rumlige data fra flere begivenheder fraen enkelt-celle samtidigt.

Selv om dataene i dette manuskript er præsenteret i forbindelse med IP3 medieret Ca2 + signaler, kan de beskrevne fremgangsmåder let udvides til billeddannelse lokale ændringer i cytosoliske [Ca2 +] udgår fra mange typer af ligand-, anden messenger- og spændingsafhængige Ca 2 + -permeable ionkanaler. Den high-throughput karakter af algoritmen til automatisering identifikation og analyse af lokale Ca2 + arrangementer bør også vise sig at være yderst nyttig til billeddannelse Ca2 + kanalopatier i sygdomstilstande via encellede modeller såsom Alzheimers sygdom og autisme spektrum forstyrrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells ATCC CRL-2266
Cal-520/AM AAT Bioquest Inc. 21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester SiChem cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127 Invitrogen P-3000MP
EGTA/AM Invitrogen E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes MatTek P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  2. Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
  3. Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
  4. Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
  5. Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
  6. Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
  7. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  8. Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
  9. Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
  10. Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
  11. Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
  12. Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
  13. Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).

Tags

Cellebiologi Calcium billedbehandling total intern refleksion mikroskopi algoritme automatisering fluorescens
Imaging Local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i dyrkede pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lock, J. T., Ellefsen, K. L.,More

Lock, J. T., Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (97), e52516, doi:10.3791/52516 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter