Biology

Imagerie Ca locale Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

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Jeffrey T. Lock¹, Kyle L. Ellefsen¹, Bret Settle¹, Ian Parker^1,2, Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

Abstract

Cytosolique ions Ca ²⁺ réglementer de nombreux aspects de l'activité cellulaire dans presque tous les types de cellules, le contrôle des processus aussi variés que la transcription des gènes, excitabilité électrique et la prolifération cellulaire. La diversité et la spécificité de Ca ²⁺ signalisation dérive de mécanismes par lesquels Ca ²⁺ signaux sont générés pour agir sur des échelles de temps et d'espace différentes, allant des oscillations et des vagues large cellulaires survenant au cours des périodes de minutes à transitoires ^{Ca2 +} microdomaines locales (Ca ²⁺⁾ bouffées millisecondes durables. Les progrès récents dans électrons multipliés CCD (EMCCD) caméras permettent désormais pour l'imagerie des signaux Ca ²⁺ locaux avec une résolution spatiale de 128 x 128 pixels à des taux de> 500 cadres sec ^-1 (fps). Cette approche est très parallèle et permet la surveillance simultanée de centaines de chaînes ou d'autres sites feuilletées dans une seule expérience. (1 pe Cependant, les grandes quantités de données générées ca. Gbr min) de rendre l'identification visuelle et l'analyse de Ca ²⁺ locale événements impraticable. Ici, nous décrire et démontrer les procédures pour l'acquisition, la détection et l'analyse des IP locale ₃ médiée Ca ²⁺ signaux dans les cellules mammifères intactes chargés de Ca ²⁺ indicateurs utilisant à la fois grand champ épi-fluorescence (WF) et la réflexion interne totale fluorescence (FRBR) microscopie. En outre, nous décrivons un algorithme développé au sein de l'open-source environnement logiciel Python qui automatise l'identification et l'analyse de ces signaux locaux Ca ^2+. L'algorithme localise les sites de Ca ²⁺ de presse avec une résolution sous-pixel; permet d'avis utilisateur des données; et délivre séquences temporelles de signaux de rapport de fluorescence avec amplitude et données cinétiques dans un tableau Excel compatible.

Introduction

Les ions calcium (Ca2 ⁺⁾ régulent ubiquitaire un large éventail de processus biologiques, y compris l'expression des gènes, la sécrétion et des changements durables dans la plasticité synaptique ^1. Un moyen par lequel Ca ²⁺ peut agir de manière diversifiée est à travers les différentes configurations spatiales et temporelles de Ca ²⁺ signale une cellule peut générer. Par exemple, les élévations mondiaux dans cytosolique [Ca ^2+] déclenchement de la contraction dans le tissu musculaire lisse ² alors plus petit, élévations transitoires localisées (locales ^{Ca2 +)} microdomaines stimuler l'expression de gène essentiel pour l'apprentissage et la mémoire ^3.

Cytosolique libre [Ca ^2+] est maintenue à ~ 100 nM au repos, mais peut rapidement se élever à plusieurs micro-molaire suivante l'afflux de Ca2 ⁺ dans le cytosol par Ca ²⁺ canaux ioniques -permeable situés dans la membrane plasmique et par la libération de Ca ²⁺ intracellulaire de stores. Notre laboratoire se concentre sur le récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R), qui forme un canal de libération ²⁺ Ca situé dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Lors de la liaison à la fois de _IP3 et Ca2 ⁺ cytosolique à l'activation des sites du récepteur, le canal R IP ₃ se ouvre pour libérer Ca2 ⁺ séquestré dans la lumière du RE. La libération de Ca ²⁺ peut rester dans l'espace restreint à un petit groupe de IP ₃ Rs pour générer un microdomaine cytosolique locale de Ca2 ⁺ (Ca ²⁺ feuilletée ⁴⁾ ou, en fonction de la proximité des pôles voisins de IP ₃ Rs, peut propager dans une cellule en recrutant plusieurs sites feuilletées par un processus de Ca ²⁺ induite par Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

L'introduction d'indicateurs les colorants ^de petite molécule fluorescente Ca développé par Roger Tsien ^7, couplé avec la microscopie avancée Imaging techniques, a grandement facilité notre compréhension de Ca ²⁺ signalisation. Les progrès récents en caméras utilisées pour la microscopie permettent désormais pour l'imagerie transitoires locales Ca ²⁺ événements tels que bouffées avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent. Actuellement disponibles caméras EMCCD permettent imagerie avec 128 x 128 pixels à 500 images> ^-1 sec (fps) et la nouvelle génération de semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal (CMOS) caméras offrent une résolution de pixels, et la vitesse encore plus rapide au détriment de légèrement plus élevé des niveaux de bruit. En collaboration avec réflexion totale interne (FRBR) microscopie, il est maintenant possible d'une seule image Ca ²⁺ Les événements de canaux ^8,9. Cette approche permet l'imagerie de centaines de canaux / événements simultanément, tout en générant de grands ensembles de données (environ 1 Go par min) qui rendent le traitement manuel, l'identification visuelle et l'analyse impraticable et placer un fardeau sur le développement d'algorithmes automatisés.

2+ signaux dans les cellules de mammifères en utilisant intactes fluorescentes Ca ²⁺ indicateurs. Nous démontrons en outre un algorithme développé dans l'environnement Python open-source qui automatise l'identification et l'analyse de Ca ²⁺ événements locaux imagés à la fois par la FRBR et large champ épi-fluorescence conventionnelle (WF) microscopie. Bien que nous décrivons ces approches dans le contexte de la PI ₃ -generated signaux ^{Ca2 +,} ils sont facilement prête pour étudier les changements locaux dans cytosolique [Ca ^2+] issues d'une variété de Ca ²⁺ canaux ioniques -permeable situés soit dans la surface ou membrane d'organites intracellulaires ^10/08.

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Protocol

Nous présentons des procédures détaillées pour l'imagerie locales Ca ²⁺ événements dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome humain. Ces procédures peuvent être adaptées à l'image de Ca ²⁺ intracellulaire des signaux dans de nombreux types cellulaires ^10/08.

1. Préparation des cellules

Culture des cellules à imager selon les instructions figurant sur le site Internet de leur fournisseur.
Quelques jours avant l'imagerie, les cellules de récolte cultivées dans un flacon de culture tissulaire en utilisant 1 ml de 0,25% de trypsine / EDTA (2-3 min). À la suite de détachement, ajouter un volume égal de milieu de culture pour inactiver la trypsine.
Effectuer une numération cellulaire en utilisant un hémocytomètre et de semences cellules dans des boîtes d'imagerie à fond de verre à une densité de 3-7 x 10 ⁴ cellules par boîte. Sélectionnez les cellules pour des expériences d'imagerie quand ils atteignent 60% de confluence (2-3 jours).

2. Préparation des solutions et réactifs

Préparer un Ca ²⁺ contenant tamponnée HEPESsolution de sel (Ca ²⁺ -HBSS), composée de (mM): NaCl 135, KCl 5,4, CaCl 2 _2, MgCl ₂ 1, HEPES 10, 10 et glucose; pH = 7,4 à la température ambiante (TA) avec NaOH. Préparer Ca ²⁺ -HBSS sans l'ajout de glucose et conserver à 4 ° C; ajouter à la solution de glucose immédiatement avant l'utilisation.
Solubiliser les formes de la Ca ²⁺ indicateur fluorescent Cal-520 (1 mM) infiltrant les membranes, ci-IP ₃ (200 uM), et EGTA (100 mM) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 20% de Pluronic F-127. Aliquoter ces réactifs dans des tubes Eppendorf et magasin, à l'abri de l'humidité et de la lumière, à -20 ° C.

3. Les cellules de chargement avec infiltrant les membranes Cal-520, ci-IP ₃ et EGTA

Préparer le "tampon de chargement" par dilution de solutions mères de infiltrant les membranes Cal-520 et CI-IP ₃ à une concentration finale de 5 uM et 1 uM, respectivement, dans -HBSS Ca2 ^+.
Aspirer cumédias LTURE et rincer les cellules en remplaçant médias Ca ²⁺ -HBSS trois fois.
Retirer Ca ²⁺ -HBSS et incuber les cellules dans un tampon de chargement pendant 60 min à température ambiante dans l'obscurité.
Éliminer le tampon de chargement et rincer les cellules en remplaçant médias Ca ²⁺ -HBSS trois fois.
1. Si vous le souhaitez, à cette étape, les cellules de charge avec EGTA / AM en diluant la solution mère à une concentration finale de 5 uM dans Ca ²⁺ -HBSS et puis incuber les cellules pendant 30-60 min à température ambiante dans l'obscurité. Après cette incubation, rincer les cellules trois fois avec Ca ²⁺ -HBSS avant de procéder à l'étape 3.5.
Incuber les cellules à Ca ²⁺ -HBSS de 30 min pour permettre la désestérification de réactifs chargés.
Immédiatement avant l'imagerie, remplacer le Ca2 ⁺ avec -HBSS "frais" Ca ²⁺ -HBSS afin d'éliminer tout colorant qui aurait fui dans le bain au cours de l'incubation finale.

4. Ca ²⁺

Placer une petite goutte d'huile d'immersion sur l'objectif 100X APO FRBR (NA 1,49).
Monter le plat d'imagerie sur la scène du microscope inversé et amener les cellules au point en utilisant la lumière transmise. Il est important de fixer la capsule d'imagerie pour empêcher tout mouvement pendant l'enregistrement.
Illuminer les cellules avec un laser 488 nm afin d'exciter Cal-520 et collecter la fluorescence émise (λ> 510 nm) en utilisant une caméra EMCCD à grande vitesse.
REMARQUE: Le logiciel qui fonctionne le microscope permet à l'utilisateur de traduire une lentille de focalisation permettant le faisceau laser à introduire soit à l'extrême bord de l'ouverture de retour objectif (de la FRBR excitation) ou plus au centre (pour l'excitation "WF").
Utilisation du logiciel EMCCD, réduire le champ d'imagerie des pleins 512 x 512 pixels afin de recueillir des données à la résolution temporelle nécessaire pour capturer locales Ca ²⁺ événements.
REMARQUE: Par exemple, quad centreacquisition de 256 x 256 pixels accélère la vitesse d'acquisition à 66 fps. Il est également possible d'augmenter encore la fréquence d'images de la caméra EMCCD 500 fps en utilisant une fonction du mode de récolte isolé.
Configurer le logiciel pour enregistrer automatiquement quelques secondes de l'activité de base, offrir un flash UV aux cellules et continuer à enregistrer pour un autre 10 à 30 sec.
REMARQUE: Un flash UV est fourni en utilisant une source de lumière à arc au xénon introduit à travers un miroir réfléchissant les UV dichroïque dans l'orifice arrière du microscope. La durée et l'intensité du flash UV est ajusté empiriquement pour évoquer une fréquence souhaitée des locaux Ca ²⁺ événements.
Enregistrer les fichiers que l'image des piles pour l'analyse hors ligne.

5. Analyse automatisée Ca ²⁺ Image

NOTE: Il est possible de visualiser, traiter et analyser les données capturées en utilisant de nombreux logiciels commerciaux. Cependant, nous avons développé un algorithme pour automatiser l'identification rapide d'uneanalyse de ^{Ca2 +} d de signaux locaux. Une description détaillée des filtres spatiales et temporelles utilisées dans cet algorithme, la génération des AF / F ₀ et l'identification / analyse des routines peut être trouvée dans ^11. Cet algorithme a été développé pour fonctionner sur la plate-forme open-source du logiciel Python, et peut être obtenu, avec l'échantillon de données expérimentales et les instructions d'utilisation détaillées, en envoyant un courriel de l'auteur correspondant (ismith@uci.edu).

Convertir des fichiers à importer dans l'algorithme écrite sur mesure pour le format de fichier de la multi-plan.
Localisez le dossier contenant l'algorithme d'analyse et double cliquez sur le run.exe.
Sélectionnez le fichier .tiff à analyser.
Choisissez les paramètres d'analyse dans la boîte de dialogue ouverte. Voir la figure 2A pour les paramètres par défaut pour les données d'échantillon.
Déterminer le niveau de noir à être décalée par rapport à la pile de l'image en déplaçant le curseur sur une partie du champ de vue qui ne nOT contient une cellule (voir la figure 2B) ou en saisissant manuellement un niveau de noir à l'aide de l'invite «Black Level Set '.
Observez quatre fenêtres sur l'écran après analyse par le logiciel (figure 2C-F). C est une image monochrome de repos fluorescence à partir de cellules en cours d'analyse. Les carrés blancs superposés sur cette image sont des lieux d'événements déterminés, que les positions barycentre de fonctions gaussiennes deux dimensions montés sur les événements.
Cliquez sur chaque lieu de l'événement ou appuyez sur les touches de curseur pour faire défiler les événements. En faisant ainsi l'arrière-plan soustrait, gaussien lissée changements de rapport de fluorescence (AF / F) ₀ à chaque mise à jour de ces sites dans la fenêtre D.
REMARQUE: Rouge souligné les événements sont déterminés à provenir de ce site particulier et non pas de «purge-through 'de l'activité localisée à des sites adjacents. La trace bleue inférieure indique l'endroit où le signal de fluorescence sur le site choisi dépassé la détectionseuil, alors que la ligne noire identifie les événements provenant de ce site particulier (correspondant à la couleur rouge des événements mis en évidence).
Cliquer sur un événement en surbrillance rouge pour mettre à jour la fenêtre E qui affiche l'évolution temporelle de l'événement, et la fenêtre F qui présente le profil spatial de l'événement en moyenne sur son évolution dans le temps, ainsi que le profil spatial de la fonction gaussienne équipée.
Examiner manuellement les événements qui ont été identifiés à ce que les artefacts peuvent être rejetés de l'analyse. Supprimer ces événements en cliquant droit sur le rouge souligné événements.
NOTE: Dans nos mains, flux de Ca2 ⁺ par des voies simples IP ₃ R évoque des signaux avec AF / F ₀ environ 0,11, sont donc susceptibles d'être de faux positifs des «événements» détectés sensiblement plus petites que cela.
Exporter des données en sélectionnant «Enregistrer sur Excel» ou exporter des données sur une base par cellulaire en dessinant autour de la cellule d'intérêt et en sélectionnant «Enregistrer CellR17 ;.
Note: Les données sont enregistrées dans le même dossier que la pile de l'image originale.

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Representative Results

Figure 1A montre une image WF de repos Cal-520 fluorescence dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y humains également chargé avec ₃ ci-IP. L'exposition de ces cellules à un flash 100 UV msec à la photo-presse i-IP ₃ a suscité transitoires ^{Ca2 +} bouffées sur des sites discrets (relevées par les cercles blancs sur la figure 1A). traces de fluorescence mesurée à ces sites ont montré une phase de montée rapide en raison d'ouvertures de passage de IP ₃ Rs, suivie d'une baisse beaucoup plus lente phase (figure 1B et 1C) comme ^Ca2 + diffuse lentement loin du site de libération. Rouge a mis en évidence les événements de la figure 1B sont les signaux ^de Ca qui ont été déterminés par l'algorithme pour provenir de l'emplacement choisi. Evénements non-surlignées représentent contaminer Ca ²⁺ signaux de diffusion à partir de sites étroitement adjacentes.

Pour atteindre une résolution supérieure imagerie de Ca locale + tampon EGTA. Ce chélate ions Ca ²⁺ de diffusion entre les sites bouffantes et empêche la génération de Ca ²⁺ mondiaux vagues qui masquer l'étude de Ca ²⁺ bouffées locales générées par groupes individuels de IP ₃ Rs ainsi. En outre, l'EGTA accélère l'effondrement de la section locale Ca ²⁺ microdomaine mais, en raison de ses cinétique de liaison lente, perturbe peu Ca libre locale ²⁺ et sa liaison au Ca ²⁺ indicateur rapide d'un cluster. L'effet net de EGTA est à «affiner» les dossiers de fluorescence des bouffées dans l'espace et le temps, sans diminuer sensiblement leur amplitude. Une autre amélioration de la résolution se pose en utilisant la FRBR à limiter excitation des fluorophores Cal-520 à l'étroite (<100 nm) onde évanescente créée par la FRBR. La somme de ces deux approches est une technique qui surveille efficacement instantanée Ca ²⁺ 2+ actuelle) plutôt que d'une fuite intégrante de Ca ²⁺ après qu'il est libéré par les _trois Rs IP et diffuse lentement à partir du site de libération et est finalement séquestré ^neuf. Figure 1D montre la FRBR «empreinte» de une cellule SH-SY5Y lorsque Cal-520 fluorophores excités étaient seulement à une distance étroite dans la cellule à partir de la / interface de solution aqueuse de couvre-objets. Rapid liaison de Ca ²⁺ à l'indicateur rapide Cal-520 colorant dans les volumes attoliter cytosoliques créés par illumination FRBR, en conjonction avec EGTA à «vadrouille 'up diffusion Ca ^2+, signaux rendements de fluorescence qui sont aiguisés à la fois dans le temps et dans l'espace ( la figure 1E et 1F).

L'analyse des piles d'images capturé de cette manière est grandement facilitée grâce à un algorithme personnalisé écrite développé dans notre laboratoire en marche sur la plate-forme open-source du logiciel Python ¹¹. La figure 2A montre la boîte de dialogue d'ouverture dans laquelle l'utilisateur saisit les paramètres à utiliser pour l'identification et l'analyse subséquente des piles d'images. Suite à cela, l'utilisateur est invité à sélectionner un niveau de noir à soustraire de l'ensemble de la pile d'image après quoi identification et d'analyse algorithme pistes figure 2C-F montrent, respectivement, les sites de subcellulaires ²⁺ Ca presse locale. l'activité sur les sites sélectionnés; épreuves individuelles sur une échelle de temps élargi; et profils spatiaux d'événements représentatifs (voir Figure 2 légende pour plus de détails). Après examen de l'utilisateur des sites identifiés, analysé des données pour tous les événements (voir le tableau 1) peuvent être exportés en sélectionnant la fonction «Enregistrer au format Excel.

Figure 3 présente des données illustrant à la fois l'amélioration de la résolution obtenue par imagerie FRBR dans les cellules EGTA-chargés par rapport à l'imagerie WF dans les cellules non chargées, et peurs de l'algorithme à identifier et analyser Ca ²⁺ signaux locaux. La figure 3A montre un événement local représentant imagée par WF dans une cellule chargée seulement avec Cal-520 et CI-IP _3. Pour comparaison, la figure 3B montre un événement analogue mais maintenant imagée par microscopie FRBR dans une cellule en outre chargé avec EGTA. Traces superposées dans la figure 3C et 3D, illustrent correspondant profils d'événements enregistrés par WF fluorescence sans EGTA (noir) et par microscopie FRBR avec EGTA chargement (rouge) temporelle (C) et spatiale (D). Figure 3E parcelles signifient mesures d'amplitudes bouffantes , temps de décroissance et la largeur spatiale en vertu de ces deux conditions, déterminées en utilisant l'algorithme pour analyser environ 44 (WF) et 88 (FRBR) événements.

Figure 1: IP -evoked Ca ²⁺ locale signaux dans les cellules SH-SY5Y chargés de l'image monochrome de Cal-520 et CI-IP ₃ imagé par grand champ (A à C) et la FRBR (D à F) microscopie. (A) repos Cal-520 fluorescence sur lequel l'emplacement des sites feuilletée sont désignés par des cercles blancs; échelle = 10 um. (B) Traces illustrent bouffées évoqués sur trois sites différents, numérotés comme dans (A). Rouge souligné événements sont bouffées identifiés pour avoir provenu de ce site particulier. La flèche indique le temps de flash UV. (C) Les traces superposées de représentatifs Ca ²⁺ bouffées comme ceux de (B), alignés et montré sur une échelle élargie. «Empreinte» Image monochrome FRBR de repos Cal-520 fluorescence dans SH (D) -SY5Y cellules chargées avec ci-IP ₃ et EGTA. Les cercles blancs indiquent les origines du site feuilletée. (E) (F) de traces superposées de Ca ²⁺ représentatifs bouffées comme ceux de (E), alignés et montré sur une échelle élargie.

Figure 2: Interface utilisateur du code personnalisé conçu pour identifier et analyser automatiquement ²⁺ signaux Ca locales dans les cellules SH-SY5Y imagées par microscopie TIRF (A) boîte de dialogue où les paramètres d'identification et d'analyse sont saisis d'ouverture (B) L'utilisateur sélectionne un.. . la région de l'image qui ne contient aucune cellule de définir le niveau de noir qui est soustraite des tous les cadres de la pile d'images (C - F). Captures d'écran des fenêtres finale d'analyse / d'identification (C) Image de repos Cal-5 20 fluorescence sur lequel se superposent des endroits où Ca ^{2 +} transitoires ont été identifiés (carrés blancs). L'utilisateur peut naviguer entre les sites en déplaçant la souris sur l'image ou en appuyant sur les touches de curseur. (D) Fenêtre montrant rapport de fluorescence (AF / F ₀₎ trace à l'événement sélectionné. Événements en rouge en surbrillance sont identifiés comme ayant surgi sur le site choisi. La barre bleue inférieure indique des événements qui dépassent le seuil de détection sur ce site; des événements non surlignées en rouge ont été localisés à un site adjacent. En cliquant sur la barre bleue prend à l'utilisateur de ce site de l'événement. En cliquant sur un événement rouge avec la souris ouvre deux autres fenêtres montrant l'évolution temporelle de l'événement sur une échelle de temps étendue (E) et les profils spatiaux (F) de l'événement en moyenne sur son évolution dans le temps (à gauche) avec le profil spatial de gaussien équipée (à droite).e.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Amélioration de la fidélité temporelle et spatiale de l'imagerie feuilletée obtenue par utilisation de microscopie TIRF en liaison avec le chargement intracellulaire de EGTA (A) image instantanée d'une bouffée capturé au moment de l'amplitude crête, superposée sur une image de fond de se reposer fluorescence. montrer le contour de la cellule. L'image a été obtenue par microscopie WF d'une cellule ne est pas chargé avec EGTA. L'image de bouffée est pseudocolored, avec plus élevés Ca ²⁺ niveaux de plus en plus désignés par des couleurs chaudes ''. (B) image d'une bouffée imagée par microscopie FRBR dans une cellule chargée de EGTA correspondant. (C) Traces, WF (noir) ou FRBR + EGTA (rouge), montrent l'évolution correspondante de Cal-520 fluorescence dans le temps pour les Ca ²⁺ bouffées indiqués en (A) et (B) ci-dessus. Traces sont normalisées à la même amplitude crête et alignés à leur heure de pointe pour faciliter la comparaison de leur cinétique. Annotations illustrent mesures de Ca ²⁺ paramètres d'événement (amplitude et le temps tombent) déterminée en (E). (D) Traces, WF (noir) ou FRBR + EGTA (rouge), montrent l'intensité de fluorescence d'une ligne de balayage par le Ca ^{2 +} bouffées indiqués dans (A) et (B). balayages de lignes sont normalisées à leurs amplitudes de pointe, et centrés. L'annotation montre la mesure de largeur à mi-amplitude maximale (LMH), telle que quantifiée sur (E). (E) Bar des graphiques montrant amplitudes maximales moyennes (en haut), tombent parfois de 80% à 20% d'amplitude crête (au milieu), et la largeur spatiale (LMH) de bouffées imagées par WF microscopie dans les cellules sans EGTA (bars ouverts) et par microscopie FRBR dans les cellules EGTA-chargé (barres grises). Les données sont présentées comme moyenne ± SEM avec un n d'au moins 37 boufféespour WF et 79 de la FRBR. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

A.	Groupe #	Événement numéro d'identité du site
B.	GroupeX:	Moyenne sous-pixel x emplacement de tous les événements sur un site particulier
C.	Groupy:	Moyenne sous-pixel Emplacement y de tous les événements sur un site particulier
D.	Evénements No.:	Nombre d'événements se produisant sur un site au cours de l'expérience.
E.	Max Amp:	Amplitude maximale d'un événement à ce site particulier (AF / F ₀₎
F.	X:	Sous-pixel x localisation de l'événement
G.	Y:	Sous-pixel ylocalization d'événement
H.	T_peak:	Heure à laquelle l'événement atteint amplitude crête (en nombre d'images)
I.	Amplitude:	Amplitude de tous les événements provenant de chaque site (AF / F ₀₎
J.	Sigmax:	X SD du profil gaussien équipant cours du temps de l'événement (en pixels)
K.	Sigmay:	Y SD du profil gaussien équipant cours du temps de l'événement (en pixels)
L.	Angle:	Angle de l'axe long de l'ellipse résultant de fonction gaussienne monté sur décours temporel de l'événement
M.	R20:	Temps de se élever à 20% du maximum d'amplitude (en images)
N.	R50:	Temps de se élever à 50% du maximum d'amplitude (en images)
O.	R80:	Temps de se leverà 80% du maximum d'amplitude (en images)
P.	R100:	Temps de se élever à 100% de l'amplitude maximale (en images)
Q.	F80:	Le temps de tomber à 80% du maximum d'amplitude (en images)
R.	F50:	Le temps de tomber à 50% du maximum d'amplitude (en images)
S.	F20:	Le temps de tomber à 20% du maximum d'amplitude (en images)
T.	F0:	Il est temps de revenir à pré-événement de référence (en images)

Tableau 1: Données de sortie de l'algorithme.

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Discussion

Nous décrivons ici les protocoles pour l'imagerie locales Ca ²⁺ événements dans des cellules de mammifères cultivées en utilisant fluorescentes Ca ²⁺ indicateurs. En outre, nous décrivons un algorithme avec une interface utilisateur intuitive qui automatise l'identification et l'analyse des données acquises. La procédure décrite ici utilisent le Ca ²⁺ fluorescente indicateur Cal-520, mais beaucoup d'autres colorants Ca ²⁺ sensibles comme Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 et Oregon Green BAPTA-1 effectuer suffisamment bien à l'image de Ca ²⁺ microdomaines. Ne ont besoin de soins à prendre pour se assurer que les versions haute affinité _{(K d} de ~ 200-400 nm) de ces indicateurs sont utilisés pour l'image locales Ca ²⁺ microdomaines, et les conditions de chargement optimales de ces indicateurs doivent être déterminées empiriquement pour chaque type de cellule à l'étude. De par leur nature Ca ²⁺ indicateurs lient Ca ²⁺ et ainsi agir comme ^{Ca2 +} tampons; concentrations de chargement plus élevés de indicateurs ont le potentiel d'interférer avec les signaux ^de Ca en cours d'enregistrement et / ou peuvent être séquestrés dans des organites intracellulaires, bien que les conditions de chargement décrites ici sont un bon point de départ. Dans l'ensemble, l'imagerie de l'activité de Ca ²⁺ événements locaux est peu invasive, en conservant l'architecture native d'une cellule et les facteurs cytosoliques qui peuvent réguler les canaux de ^{Ca2 +} qui sous-tendent les microdomaines.

Le protocole que nous décrivons ici pour imagerie à haute résolution de Ca ²⁺ signaux locaux en utilisant la microscopie de la FRBR a la limite évidente en ce qu'elle restreint mesures à des événements qui surviennent à partir des canaux ^de Ca situées dans le champ évanescent. Toutefois, il ne est pas limité seulement à des canaux dans la membrane plasmique, et nous démontrons son applicabilité à des canaux tels que le IP ₃ R dans des organites intracellulaires qui se sont révélés être de préférence situé à proximité de la membrane plasmique mais ¹²seraient autrement inaccessibles à l'enregistrement électrophysiologique de leur activité dans l'environnement cellulaire natif. Imagerie confocale permettrait imagerie générée de signaux plus profondément dans la cellule, mais présente des inconvénients par rapport à l'imagerie TIRF en ce que l'épaisseur de la coupe optique est plus large (~ 800 nm vs 100 à 200 nm) et est limitée par la résolution temporelle par la nécessité pour balayer l'endroit (s) confocale. Parce que l'imagerie se fait dans un mode épi-fluorescence à l'aide d'un microscope inversé, enregistrements optiques de Ca ²⁺ signaux locaux et un seul canal pourraient facilement être combinés avec simultanée électrophysiologique enregistrement patch-clamp.

En exprimant les signaux de fluorescence de ^{Ca2 +} en tant que rapport de fluorescence de repos (AF / F _0), il est possible d'obtenir une bonne mesure relative de l'amplitude des signaux. Cependant, nous tenons à préciser que l'étalonnage des changements de fluorescence transitoires locales en termes absolus de Ca ²⁺ concentrations est lane convient pas. Les gradients de libre indicateur liØe [Ca ^2+] et Ca ²⁺ autour d'un canal ou un groupe de canaux de presse Ca ²⁺ est plus étroite que peut être résolu par microscopie optique et sera donc floue par la fonction d'étalement de point du microscope. En outre, locale [Ca ^2+] dans le proche voisinage de la pore du canal va changer sur une échelle de temps de la microseconde que le canal se ouvre et se ferme. Ainsi, les signaux de fluorescence ne fournissent qu'une floue (dans l'espace et le temps) la représentation du vrai Ca ²⁺ nanodomaine sous-jacente locales Ca ²⁺ signaux ^13.

L'algorithme décrit ici facilite grandement l'analyse des signaux locaux de Ca ²⁺ de formation d'image sur la base de la caméra. En automatisant l'identification et l'analyse non seulement biais d'utilisateur éliminée, mais gigaoctets de piles d'images peut être traité en quelques minutes d'une manière hautement parallèle, ce qui donne deux données temporelles et spatiales provenant de plusieurs événements deune seule cellule simultanément.

Bien que les données dans ce manuscrit sont présentés dans le contexte de la propriété intellectuelle ₃ -médiée Ca ²⁺ signaux, les approches décrites peuvent être facilement étendus à l'imagerie changements locaux cytosolique [Ca ^2+] émanant de nombreux types de ligand, deuxième Messenger- Ca ²⁺ et canaux ioniques -permeable voltage-dépendants. La nature à haut débit de l'algorithme pour l'identification automatisation et l'analyse des locaux Ca ²⁺ événements devrait également se avérer très utile pour l'imagerie Ca ²⁺ canalopathies en états pathologiques via des modèles mono-cellulaires telles que la maladie et l'autisme le trouble du spectre de la maladie d'Alzheimer.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP₃(D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C