Abstract
Zytosolischen Ca 2+ -Ionen regulieren zahlreiche Aspekte der Zellaktivität in fast allen Zelltypen, Kontrollprozesse, wie vielfältig wie Gen-Transkription, elektrischen Erregbarkeit und Zellproliferation. Die Vielfalt und Besonderheit der Ca 2+ Signal leitet sich von Mechanismen, durch die Ca 2+ Signale erzeugt werden, um über verschiedene Zeit- und Raumskalen wirken, von der Zelle weiten Schwingungen und Wellen über die Perioden von Minuten, um lokale transiente Ca 2+ Mikrodomänen auftreten (Ca 2+ Hauche) anhalt Millisekunden. Jüngste Fortschritte in der Elektronen multipliziert CCD (EMCCD) Kameras jetzt Bildgebung von lokalen Ca 2+ Signale mit einem 128 x 128 Pixel Ortsauflösung ermöglichen mit Raten von> 500 Bilder sec -1 (fps). Dieser Ansatz ist sehr parallel und ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Hunderten von Kanälen oder Blätterteig Stellen in einem einzigen Experiment. Doch die große Datenmengen generiert (ca. 1 GB per min) machen visuelle Identifizierung und Analyse der lokalen Ca 2+ Ereignisse nicht praktikabel. Hier beschreiben und zeigen die Verfahren für die Erfassung, Erkennung und Analyse der lokalen IP 3 vermittelte Ca 2+ Signale in intakten Säugerzellen mit Ca 2+ Indikatoren sowohl mit Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz (WF) und Totalreflexion geladen Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie. Darüber hinaus beschreiben wir einen Algorithmus in der Open-Source-Software-Umgebung Python, die die Identifizierung und Analyse dieser lokalen Ca 2+ Signale automatisiert entwickelt. Der Algorithmus lokalisiert Websites von Ca 2+ Freisetzung mit Subpixel-Auflösung; ermöglicht dem Benutzer Überprüfung der Daten; und gibt Zeitsequenzen der Fluoreszenzverhältnissignale mit Amplituden und kinetische Daten in einer Excel-Tabelle kompatibel.
Introduction
Calciumionen (Ca 2+) ubiquitär regulieren ein breites Spektrum von biologischen Prozessen, einschließlich Genexpression, Sekretion und dauerhafte Veränderungen in der synaptischen Plastizität 1. Ein Weg, durch welche Ca 2+ in einer vielfältigen Art und Weise wirken, ist durch die unterschiedliche räumliche und zeitliche Muster von Ca 2+ signalisiert eine Zelle erzeugen kann. Zum Beispiel globale Erhebungen in zytosolischen [Ca 2+] Trigger Kontraktion in glatten Muskulatur 2 während kleinere, lokale vorübergehende Erhöhung (lokalen Ca 2+ Mikrodomänen) zu stimulieren Genexpression essentiell für Lernen und Gedächtnis 3.
Freien cytosolischen [Ca 2+] liegt bei ~ 100 nM in Ruhe gehalten wird, kann jedoch schnell zu mehreren Mikro molaren nach der Einstrom von Ca 2+ in das Cytosol steigen durch Ca 2+ durchlässige Ionen-Kanäle in der Plasmamembran und befindet die Freisetzung von Ca2 + aus intrazellulären stores. Unser Labor konzentriert sich auf den Inositol-1,4,5-triphosphat-Rezeptor (IP 3 R), das eine Ca 2+ -Freisetzung Kanal im endoplasmatischen Retikulum (ER) membran bildet. Bei der Bindung von sowohl IP 3 und Ca 2+ auf die cytosolische Aktivierung Stellen des Rezeptors, öffnet das IP 3 R-Kanal zu befreien Ca 2+ in das ER-Lumen sequestriert. Die Freisetzung von Ca 2+ räumlich auf eine kleine Gruppe von IP 3 Rs begrenzt bleiben, um eine lokale Mikrodomäne cytosolischen Ca 2+ zu erzeugen (Ca 2+ puff 4) oder, abhängig von der Nähe der benachbarten Clustern von IP 3 R, kann verbreiten sich eine Zelle durch die Rekrutierung von mehreren puff Websites durch einen Prozess der Ca 2+ -induzierte Ca 2+ -Freisetzung (CICR) 5,6.
Die Einführung von Kleinmolekül-Fluoreszenz-Ca 2+ Indikatorfarbstoffe von Roger Tsien entwickelte 7, verbunden mit modernster Mikroskopie imaging Techniken hat erheblich erleichtert unser Verständnis von Ca 2+ Signalisierung. Jüngste Fortschritte in der Kameras für die Mikroskopie verwendet nun zur Abbildung vorübergehenden lokalen Ca 2+ Ereignisse wie Windbeutel mit beispielloser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu ermöglichen. Derzeit verfügbare EMCCD-Kameras ermöglichen Bildgebung mit 128 x 128 Pixeln bei> 500 Bilder sec -1 (fps) und die neue Generation der komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) Kameras bieten eine höhere Pixel-Auflösung und sogar höhere Geschwindigkeit auf Kosten etwas höher Geräuschpegel. In Verbindung mit der Totalreflexion (TIRF) Mikroskopie ist es nun möglich, einzelne Bild Ca 2+ Kanalereignisse 8,9. Dieser Ansatz ermöglicht die Abbildung von Hunderten von Kanälen / Ereignisse gleichzeitig, während die Erzeugung von großen Datenmengen (ca. 1 GB pro Minute), die manuelle Bearbeitung, visuelle Identifizierung und Analyse machen unpraktikabel und setzen Sie eine Last auf die Entwicklung von automatisierten Algorithmen.
2+ Signale in intakten Säugerzellen unter Verwendung von fluoreszierenden Ca 2+ Indikatoren präsentieren wir. Wir zeigen ferner einen Algorithmus in der Open-Source-Umfeld Python, die Identifikation und Analyse von lokalen Ca 2+ Ereignisse sowohl von TIRF und konventionellen Weitfeld-Auflicht-Fluoreszenz (WF) Mikroskopie abgebildet automatisiert entwickelt. Obwohl wir beschreiben diese Ansätze im Zusammenhang mit der IP 3 -generated Ca 2+ Signalen leicht zu einer lokalen Veränderung in cytosolische [Ca 2+] aus einer Vielzahl von Ca 2+ ausgeh -durchlässigen Ionenkanäle entweder in der Oberfläche angeordnet zu untersuchen sind Membran oder intrazellulären Organellen 8-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wir stellen detaillierte Verfahren zur Abbildung lokalen Ca 2+ Ereignisse in menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen. Diese Verfahren können zur Bild intrazellulärem Ca 2+ Signale in vielen Zelltypen 8-10 anpassen.
1. Herstellung der Zellen
- Kultur die Zellen gemäß den Anweisungen auf der Website ihren Lieferanten aufgeführt abgebildet werden.
- Einige Tage vor der Bilderzeugung, Ernten der Zellen in einem Gewebekulturkolben unter Verwendung von 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (2-3 min) gezüchtet. Nach Ablösung, dasselbe Volumen der Kulturmedien, um das Trypsin zu inaktivieren.
- Führen Sie eine Zellzahl mit einer Zählkammer und Samenzellen in Glasboden Bildgebung Schalen in einer Dichte von 3-7 × 10 4 Zellen pro Schale. Wählen Sie die Zellen, die für Imaging-Experimente, wenn sie erreichen 60% Konfluenz (2-3 Tage).
2. Herstellung von Lösungen und Reagenzien
- Bereiten Sie eine Ca 2+ -haltige HEPES gepuffertSalzlösung (Ca 2+ -HBSS) von (mM) aus: 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES und 10 Glucose; pH = 7,4 bei Raumtemperatur (RT) mit NaOH. Bereiten Ca 2+ -HBSS ohne die Zugabe von Glucose und bei 4 ° C; Zugeben von Glukose zu der Lösung unmittelbar vor der Verwendung.
- Löslich membrangängige Form des fluoreszierenden Ca 2+ Indikator Cal-520 (1 mM), CI-IP 3 (200 uM) und EGTA (100 mM) in Dimethylsulfoxid (DMSO), die 20% Pluronic F-127. Aliquot dieser Reagenzien in Eppendorf-Röhrchen und lagern, vor Feuchtigkeit und Licht geschützt, bei -20 ° C.
3. Loading-Zellen mit membrangängige Cal-520, ci-IP 3 und EGTA
- Bereiten Sie die "Ladepuffer" durch Verdünnen Stammlösungen von membrangängige Cal-520 und ci-IP 3 bis zu einer Endkonzentration von 5 uM und 1 & mgr; M, in Ca 2+ -HBSS.
- Saugen Sie culture Medien und spülen Zellen durch Ersatz von Medien mit Ca 2+ -HBSS dreimal.
- Entfernen Ca 2+ -HBSS inkubieren Zellen in Ladepuffer für 60 min bei RT im Dunkeln.
- Entfernen Ladepuffer und spülen Zellen durch Ersatz von Medien mit Ca 2+ -HBSS dreimal.
- Falls gewünscht, kann in diesem Schritt, Wägezellen mit EGTA / AM durch Verdünnen der Stammlösung auf eine Endkonzentration von 5 & mgr; M Ca 2+ -HBSS und dann inkubieren Zellen 30-60 min bei RT im Dunkeln. Im Anschluss an diese Inkubation spülen Zellen dreimal mit Ca 2+ -HBSS bevor Sie mit Schritt 3.5.
- Zellen in Ca 2+ -HBSS Inkubation 30 min zur Entesterung von belasteten Reagenzien ermöglichen.
- Unmittelbar vor der Abbildungs Ersetzen Ca 2+ -HBSS mit "frischen" Ca 2+ -HBSS um jeden Farbstoff, der in der letzten Inkubation in das Bad ausgetreten sind, beseitigt werden.
4. Ca 2+
- Setzen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die 100X APO TIRF Ziel (NA 1,49).
- Montieren Sie die Bildform auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die Zellen in den Fokus im Durchlicht. Es ist wichtig, um die Abbildungsschale, um eine Bewegung während der Aufnahme zu verhindern sichern.
- Beleuchten Zellen mit einem 488 nm Laser, um Cal-520 erregt und sammeln emittierte Fluoreszenz (λ> 510 nm) unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits EMCCD- Kamera.
HINWEIS: Die Software, die das Mikroskop arbeitet erlaubt dem Benutzer, eine Fokussierlinse ermöglicht den Laserstrahl eingebracht werden, entweder an der äußersten Kante der Objektivrücköffnung (für TIRF Anregung) oder mehr in der Mitte (bei "WF" Anregung) zu übersetzen. - Mit der EMCCD-Software, reduzieren Sie die Bildfeld aus den vollen 512 x 512 Pixel, um Daten in der erforderlichen zeitlichen Auflösung zu sammeln, um lokalen Ca 2+ Ereignisse zu erfassen.
HINWEIS: Zum Beispiel Zentrum QuadErwerb von 256 x 256 Pixel beschleunigt die Erfassungsrate bis 66 fps. Es ist auch möglich, die Bildrate des EMCCD Kamera zu 500 Bildern pro Sekunde weiter zu erhöhen mit einem Isolated Crop-Modus-Funktion. - Konfigurieren Sie die Software, um automatisch ein paar Sekunden der Grundaktivität, liefern einen UV-Blitz, um die Zellen und fährt mit der Aufnahme für ein weiteres 10 bis 30 sec.
HINWEIS: Ein UV-Blitz wird mit einer durch eine UV-reflektierenden dichroitischen Spiegel in den rückseitigen Anschluss des Mikroskops eingeführt Xenon-Bogenlichtquelle geliefert. Die Dauer und Intensität der UV-Blitz wird empirisch eingestellt, um eine gewünschte Frequenz des lokalen Ca 2+ Ereignisse hervorrufen. - Speichern von Dateien als Bildstapel für die Offline-Analyse.
5. Automatische Ca 2+ Bildanalyse
HINWEIS: Es ist möglich, zu sehen, zu verarbeiten und zu analysieren, die erfassten Daten mit vielen kommerziellen Softwarepaketen. Jedoch haben wir einen Algorithmus, um schnell zu automatisieren Identifikations eine entwickelted Analyse der lokalen Ca2 + Signale. Eine detaillierte Beschreibung der räumlichen und zeitlichen Filter in diesem Algorithmus verwendet wird, kann die Erzeugung von & Dgr; F / F 0 und Identifizierung / Auswerteroutinen in 11 gefunden werden. Dieser Algorithmus wurde entwickelt, um auf dem Open-Source-Software-Plattform Python ausführen und erhalten werden, zusammen mit Beispiel experimentellen Daten und ausführliche Gebrauchsanweisung, per E-Mail an den entsprechenden Autor (ismith@uci.edu).
- Konvertieren von Dateien in das speziell geschriebenen Algorithmus, um die Mehrebenen-TIFF-Datei-Format importiert werden.
- Suchen Sie den Ordner mit der Analyse-Algorithmus und doppelklicken Sie auf die run.exe.
- Wählen Sie das TIFF-Datei analysiert werden.
- Wählen Sie Analyseparameter im offenen Dialog. Siehe 2A für Standardwerte für die Probendaten.
- Bestimmen Sie den Schwarzwert aus dem Bildstapel entweder durch Bewegen des Cursors auf einen Teil des Sichtfeldes, die n tut ausgeglichen werdenot enthalten eine Zelle (siehe Abbildung 2B) oder durch manuelle Eingabe eines Schwarzwert mit dem "Schwarzpegel einstellen" prompt.
- Beobachten vier Fenster auf dem Bildschirm folgende Analyse durch die Software (2C-F). C ist ein monochromes Bild still Fluoreszenz von Zellen analysiert. Weiße Quadrate auf diesem Bild überlagert sind Veranstaltungsorte, wie die Schwerpunktpositionen der zweidimensionalen Gauß-Funktionen ausgestattet, um Ereignisse bestimmt.
- Klicken Sie auf jedes Veranstaltungsortes, oder drücken Sie die Cursor-Tasten, um zwischen den Veranstaltungen. Daraufhin wird der Hintergrund subtrahiert, Gaussian geglättet Fluoreszenzverhältnis ändert (AF / F 0) auf jeder dieser Sites Update im Fenster D.
HINWEIS: Rot markierte Ereignisse von "Durchschlagen" von Aktivität zu benachbarten Stellen lokalisiert entschlossen, von diesem bestimmten Ort stammt und nicht. Die untere blaue Linie zeigt an, wo das Fluoreszenzsignal an der ausgewählten Stelle über dem ErkennungsSchwelle, während die schwarze Linie kennzeichnet Events von diesem bestimmten Ort Ursprung (entspricht dem rot hervorgehoben Ereignisse). - Klicken Sie auf einen rot unterlegt Veranstaltung Fenster E, die die zeitliche Entwicklung der Veranstaltung zeigt, und Fenster F, zeigt das räumliche Profil der Veranstaltung, gemittelt über seine Zeit, natürlich zusammen mit der Raumprofil der angepassten Gaußfunktion aktualisieren.
- Manuelles Überprüfen Sie die Ereignisse, die identifiziert wurden, so dass Artefakte von der Analyse abgelehnt. Löschen Sie solche Ereignisse durch Rechtsklick auf das rot markierte Veranstaltungen.
HINWEIS: In unseren Händen, Ca 2+ Fluss durch einzelne IP 3 R-Kanäle erinnert Signale mit AF / F 0 etwa 0,11, so dass alle erkannt "Ereignisse" wesentlich kleiner als diese wahrscheinlich mit Fehlmeldungen rechnen. - Exportieren von Daten, indem Sie durch Ziehen um die Zelle von Interesse und Auswählen von »Save CellR" Save to Excel 'oder Exportieren von Daten auf eine Basis pro Zelle17 ;.
HINWEIS: Die Daten werden in den gleichen Ordner wie das Originalbild Stack gespeichert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1A zeigt eine WF Bild ruhender Cal-520-Fluoreszenz in menschlichen Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen ebenfalls mit ci-IP 3 geladen. Exposition dieser Zellen in einen 100 msec UV-Blitz, um foto Freisetzung i-IP 3 ausgelöste Ca 2+ Transienten Quasten an diskreten Stellen (durch die weißen Kreise in 1A angegeben). Fluoreszenz Spuren gemessen an diesen Stellen zeigten eine schnelle Anstiegsphase aufgrund transienter Öffnungen der IP 3 R, gefolgt von einer viel langsameren fallenden Phase (1B und 1C), wie Ca 2+ langsam weg von dem Ort der Freisetzung diffundiert. Red markierten Ereignisse in 1B sind Ca 2+ Signale, die vom Algorithmus bestimmt wurden, von der ausgewählten Stelle entstanden sein. Nicht hervorgehoben Ereignisse darstellen gefährdend Ca 2+ Signale Streu von eng benachbarten Standorten.
Um höhere auflösende Bildgebung von lokalen Ca erreichen
Die Analyse der Bildstapel auf diese Weise erfasst wird stark durch eine eigens geschriebenen Algorithmus in unserem Labor läuft auf dem Open-Source-Software-Plattform entwickelt Python 11 erleichtert. 2A zeigt das Dialogfensteröffnung in der der Benutzer Parameter zur Identifizierung und anschließende Analyse der Bildstapeln verwendet werden eintritt. Im Anschluss daran wird der Benutzer aufgefordert, einen Schwarzwert auswählen, um aus dem gesamten Bildstapel abgezogen werden, nach der die Identifizierung und Analyse-Algorithmus läuft 2C-F zeigen jeweils die subzellulärer Ortsbild Ca 2+ Freisetzung. Aktivität an ausgewählten Standorten; Einzelveranstaltungen auf einem erweiterten Zeitskala; und räumliche Profile der repräsentative Veranstaltungen (siehe Abbildung 2 Legende für Details). Bei der Überprüfung der Benutzer identifiziert Websites, analysiert Daten für alle Events (siehe Tabelle 1) kann durch Auswahl der Funktion "Save to Excel" exportiert werden.
Figur 3 zeigt Daten, sowohl die Verbesserung der Auflösung von TIRF Bildgebung erreicht EGTA-beladenen Zellen im Vergleich zu WF Bildgebung in unbelastetem Zellen und power des Algorithmus bei der Identifizierung und Analyse von lokalen Ca 2+ Signale. 3A zeigt eine repräsentative lokales Ereignis von WF in einer Zelle nur mit Cal-520 und ci-IP 3 geladen abgebildet. Zum Vergleich zeigt 3B eine analoge Ereignis aber jetzt durch TIRF Mikroskopie in einer Zelle weiter mit EGTA geladen abgebildet. Eingeblendete Spuren in 3C und 3D veranschaulichen entsprechende zeitliche (C) und räumliche (D) Profile von Veranstaltungen, die von WF Fluoreszenz ohne EGTA (schwarz) und von TIRF-Mikroskopie mit EGTA Lade (rot) aufgezeichnet. 3E Diagramme Messungen, Blätterteig Amplituden , Abklingzeiten und Raumbreite unter diesen beiden Voraussetzungen, unter Verwendung des Algorithmus zu analysieren, etwa 44 (WF) und 88 (TIRF) Veranstaltungen.
Abbildung 1: IP
Abbildung 2: Benutzeroberfläche des benutzerdefinierten Code entworfen, um automatisch zu erkennen und zu analysieren lokalen Ca 2+ Signale in SH-SY5Y-Zellen durch TIRF-Mikroskopie abgebildet (A) Dialogbox, in der Identifikation und Analyse Parameter eingegeben Öffnungs (B) Der Benutzer wählt ein.. . Bereich des Bildes, die keine Zellen enthält, um den Schwarzwert, die von den allen Frames der Bildstapel abgezogen wird, zu definieren (C - F). Screenshots der letzten / Identifikationsanalysefenster (C) Bild von Ruhe Cal-5 20 Fluoreszenz auf dem übereinander dort, wo Ca 2+ Transienten wurden (weiße Quadrate) identifiziert. Der Benutzer kann Zyklus zwischen den Standorten durch Bewegen der Maus über das Bild oder den Cursortasten. (D) Fenster zeigt Fluoreszenzverhältnis (AF / F 0) Spur bei der gewählten Veranstaltung. Red-markierten Ereignisse gelten als an der ausgewählten Stelle entstanden identifiziert. Die untere blaue Balken zeigt Ereignisse, die die Schwelle für die Erkennung an diesem Standort überschreiten; Ereignisse, die nicht rot markiert haben zu einem benachbarten Ort lokalisiert. Durch Klicken auf die blauen Balken führt den Benutzer zu dem Veranstaltungsgelände. Ein Klick auf einen roten Ereignis mit der Maus öffnet zwei weitere Fenster, die die zeitliche Entwicklung der Veranstaltung auf einem erweiterten Zeitrahmen (E) und räumliche Profile (F) von der Veranstaltung, gemittelt über ihr zeitlicher Verlauf (links) zusammen mit dem räumlichen Profil die angepasste Gaußsche (rechts).e.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Verbesserung der zeitlichen und räumlichen Treue puff Bildgebung unter Verwendung TIRF Mikroskopie in Verbindung mit intrazellulären Beladung EGTA erreicht (A) Schnappschussbild eines Blätterteig zum Zeitpunkt der Spitzenamplitude erfasst, auf einem Hintergrundbild des ruhenden Fluoreszenz lagert. zeigen die Zellgliederung. Das Bild wurde durch WF Mikroskopie einer Zelle nicht mit EGTA geladen erhalten. Das Bild Blätterteig wird pseudocolored, mit höheren Niveaus von Ca 2+ zunehmend "warm" Farben bezeichnet. (B) entsprechende Bild eines Blätterteig mit TIRF-Mikroskopie in einer Zelle mit EGTA geladen abgebildet. (C) Spuren, WF (schwarz) oder TIRF + EGTA (rot), zeigen die entsprechende Änderung der Cal-520 fluorescence über der Zeit für die Ca 2+ in (A) gezeigt Quasten und (B) genannten. Spuren werden auf das gleiche Spitzenamplitude und ihre Spitzenzeit ausgerichtet, um den Vergleich ihrer Kinetik erleichtern. Anmerkungen zu veranschaulichen Messungen der Ca2 + Ereignisparameter (Amplitude und Abfallzeit) in (E) quantifiziert. (D) Spuren, WF (schwarz) oder TIRF + EGTA (rot), zeigen die Fluoreszenzintensität einer Linie durch die Ca 2 scannen + Puffs in (A) gezeigt, und (B). Linien-Scans, um ihre Spitzenamplituden normalisiert, und zentriert. Die Anmerkung zeigt Messung volle Breite beim halben maximalen Amplitude (FWHM), wie in (E) quantifiziert. (E) Balkendiagramme zeigen mittlere Spitzenamplituden (oben), Abfallzeiten von 80% auf 20% der Spitzenamplitude (Mitte), und die räumliche Breite (FWHM) von Zügen von WF-Mikroskopie in Zellen abgebildet, ohne EGTA (offene Balken) und nach TIRF-Mikroskopie in EGTA-beladenen Zellen (graue Balken). Daten sind als Mittelwert ± SEM mit einem n von mindestens 37 Züge vorgestelltfür WF und 79 für TIRF. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| A. | Gruppe # | Veranstaltungsort Identitätsnummer |
| B. | GroupX: | Mittlere Sub-Pixel x Lage aller Ereignisse an einem bestimmten Ort |
| C. | Groupy: | Mittlere Subpixel-y-Position aller Ereignisse an einem bestimmten Ort |
| D. | Nr Veranstaltungen: | Anzahl der Ereignisse zu einem Ort über den Verlauf des Experiments auftreten. |
| E. | Max Amp: | Maximale Amplitude eines Ereignisses an diesem bestimmten Ort (AF / F 0) |
| F. | X: | Sub-Pixel x Lokalisierung der Veranstaltung |
| G. | Y: | Subpixel-ylocalization Veranstaltungs |
| H. | T_peak: | Zeitpunkt, zu dem das Ereignis erreicht Spitzenamplitude (in frame number) |
| ICH A. | Amplitude: | Amplitude aller Ereignisse von jedem Standort Ursprung (AF / F 0) |
| J. | Sigmax: | X SD des Gauß-Profil zu zeitlichen Verlauf der Veranstaltung eingesetzt (in Pixeln) |
| K. | Sigmay: | Y SD des Gauß-Profil zu zeitlichen Verlauf der Veranstaltung eingesetzt (in Pixeln) |
| L. | Winkel: | Winkel zwischen der langen Achse der resultierende elliptische Funktion der Gauß Zeitverlauf der Ereignis ausgestattet |
| M. | R20: | Zeit, um auf 20% der max Amplitude ansteigen (in Frames) |
| N. | R50: | Zeit, um auf 50% der max Amplitude ansteigen (in Frames) |
| O. | R80: | Zeit steigenbis 80% der max Amplitude (in Frames) |
| P. | R100: | Zeit, um 100% der max Amplitude ansteigen (in Frames) |
| Q. | F80: | Zeit, um 80% der max Amplitude Fall (in Frames) |
| R. | F50: | Zeit, um auf 50% der max Amplitude Fall (in Frames) |
| S. | F20: | Zeit, um auf 20% der max Amplitude Fall (in Frames) |
| T. | F0: | Zeit, um Pre-Event-Grundlinie zurückzusetzen (in Frames) |
Tabelle 1: Ausgangsdaten vom Algorithmus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir beschreiben hier Protokolle zur Abbildung lokalen Ca 2+ Ereignisse in kultivierte Säugerzellen unter Verwendung von fluoreszierenden Ca 2+ Indikatoren. Darüber hinaus beschreiben wir einen Algorithmus mit einer intuitiven Benutzeroberfläche, die Identifikation und Analyse von erfassten Daten automatisiert. Das hier beschriebene Verfahren nutzen die fluoreszierenden Ca 2+ Anzeige Cal-520, aber viele andere Ca 2+ empfindlichen Farbstoffe wie Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 und Oregon Green BAPTA-1 durchführen ausreichend gut, um Bild Ca 2+ Mikrodomänen. Pflege braucht, um darauf zu achten, dass die hohe Affinität Versionen (K d von ca. 200 bis 400 nM) dieser Indikatoren werden auf Bild lokalen Ca 2+ Mikrodomänen verwendet, und die optimale Ladebedingungen dieser Indikatoren, um empirisch ermittelt werden müssen jeder Zelltyp untersucht. Ihrer Natur nach Ca 2+ Indikatoren binden Ca 2+ und somit als Ca 2+ Puffer; höhere Belastung Konzentrationen indicaToren haben das Potenzial, mit Ca 2+ Signale aufgezeichnet und / oder kann in intrazellulären Organellen sequestriert werden interferieren, obwohl die hier beschriebenen Belastungsbedingungen sind ein guter Ausgangspunkt. Insgesamt Abbildung der Tätigkeit der lokalen Ca 2+ Veranstaltungen ist minimal-invasiv, die Aufrechterhaltung der einheimischen Architektur einer Zelle und cytosolische Faktoren, die Kanäle, die Ca 2+ Mikrodomänen zugrunde liegen regulieren kann.
Das Protokoll beschreiben wir hier für hochauflösende Bildgebung von lokalen Ca 2+ Signale mit TIRF-Mikroskopie hat den offensichtlichen Einschränkung, dass es schränkt Messungen an Veranstaltungen, die von Ca2 + Kanäle innerhalb des abklingenden Feldes liegen kommen. Es ist jedoch nicht nur auf die Kanäle in der Plasmamembran beschränkt, und wir zeigen, die Anwendbarkeit auf die Kanäle wie das IP 3 R in intrazellulären Organellen, die gefunden wurden, um vorzugsweise in der Nähe der Plasmamembran 12, abersonst unzugänglich für elektrophysiologische Ableitung ihrer Tätigkeit in der nativen Zellumgebung sein. Konfokale Bildgebung würde erlauben Abbildungen von Signalen erzeugt wird tiefer in die Zelle, aber Nachteile im Vergleich zu TIRF Bildgebung, dass die Dicke des optischen Abschnitts breiter (~ 800 nm vs 100-200 nm) und durch die zeitliche Auflösung durch die Notwendigkeit begrenzt, die konfokale Ort (e) scannen. Weil Bildgebung in einer epi-Fluoreszenz-Modus mit einem inversen Mikroskop erfolgen könnte optischen Aufnahmen der lokalen und einkanalige Ca 2+ Signale leicht unter gleichzeitiger elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert werden.
Durch Expression Fluoreszenz Ca 2+ Signale als ein Verhältnis von ruhenden Fluoreszenz (& Dgr; F / F 0) ist es möglich, eine gute relative Maß für die Signalamplituden zu erhalten. Allerdings raten wir, dass die Kalibrierung der lokalen, transienten Fluoreszenzänderungen in Bezug auf die absolute Ca2 + Konzentrationennicht angemessen. Die Gradienten der freien [Ca 2+] und Ca 2+ -gebundenen Indikator um einen Ca 2+ -Freisetzung Kanal oder Gruppe von Kanälen schmaler als durch optische Mikroskopie gelöst werden und werden somit durch die Punktstreufunktion des Mikroskops unscharf. Außerdem lokalen [Ca 2+] in unmittelbarer Nähe des Kanals Poren wird auf einem Mikrosekundenbereich zu ändern, wie der Kanal öffnet und schließt. So werden die Fluoreszenzsignale liefern nur ein verschwommenes (in Raum und Zeit) Darstellung des wahren Ca 2+ Nanodomänen zugrunde liegenden lokalen Ca 2+ Signale 13.
Die hier beschriebene Algorithmus erheblich erleichtert die Analyse der lokalen Ca 2+ Signale von kamerabasierten Bildgebung. Durch die Automatisierung der Identifikation und Analyse nicht nur Benutzer Bias beseitigt, aber Gigabyte an Bildstapeln kann innerhalb von Minuten in einem stark parallel verarbeitet werden, was sowohl zeitliche und räumliche Daten aus mehreren Ereignissen ausein Single-Cell gleichzeitig.
Obwohl die Daten in dieser Handschrift sind im Rahmen der IP 3 vermittelte Ca 2+ Signale dargestellt, können die beschriebenen Ansätze leicht erweitert, um lokale Änderungen der cytosolischen Bildgebung werden [Ca 2+] aus zahlreichen Arten von Ligand, Second-messenger ausgeh und spannungsabhängigen Ca 2+ durchlässige Ionenkanälen. Die Hochdurchsatz-Art des Algorithmus für die Automatisierung der Identifizierung und Analyse der lokalen Ca2 + Ereignisse sollten sich auch als sehr nützlich zum Abbilden Ca 2+ channelopathies in Erkrankungszuständen über Einzelzellmodellen, wie der Alzheimer-Krankheit und Autismus-Spektrum-Störung zu sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
