इमेजिंग स्थानीय सीए Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

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Jeffrey T. Lock¹, Kyle L. Ellefsen¹, Bret Settle¹, Ian Parker^1,2, Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

Abstract

साइटोसोलिक सीए ^{2 +} आयनों के रूप में जीन प्रतिलेखन, बिजली excitability और सेल प्रसार के रूप में व्यापक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने, लगभग सभी प्रकार की कोशिकाओं में सेलुलर गतिविधि के कई पहलुओं को विनियमित। सीए ^{2 +} संकेतन की विविधता और विशिष्टता स्थानीय क्षणिक सीए ^{2 +} microdomains मिनट की अवधि में होने वाली सेल चौड़ा दोलनों और लहरों से लेकर सीए ^{2 +} संकेतों अलग समय और स्थानिक तराजू से अधिक कार्य करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं जिसके द्वारा तंत्र से निकला (सीए ^{2 +} कश) तक चलने मिसे। इलेक्ट्रॉन में हाल के अग्रिमों सीसीडी (EMCCD) कैमरों अब> 500 फ्रेम सेकंड ^-1 (एफपीएस) की दर पर एक 128 x 128 पिक्सेल स्थानिक संकल्प के साथ स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों के इमेजिंग के लिए अनुमति गुणा। यह दृष्टिकोण अत्यधिक समानांतर है और एक ही प्रयोग में चैनल या कश साइटों के सैकड़ों के एक साथ निगरानी में सक्षम बनाता है। हालांकि, डेटा की विशाल मात्रा में उत्पन्न (सीए 1 जीबी पीईआर मिनट) ^{2 +} घटनाओं अव्यवहारिक स्थानीय सीए के दृश्य पहचान और विश्लेषण प्रस्तुत करना। यहाँ हम का वर्णन है और अधिग्रहण, का पता लगाने के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, और व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति (WF) और कुल आंतरिक प्रतिबिंब दोनों का उपयोग कर सीए ^{2 +} संकेतक के साथ भरी हुई बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं में सीए ^{2 +} संकेतों मध्यस्थता _तीन स्थानीय आईपी के विश्लेषण प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी। इसके अलावा, हम इन स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों की पहचान और विश्लेषण automates कि खुले स्रोत सॉफ्टवेयर वातावरण अजगर के भीतर विकसित एक एल्गोरिथ्म का वर्णन है। एल्गोरिथ्म उप पिक्सेल संकल्प के साथ सीए ^{2 +} रिहाई की साइटों localizes; डेटा के उपयोगकर्ता समीक्षा अनुमति देता है; और एक एक्सेल-संगत तालिका में आयाम और गतिज डेटा के साथ एक साथ प्रतिदीप्ति अनुपात संकेतों के समय दृश्यों outputs।

Introduction

कैल्शियम आयन (सीए ^{2 +)} सर्वत्र जीन अभिव्यक्ति, स्राव और synaptic plasticity के ^एक में लंबे समय से स्थायी परिवर्तन सहित जैविक प्रक्रियाओं, की एक विविध रेंज को विनियमित। सीए ^{2 +} इस तरह के एक विविध तरीके से कार्य कर सकते हैं, जिसके माध्यम से एक तरह से सीए ^{2 +} के विभिन्न स्थानिक और लौकिक पैटर्न के माध्यम से एक सेल उत्पन्न कर सकते हैं का संकेत है। साइटोसोलिक में उदाहरण के वैश्विक उन्नयन चिकनी मांसपेशियों के ऊतकों को ^दो जबकि छोटे में [सीए ^{2 +]} ट्रिगर संकुचन, स्थानीय क्षणिक उन्नयन (स्थानीय सीए ^{2 +} microdomains) के लिए सीखने और स्मृति ³ के लिए आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित।

नि: शुल्क साइटोसोलिक [सीए ^{2 +]} ~ 100 एनएम पर बाकी पर बनाए रखा है, लेकिन तेजी से सीए के माध्यम से cytosol में सीए ^{2 +} की आमद के बाद कई सूक्ष्म दाढ़ के लिए प्लाज्मा झिल्ली में और से स्थित ^{2 +} -permeable आयन चैनल वृद्धि कर सकते हैं इंट्रासेल्युलर s से सीए ^{2 +} की मुक्तिTores। हमारी प्रयोगशाला endoplasmic जालिका (ईआर) झिल्ली में स्थित एक सीए ^{2 +} रिलीज़ चैनल जो रूपों inositol 1,4,5-trisphosphate रिसेप्टर (आईपी ₃ आर), पर केंद्रित है। रिसेप्टर की साइटों को सक्रिय साइटोसोलिक करने के लिए दोनों आईपी ₃ और सीए ^{2 +} के बंधन पर, आईपी ₃ आर चैनल सीए ^{2 +} ईआर लुमेन भीतर तनहा आजाद कराने के लिए खुलता है। सीए ^{2 +} की रिहाई के स्थानिक (सीए ^{2 +} कश ^{4) 2 +} सीए की एक स्थानीय साइटोसोलिक microdomain उत्पन्न करने के लिए आईपी _तीन रुपये के एक छोटे समूह तक ही सीमित रह सकता है या, आईपी ₃ रुपये का पड़ोसी समूहों की निकटता के आधार पर, हो सकता है सीए ^{2 +} -induced सीए ^{2 +} -release (CICR) ^5,6 की एक प्रक्रिया के माध्यम से कई कश साइटों की भर्ती द्वारा एक सेल भर में प्रचार।

उन्नत माइक्रोस्कोपी imagi के साथ युग्मित Tsien ⁷ रोजर द्वारा विकसित फ्लोरोसेंट छोटे अणु सीए ^{2 +} सूचक रंगों की शुरूआततकनीक एनजी, सीए ^{2 +} संकेतन के बारे में हमारी समझ में मदद की बहुत गया है। माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया कैमरे में हाल के अग्रिमों अब ऐसी अभूतपूर्व स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ कश के रूप में क्षणिक स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। वर्तमान में उपलब्ध EMCCD कैमरों> 500 फ्रेम सेकंड ^-1 (एफपीएस) और पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक की नई पीढ़ी में 128 x 128 पिक्सल के साथ इमेजिंग सक्षम) (CMOS कैमरों से थोड़ा अधिक की कीमत पर उच्च पिक्सेल संकल्प, और भी तेजी से गति प्रदान शोर का स्तर। कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में छवि के लिए अब एक सीए ^{2 +} चैनल घटनाओं ^8,9 संभव है। अव्यवहारिक पुस्तिका प्रोसेसिंग, दृश्य पहचान और विश्लेषण प्रस्तुत करना और स्वचालित एल्गोरिदम के विकास पर एक जिम्मेदारी उस जगह बड़े डेटा सेट (न्यूनतम प्रति सीए 1GB) पैदा करने हैं, जबकि यह दृष्टिकोण, एक साथ चैनल / घटनाओं के सैकड़ों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है।

2 + संकेतकों का उपयोग बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं में स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम आगे TIRF और पारंपरिक विस्तृत क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति (WF) माइक्रोस्कोपी दोनों ने उतारी स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं की पहचान और विश्लेषण automates कि खुले स्रोत वातावरण अजगर में विकसित एक एल्गोरिथ्म प्रदर्शित करता है। हम आईपी सीए ^{2 +} संकेतों -generated ₃ के संदर्भ में इन तरीकों का वर्णन है, वे [सीए ^{2 +]} सीए की एक किस्म से या तो सतह में स्थित ^{2 +} -permeable आयन चैनल निकलती साइटोसोलिक में स्थानीय परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए आसानी से उत्तरदायी हैं झिल्ली या intracellular organelles के ^8-10।

Protocol

हम मानव neuroblastoma एसएच SY5Y कोशिकाओं में स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं इमेजिंग के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं प्रस्तुत करते हैं। इन प्रक्रियाओं के कई प्रकार की कोशिकाओं ^8-10 में छवि इंट्रासेल्युलर सीए ^{2 +} संकेतों को रूपांतरित किया जा सकता है।

प्रकोष्ठों के 1. तैयारी

1. संस्कृति कोशिकाओं उनके आपूर्तिकर्ता की वेबसाइट पर सूचीबद्ध निर्देशों के अनुसार imaged किया जाना है।
2. इमेजिंग के लिए पहले कुछ दिन, फसल कोशिकाओं 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin / EDTA (2-3 मिनट) का उपयोग कर एक टिशू कल्चर फ्लास्क में हो। सेना की टुकड़ी के बाद, ट्रिप्सिन निष्क्रिय करने के लिए संस्कृति मीडिया के एक बराबर मात्रा में जोड़ें।
3. पकवान प्रति 3-7 एक्स 10 ⁴ कोशिकाओं के घनत्व पर गिलास नीचे इमेजिंग बर्तन में एक hemocytometer और बीज कोशिकाओं का उपयोग कर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं। इमेजिंग प्रयोगों के लिए चयन करें कोशिकाओं वे 60% संगम (2-3 दिन) तक पहुँचने।

समाधान और अभिकर्मकों के 2. तैयारी

1. बफर एक सीए ^{2 +} युक्त HEPES तैयार करें(मिमी) से बना नमक के घोल (सीए ^{2 +} -HBSS): 135 सोडियम क्लोराइड, ₂ CaCl, 1 ₂ MgCl, 10 HEPES, और 10 ग्लूकोज 5.4 KCl, 2; पीएच = 7.4 NaOH के साथ कमरे के तापमान (आरटी) में। 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूकोज और स्टोर के अलावा बिना सीए ^{2 +} -HBSS तैयार करें; उपयोग करने के लिए तुरंत पहले समाधान के लिए ग्लूकोज जोड़ें।
2. फ्लोरोसेंट सीए ^{2 +} सूचक काल-520 (1 मिमी) की झिल्ली permeant रूपों solubilize, सीआई आईपी ₃ (200 माइक्रोन), और EGTA 20% pluronic एफ-127 युक्त डाइमिथाइल sulfoxide में (100 मिमी) (DMSO)। -20 डिग्री सेल्सियस पर, नमी और प्रकाश से परिरक्षित Eppendorf ट्यूब और दुकान में इन अभिकर्मकों विभाज्य।

साथ 3. लोड हो रहा है प्रकोष्ठों झिल्ली-permeant, काल-520 सीआई आईपी ₃ और EGTA

1. सीए ^{2 +} -HBSS में क्रमश: 5 माइक्रोन और 1 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता झिल्ली permeant काल-520 और सीआई आईपी ₃ के शेयर समाधान गिराए द्वारा "लोडिंग बफर" तैयार करें।
2. महाप्राण घनlture मीडिया और सीए ^{2 +} -HBSS तीन बार के साथ मीडिया की जगह से कोशिकाओं कुल्ला।
3. सीए ^{2 +} निकालें -HBSS और अंधेरे में आरटी पर 60 मिनट के लिए लोड हो रहा है बफर में कोशिकाओं को सेते हैं।
4. लोड हो रहा है बफर निकालें और सीए ^{2 +} -HBSS तीन बार के साथ मीडिया की जगह से कोशिकाओं कुल्ला।
   1. अगर वांछित, इस चरण में, तो लोड सीए ^{2 +} -HBSS में 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए शेयर समाधान गिराए द्वारा EGTA / एएम के साथ कोशिकाओं और अंधेरे में आरटी पर 30-60 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं। इस ऊष्मायन के बाद, 3.5 कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं सीए ^{2 +} -HBSS के साथ तीन बार कुल्ला।
5. भरी हुई अभिकर्मकों के डे-एस्टरीफिकेशन के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए सीए ^{2 +} -HBSS में कोशिकाओं को सेते हैं।
6. इमेजिंग के लिए तुरंत पहले, अंतिम ऊष्मायन के दौरान स्नान में लीक हो सकता है कि किसी भी रंग को हटाने के क्रम में "ताजा" सीए ^{2 +} -HBSS साथ सीए ^{2 +} -HBSS जगह।

4. सीए ^{2 +}

1. 100X एपीओ TIRF उद्देश्य पर विसर्जन के तेल की एक छोटी सी बूंद (एनए 1.49) रखें।
2. उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर इमेजिंग पकवान माउंट और प्रेषित प्रकाश के उपयोग को ध्यान में कोशिकाओं को लाने के लिए। यह रिकॉर्डिंग के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए इमेजिंग पकवान सुरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
3. एक उच्च गति EMCCD कैमरे का उपयोग कर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति (λ> 510 एनएम) काल-520 उत्तेजित और इकट्ठा करने के क्रम में एक 488 एनएम लेजर के साथ कोशिकाओं को रोशन।
   नोट: माइक्रोस्कोप चल रही है कि सॉफ्टवेयर पैकेज उपयोगकर्ता लेजर बीम या तो ("WF" उत्तेजना के लिए) और अधिक केन्द्र या (TIRF उत्तेजना के लिए) उद्देश्य वापस एपर्चर के चरम किनारे पर पेश किए जाने की अनुमति देने के लिए एक ध्यान केंद्रित लेंस का अनुवाद करने की अनुमति देता है।
4. EMCCD के सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं पर कब्जा करने के लिए आवश्यक अस्थायी समाधान पर डेटा एकत्रित करने के क्रम में पूर्ण 512 X 512 पिक्सल से इमेजिंग क्षेत्र को कम।
   नोट: उदाहरण के लिए, केन्द्र ट्रैक्टर256 X 256 पिक्सल के अधिग्रहण के 66 एफपीएस के लिए अधिग्रहण की दर को गति। यह आगे एक अलग फसल मोड समारोह का उपयोग कर 500 एफपीएस के लिए EMCCD कैमरे के फ्रेम दर को बढ़ाने के लिए भी संभव है।
5. स्वचालित रूप से, आधारभूत गतिविधि के कुछ ही सेकंड के रिकॉर्ड की कोशिकाओं के लिए एक यूवी फ्लैश देने और एक अन्य 10-30 सेकंड के लिए रिकॉर्डिंग जारी रखने के लिए सॉफ्टवेयर विन्यास करें।
   ध्यान दें: एक यूवी फ्लैश खुर्दबीन के पीछे बंदरगाह में dichroic दर्पण दर्शाती एक यूवी के माध्यम से शुरू की एक क्सीनन चाप प्रकाश स्रोत का उपयोग कर दिया है। यूवी फ्लैश की अवधि और तीव्रता स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं की एक वांछित आवृत्ति आह्वान अनुभव से निकाला जाता है।
6. छवि बंद लाइन के विश्लेषण के लिए ढेर के रूप में फाइल सेव करें।

5. स्वचालित सीए ^{2 +} छवि विश्लेषण

नोट: यह देखने के लिए, प्रक्रिया और कई वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर लिया डेटा का विश्लेषण करने के लिए संभव है। हालांकि, हम तेजी से पहचान एक स्वचालित करने के लिए एक एल्गोरिथ्म विकसित किया हैस्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों के डी विश्लेषण। इस एल्गोरिथ्म में इस्तेमाल स्थानिक और लौकिक फिल्टर का एक विस्तृत विवरण, ΔF / एफ ₀ और पहचान / विश्लेषण दिनचर्या की पीढ़ी के ¹¹ में पाया जा सकता है। इस एल्गोरिथ्म खुला स्रोत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म अजगर पर चलाने के लिए विकसित किया गया है, और से, एक साथ नमूना प्रयोगात्मक डेटा और विस्तृत उपयोगकर्ता के निर्देश के साथ प्राप्त किया जा सकता है ई-मेलिंग इसी लेखक (ismith@uci.edu)।

1. फ़ाइलों को परिवर्तित बहु विमान झगड़ा फ़ाइल स्वरूप के लिए कस्टम लिखा एल्गोरिथ्म में आयात किया जा सके।
2. विश्लेषण एल्गोरिथ्म वाले फ़ोल्डर का पता लगाएँ और डबल run.exe क्लिक करें।
3. झगड़ा फ़ाइल का चयन करें विश्लेषण किया जा सके।
4. खुला संवाद बॉक्स में विश्लेषण मापदंडों का चयन करें। नमूना डेटा के लिए तयशुदा मापदंडों के लिए 2A चित्रा देखें।
5. काले स्तर का निर्धारण करते हैं, या तो एन करता है कि देखने के क्षेत्र के एक हिस्से के लिए कर्सर ले जाकर छवि ढेर से भरपाई हो के लिएओ.टी. एक सेल होते हैं (चित्रा 2B देखें) या मैन्युअल 'सेट काले स्तर' प्रॉम्प्ट का उपयोग एक काले स्तर दर्ज करके।
6. सॉफ्टवेयर (चित्रा -2 एफ) द्वारा विश्लेषण निम्नलिखित स्क्रीन पर चार खिड़कियों का निरीक्षण करें। सी कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति आराम की एक मोनोक्रोम छवि विश्लेषण किया जा रहा है। इस छवि पर आरोपित सफेद चौकों की घटनाओं के लिए फिट दो आयामी गाऊसी कार्यों के केन्द्रक पदों के रूप में निर्धारित घटना स्थानों, कर रहे हैं।
7. प्रत्येक घटना के स्थान पर क्लिक करें या घटनाओं के बीच चक्र कर्सर कुंजी दबाएँ। ऐसा करने पर पृष्ठभूमि घटाया, गाऊसी खिड़की डी में इन साइटों अद्यतन में से प्रत्येक में प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तन (ΔF / एफ ₀₎ smoothed
   नोट: लाल घटनाओं आसन्न साइटों के लिए स्थानीय गतिविधि से 'खून बहाना-थ्रू' से है कि विशेष साइट से ही शुरू और नहीं करने के लिए निर्धारित कर रहे हैं पर प्रकाश डाला। चयनित स्थल पर प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के पार हो गई है, जहां कम नीला ट्रेस इंगित करता हैकाला लाइन है कि विशेष साइट से होने की घटनाओं को दिखाता है, जबकि सीमा (लाल करने के लिए इसी की घटनाओं पर प्रकाश डाला)।
8. एक लाल पर क्लिक करें घटना के अस्थायी विकास को प्रदर्शित करता है कि खिड़की ई, और एक साथ फिट गाऊसी समारोह के स्थानिक प्रोफाइल के साथ, घटना के स्थानिक प्रोफ़ाइल अपने समय के पाठ्यक्रम पर औसतन प्रदर्शित करता है जो विंडो एफ अद्यतन करने के लिए घटना पर प्रकाश डाला।
9. मैन्युअल कलाकृतियों विश्लेषण से खारिज कर दिया जा सकता है कि इतनी पहचान की गई है कि घटनाओं की समीक्षा करें। सही लाल क्लिक करके इस तरह की घटनाओं को हटाएँ घटनाओं पर प्रकाश डाला।
   नोट: हमारे हाथ में, सीए ही आईपी ₃ आर चैनलों के माध्यम से ^{2 +} प्रवाह ΔF / एफ ₀ के बारे में 0.11 के साथ संकेतों उदाहरण भी देते हैं, तो इस से appreciably छोटे किसी भी पता लगाया 'घटनाओं' झूठी सकारात्मक होने की संभावना है।
10. सहेजें CellR ब्याज की सेल के आसपास ड्राइंग और 'चुनकर सेल के आधार पर प्रति एक पर डेटा या निर्यात' एक्सेल में सहेजें 'का चयन करके निर्यात डेटा17 ;.
    नोट: डाटा मूल छवि ढेर के रूप में एक ही फ़ोल्डर में सहेज कर रहे हैं।

Representative Results

चित्रा 1 ए भी सीआई आईपी ₃ के साथ भरी हुई मानव neuroblastoma एसएच SY5Y कोशिकाओं में काल-520 प्रतिदीप्ति आराम की एक WF छवि को दर्शाता है। फोटो जारी करने के लिए एक 100 मिसे यूवी फ्लैश करने के लिए इन कोशिकाओं का एक्सपोजर मैं आईपी ₃ (चित्रा 1 ए में सफेद हलकों से विख्यात) असतत स्थलों पर क्षणिक सीए ^{2 +} कश हासिल। इन साइटों पर मापा प्रतिदीप्ति निशान धीरे धीरे दूर रिहाई साइट से दूर तक फैला हुआ ^{2 +} CA के रूप में एक बहुत धीमी गिरने चरण (चित्रा 1 बी और 1 सी) द्वारा पीछा आईपी ₃ रुपये का क्षणिक उद्घाटन, के कारण एक तेजी से बढ़ती चरण दिखाया। लाल चित्रा 1 बी में घटनाओं कलन विधि द्वारा निर्धारित किया गया है कि सीए ^{2 +} संकेतों चयनित स्थल से उत्पन्न हो रहे हैं पर प्रकाश डाला। गैर-प्रकाश डाला घटनाओं सीए बारीकी से सटे साइटों से diffusing ^{2 +} संकेतों contaminating का प्रतिनिधित्व करते हैं।

स्थानीय सीए के उच्च संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए 2 + बफर EGTA साथ लोड किया जा सकता है। इस CA कश साइटों के बीच diffusing ^{2 +} आयनों chelates और इस तरह आईपी _तीन रुपये के अलग-अलग समूहों द्वारा उत्पन्न स्थानीय सीए ^{2 +} कश का अध्ययन अंधेरा होता है कि वैश्विक सीए ^{2 +} लहरों की पीढ़ी को रोकता है। इसके अलावा, EGTA स्थानीय सीए ^{2 +} microdomain के पतन accelerates लेकिन, इसकी धीमी गति से बाध्यकारी कैनेटीक्स के कारण न्यूनतम स्थानीय मुक्त सीए perturbs ^{2 +} और ​​उसके एक क्लस्टर के भीतर तेजी से सीए ^{2 +} सूचक के लिए बाध्य। EGTA का शुद्ध प्रभाव appreciably उनके आयाम ह्रासमान के बिना, स्थान और समय में कश की प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड 'पैनापन' के लिए है। संकल्प में एक और सुधार TIRF द्वारा बनाई गई संकीर्ण (<100 एनएम) क्षणभंगुर लहर को काल-520 fluorophores के उत्तेजना को सीमित करने के TIRF का उपयोग करके उठता है। इन तरीकों से दोनों का योग को प्रभावी ढंग से तात्कालिक सीए पर नज़र रखता है कि एक तकनीक है ^{2 +} 2 + वर्तमान) बल्कि यह आईपी _तीन रुपये के माध्यम से जारी है और धीरे धीरे रिहाई साइट से दूर diffuses और ⁹ तनहा अंततः है। चित्रा -1 TIRF 'पदचिह्न' का पता चलता है के बाद सीए की एक टपका हुआ अभिन्न ^{2 +} की तुलना काल-520 fluorophores coverglass / जलीय घोल इंटरफ़ेस से सेल में एक संकीर्ण दूरी के भीतर ही उत्साहित थे जब एक एसएच SY5Y सेल। EGTA के साथ संयोजन के रूप में, TIRF रोशनी के द्वारा बनाई गई attoliter साइटोसोलिक संस्करणों के भीतर तेजी सूचक काल-520 डाई करने के लिए ^{2 +} सीए के बंधन रैपिड करने के लिए 'चेहरे की विकृति' ऊपर सीए ^{2 +} वाचाल, समय और स्थान दोनों में तेज कर रहे हैं कि पैदावार प्रतिदीप्ति संकेतों ( चित्रा 1E और 1F)।

इस तरह से कब्जा कर लिया छवि के ढेर के विश्लेषण बहुत खुला स्रोत सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म अजगर ¹¹ पर हमारी प्रयोगशाला की दौड़ में विकसित एक कस्टम लिखा एल्गोरिथ्म के माध्यम से मदद की है। 2A चित्रा उपयोगकर्ता पहचान और छवि के ढेर के बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा मापदंडों में प्रवेश करती है, जिसमें उद्घाटन संवाद खिड़की से पता चलता है। इस के बाद, उपयोगकर्ता पूरे छवि ढेर से घटाया जा करने के लिए एक काला स्तर का चयन करने के लिए कहा जाता है, जिसके बाद पहचान और विश्लेषण एल्गोरिथ्म रन चित्रा -2 एफ शो, क्रमशः, स्थानीय सीए ^{2 +} रिहाई के subcellular साइटों। चयनित स्थलों पर गतिविधि; एक विस्तारित timescale पर अलग-अलग घटनाओं; और प्रतिनिधि घटनाओं के स्थानिक प्रोफाइल (विवरण के लिए चित्रा 2 कथा देखें)। पहचान साइटों के उपयोगकर्ता समीक्षा करने पर, सभी घटनाओं (1 टेबल देखें) 'सेव करें एक्सेल में' समारोह का चयन करके निर्यात किया जा सकता है के लिए डेटा का विश्लेषण किया।

में TIRF इमेजिंग के द्वारा प्राप्त संकल्प में सुधार दोनों illustrating चित्रा 3 प्रस्तुत डेटा उतार कोशिकाओं में WF इमेजिंग की तुलना में कोशिकाओं EGTA से भरी हुई है, और पीकी पहचान करने और स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों के विश्लेषण में एल्गोरिथ्म के ower। चित्रा 3A काल-520 और सीआई आईपी ₃ के साथ ही भरी हुई एक सेल में WF ने उतारी एक प्रतिनिधि स्थानीय घटना से पता चलता है। तुलना के लिए, चित्रा 3 बी एक अनुरूप घटना से पता चलता है, लेकिन अब आगे EGTA के साथ भरी हुई एक सेल में TIRF माइक्रोस्कोपी ने उतारी। चित्रा -3 सी और 3 डी में आरोपित निशान। लौकिक (सी) और स्थानिक (डी) EGTA (काला) के बिना और EGTA लोड हो रहा है (लाल) के साथ TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा WF प्रतिदीप्ति द्वारा दर्ज की घटनाओं के प्रोफाइल इसी का उदाहरण देकर स्पष्ट 3E भूखंडों कश आयाम की माप मतलब चित्रा , इन दो शर्तों के तहत क्षय बार, और स्थानिक चौड़ाई लगभग 44 (WF) और 88 (TIRF) की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए कलन विधि का उपयोग निर्धारित की।

चित्रा 1: आईपी काल-520 और सीआई आईपी _तीन व्यापक क्षेत्र ने उतारी (ए सी के माध्यम से) और TIRF (एफ के माध्यम से डी) माइक्रोस्कोपी। (ए) के मोनोक्रोम छवि के साथ भरी हुई एसएच SY5Y कोशिकाओं में स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों -evoked कश साइट स्थानों सफेद हलकों से चिह्नित कर रहे हैं, जिस पर काल-520 प्रतिदीप्ति आराम कर; पैमाने बार = 10 माइक्रोन। (बी) के निशान कश (ए) के रूप में गिने तीन अलग अलग साइटों पर पैदा वर्णन। लाल घटनाओं है कि विशेष साइट से उत्पन्न है पहचान कश हैं पर प्रकाश डाला। तीर यूवी फ्लैश के समय को इंगित करता है। (सी) एक विस्तृत पैमाने पर गठबंधन और दिखाया में उन लोगों (बी), जैसे प्रतिनिधि सीए ^{2 +} कश के आरोपित निशान। (डी) एसएच में काल-520 प्रतिदीप्ति आराम की मोनोक्रोम TIRF 'पदचिह्न' छवि सीआई आईपी ₃ और EGTA के साथ भरी हुई -SY5Y कोशिकाओं। सफेद हलकों कश साइट मूल निरूपित। (ई) (एफ) एक विस्तृत पैमाने पर गठबंधन और दिखाया में उन लोगों (ई), जैसे प्रतिनिधि सीए ^{2 +} कश के आरोपित निशान पर पैदा की।

चित्रा 2: स्वचालित रूप से TIRF माइक्रोस्कोपी ने उतारी एसएच SY5Y कोशिकाओं में स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों की पहचान करने और विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया कस्टम कोड का यूजर इंटरफेस (ए) की पहचान और विश्लेषण मापदंडों प्रवेश कर रहे हैं जहां संवाद बॉक्स खोलने (बी) के उपयोगकर्ता एक का चयन करता है।। । छवि ढेर में सभी फ्रेम से घटाया जाता है कि काले स्तर को परिभाषित करने के लिए कोई सेल शामिल है कि छवि का क्षेत्र (सी - एफ)। अंतिम / पहचान विश्लेषण खिड़कियों की स्क्रीनशॉट (सी) के आराम की छवि काल-5 सीए ^{2 +} यात्रियों (सफेद वर्गों) की पहचान की गई है, जहां जिस पर 20 प्रतिदीप्ति स्थानों आरोपित कर रहे हैं। उपयोगकर्ता कर सकते हैं छवि पर माउस चलती है या कर्सर कुंजी का उपयोग करके साइटों के बीच चक्र। (डी) विंडो दिखा प्रतिदीप्ति अनुपात (ΔF / एफ ₀₎ चयनित घटना में पता लगा। लाल प्रकाश डाला घटनाओं चयनित स्थल पर पैदा हुई होने के रूप में पहचाने जाते हैं। कम नीले रंग की पट्टी है कि साइट पर पता लगाने के लिए सीमा को पार करते घटनाओं को इंगित करता है; लाल प्रकाश डाला नहीं की घटनाओं एक बगल साइट के लिए स्थानीय कर दिया गया है। नीले रंग की पट्टी पर क्लिक करना है कि घटना स्थल के लिए उपयोगकर्ता लेता है। माउस के साथ एक लाल घटना पर क्लिक करने के स्थानिक प्रोफाइल के साथ एक साथ घटना (बाएं) ने अपने समय के पाठ्यक्रम पर औसतन की एक विस्तारित timescale (ई) और स्थानिक प्रोफाइल (एफ) पर घटना की अस्थायी विकास दिखा दो और खिड़कियां खुल जाता है फिट गाऊसी (दाएं)।e.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: EGTA के intracellular लदान के साथ संयोजन के रूप में TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हासिल की कश इमेजिंग के अस्थायी और स्थानिक निष्ठा में सुधार करने के लिए प्रतिदीप्ति आराम की एक पृष्ठभूमि छवि पर आरोपित शिखर आयाम के समय पर कब्जा कर लिया एक कश की (ए) स्नैपशॉट छवि,। सेल रूपरेखा दिखा। छवि EGTA के साथ लोड नहीं एक सेल का WF माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किया गया था। कश छवि तेजी से 'गर्म' रंग से चिह्नित उच्च सीए ^{2 +} स्तर के साथ, pseudocolored है। (बी) EGTA के साथ भरी हुई एक सेल में TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged एक कश की छवि इसी। (सी) निशान, WF (काला) या TIRF + EGTA (लाल), काल-520 fluorescenc में इसी बदलाव को दिखाने(ए) में दिखाया गया है सीए ^{2 +} कश के लिए समय और इसके बाद के संस्करण (बी) पर ई। निशान एक ही शिखर आयाम के लिए सामान्यीकृत और उनके कैनेटीक्स की तुलना की सुविधा के लिए अपने चरम समय के लिए गठबंधन कर रहे हैं। एनोटेशन घटना मापदंडों ^{2 +} सीए की माप को वर्णन (आयाम और समय गिर) (ई) में मात्रा निर्धारित। (डी) निशान, WF (काला) या TIRF + EGTA (लाल), एक लाइन की प्रतिदीप्ति तीव्रता सीए ² के माध्यम से स्कैन दिखाने ⁺ (ए) में दिखाया गया कश और (बी)। रेखा स्कैन अपने चरम आयाम के लिए सामान्यीकृत, और केंद्रित कर रहे हैं। एनोटेशन (ई) में मात्रा के रूप में, आधा अधिक से अधिक आयाम (FWHM) में पूरी चौड़ाई की माप से पता चलता है। मतलब शिखर आयाम (ऊपर) दिखा रहा है (ई) बार रेखांकन, द्वारा EGTA (खुला सलाखों) के बिना कोशिकाओं में WF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged कश के शिखर आयाम (मध्य), और स्थानिक चौड़ाई (FWHM) का 20% से 80% से कई बार गिर जाते हैं और EGTA से भरी हुई कोशिकाओं में TIRF माइक्रोस्कोपी (धूसर बार)। डेटा कम से कम 37 कश की एक एन के साथ SEM के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैंTIRF के लिए WF और 79 के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ए	गट #	इवेंट साइट की पहचान संख्या
बी	GroupX:	एक विशेष स्थल पर सभी घटनाओं के उप पिक्सेल एक्स स्थान मीन
सी.	GroupY:	एक विशेष स्थल पर सभी घटनाओं के उप पिक्सेल Y स्थान मीन
डी	कोई आयोजन नहीं:	प्रयोग के पाठ्यक्रम पर एक साइट पर होने वाली घटनाओं की संख्या।
ई	मैक्स एएमपी:	उस विशेष स्थल पर एक घटना का अधिकतम आयाम (ΔF / एफ 0)
एफ.	एक्स:	घटना की उप-पिक्सेल एक्स स्थानीयकरण
जी	वाई:	उप-पिक्सेल YLघटना की ocalization
एच	T_peak:	घटना (फ्रेम संख्या में) शिखर आयाम तक पहुँच जाता है, जिस पर समय
मेँ.	आयाम:	प्रत्येक साइट से होने वाले सभी घटनाओं के आयाम (ΔF / एफ 0)
जे	Sigmax:	गाऊसी प्रोफ़ाइल के एक्स एसडी (पिक्सेल में) घटना के समय के पाठ्यक्रम के लिए फिट
लालकृष्ण	Sigmay:	गाऊसी प्रोफ़ाइल के वाई एसडी (पिक्सेल में) घटना के समय के पाठ्यक्रम के लिए फिट
एल	कोण:	गाऊसी के परिणामस्वरूप अण्डाकार समारोह की लंबी अक्ष के कोण घटना के समय के पाठ्यक्रम के लिए फिट
एम	R20:	समय (फ्रेम में) अधिकतम आयाम का 20% करने के लिए वृद्धि करने के लिए
एन	R50:	समय (फ्रेम में) अधिकतम आयाम का 50% करने के लिए वृद्धि करने के लिए
ओ	R80:	टाइम वृद्धि करने के लिएअधिकतम आयाम का 80% (फ्रेम में) करने के लिए
पी	R100:	समय (फ्रेम में) अधिकतम आयाम की 100% करने के लिए वृद्धि करने के लिए
प्र	F80:	समय (फ्रेम में) अधिकतम आयाम के 80% गिर करने के लिए
आर	F50 है:	समय (फ्रेम में) अधिकतम आयाम का 50% गिर करने के लिए
एस.	F20:	समय (फ्रेम में) अधिकतम आयाम के 20% गिर करने के लिए
टी	F0:	समय (फ्रेम में) पूर्व घटना आधारभूत पर लौटने के लिए

तालिका 1: एल्गोरिथ्म से आउटपुट डेटा।

Discussion

हम यहाँ वर्णन फ्लोरोसेंट सीए ^{2 +} संकेतकों का उपयोग सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल। इसके अलावा, हम पहचान और प्राप्त डेटा के विश्लेषण automates कि एक सहज उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ एक एल्गोरिथ्म का वर्णन है। यहाँ वर्णित प्रक्रिया फ्लोरोसेंट सीए ^{2 +} सूचक काल-520 का उपयोग, लेकिन इस तरह के Fluo-3, fluo-4, fluo-8 और ओरेगन ग्रीन BAPTA-1 के रूप में कई अन्य सीए ^{2 +} संवेदनशील रंगों छवि सीए करने के लिए अच्छी तरह से पर्याप्त रूप से प्रदर्शन ^{2 +} microdomains। केयर इन संकेतकों के उच्च आत्मीयता संस्करणों (~ 200-400 एनएम के कश्मीर _घ) छवि के लिए स्थानीय सीए ^{2 +} microdomains इस्तेमाल कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए उठाए जाने की जरूरत है, और इन संकेतकों का इष्टतम लोड हो रहा स्थितियों के लिए अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता है जांच के तहत प्रत्येक कोशिका प्रकार। उनके स्वभाव सीए द्वारा ^{2 +} संकेतक ^{2 +} बफ़र्स सीए के रूप में कार्य इस प्रकार सीए बाँध ^{2 +} और; इंडिका की उच्च लोड सांद्रतायहाँ वर्णित शर्तों लदान एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हैं, हालांकि tors, सीए ^{2 +} संकेतों दर्ज की जा रही है और / या intracellular organelles में तनहा किया जा सकता है के साथ हस्तक्षेप करने की क्षमता है। कुल मिलाकर, स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं की गतिविधि Ca इमेजिंग ^{2 +} microdomains आबाद है कि चैनलों को विनियमित कर सकते हैं कि एक सेल और साइटोसोलिक कारकों में से देशी वास्तुकला को बनाए रखने, कम आक्रामक है।

हम TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए यहाँ का वर्णन प्रोटोकॉल यह क्षणभंगुर क्षेत्र के भीतर झूठ बोल सीए ^{2 +} चैनलों से उठता है कि घटनाओं के लिए माप प्रतिबंधित स्पष्ट है कि सीमा में है। हालांकि, यह केवल प्लाज्मा झिल्ली में चैनलों तक ही सीमित है, और हम इस तरह की रियायत के प्लाज्मा झिल्ली ¹² के करीब स्थित है, लेकिन होना पाया गया है कि intracellular organelles में आईपी ₃ आर के रूप में चैनलों के लिए इसके लागू नहीं प्रदर्शित कर रहा हैअन्यथा देशी सेलुलर वातावरण में उनकी गतिविधियों की electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए दुर्गम होगा। Confocal इमेजिंग संकेतों के इमेजिंग सेल में गहरी उत्पन्न सक्षम है, लेकिन ऑप्टिकल खंड की मोटाई व्यापक (~ 800 100-200 एनएम बनाम एनएम) और जरूरत से अस्थायी समाधान में सीमित है कि में TIRF इमेजिंग की तुलना में नुकसान की है होगा confocal स्थान (एस) स्कैन करने के लिए। इमेजिंग एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक महामारी प्रतिदीप्ति मोड में किया गया है, क्योंकि स्थानीय और एकल चैनल सीए ^{2 +} संकेतों के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग आसानी से एक साथ electrophysiological पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।

प्रतिदीप्ति आराम के अनुपात के रूप में प्रतिदीप्ति सीए ^{2 +} संकेतों व्यक्त (ΔF / एफ ₀₎ यह संकेत आयाम का एक अच्छा रिश्तेदार उपाय प्राप्त करने के लिए संभव है। हालांकि, हम निरपेक्ष सीए ^{2 +} सांद्रता के संदर्भ में है स्थानीय, क्षणिक प्रतिदीप्ति परिवर्तन की है कि अंशांकन सावधानीउचित नहीं। एक सीए ^{2 +} रिलीज़ चैनल या चैनल के क्लस्टर के आसपास मुक्त [सीए ^{2 +]} और सीए ^{2 +} -bound सूचक की ढ़ाल ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा हल किया जा सकता है और इस तरह माइक्रोस्कोप की बात फैल समारोह से धुंधला हो जाएगा से संकरा है। चैनल खोलता है और बंद कर देता है इसके अलावा, स्थानीय [सीए ^{2 +]} चैनल ताकना के पास के इलाके में एक microsecond timescale पर बदल जाएगा। इस प्रकार, प्रतिदीप्ति संकेतों स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों ¹³ अंतर्निहित सच सीए ^{2 +} nanodomain का केवल एक धुंधला (अंतरिक्ष और समय में) प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं।

बहुत यहाँ वर्णित एल्गोरिथ्म कैमरा आधारित इमेजिंग से स्थानीय सीए ^{2 +} संकेतों के विश्लेषण की सुविधा। से कई घटनाओं से अस्थायी और स्थानिक डेटा दोनों उपज, पहचान और विश्लेषण न केवल स्वचालित करके उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह समाप्त हो रहा है, लेकिन छवि के ढेर के गीगाबाइट एक उच्च समानांतर फैशन में मिनट के भीतर कार्रवाई की जा सकतीएक साथ एक एकल कोशिका।

इस पांडुलिपि में डेटा आईपी सीए ^{2 +} संकेतों मध्यस्थता ₃ के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है, वर्णित दृष्टिकोण आसानी से साइटोसोलिक में स्थानीय परिवर्तन इमेजिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है [सीए ^{2 +]} ligand-, दूसरी messenger- के अनेक प्रकार से निकलती और वोल्टेज-गेटेड सीए ^{2 +} -permeable आयन चैनल। स्थानीय सीए ^{2 +} घटनाओं की स्वचालित पहचान और विश्लेषण के लिए एल्गोरिथ्म के उच्च throughput प्रकृति भी इस तरह के अल्जाइमर रोग और आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार के रूप में एकल कोशिका मॉडलों के माध्यम से सीए रोग राज्यों में ^{2 +} channelopathies इमेजिंग के लिए अत्यधिक उपयोगी साबित करना चाहिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C