Biology

Imaging locale Ca Published: March 3, 2015 doi: 10.3791/52516

DOI

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Jeffrey T. Lock¹, Kyle L. Ellefsen¹, Bret Settle¹, Ian Parker^1,2, Ian F. Smith¹

¹Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, ²Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

Abstract

Ca citosolico ^{2 +} ioni regolano numerosi aspetti della attività cellulare in quasi tutti i tipi di cellule, il controllo dei processi più ampio respiro, come la trascrizione genica, eccitabilità elettrica e la proliferazione cellulare. La diversità e la specificità di Ca ²⁺ segnale deriva da meccanismi con cui Ca ²⁺ segnali vengono generati ad agire su diversi temporali e spaziali scale, che vanno da oscillazioni e onde a livello delle cellule che si verificano durante i periodi di minuti per locali transitorie Ca ²⁺ microdomini (Ca ²⁺⁾ sbuffi millisecondi duraturi. I recenti progressi nella elettroni moltiplicati CCD (EMCCD) telecamere ora consente l'imaging di locali Ca ²⁺ segnali con una risoluzione spaziale 128 x 128 pixel a velocità> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps). Questo approccio è altamente parallelo e consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di canali o siti sfoglia in un singolo esperimento. Tuttavia, la grande quantità di dati generati (ca. 1 pe Gbr min) rendono identificazione visiva e l'analisi di Ca ²⁺ locale eventi impraticabile. Qui si descrivono e dimostrare le procedure per l'acquisizione, la rilevazione e l'analisi di IP locale ₃ mediata Ca ²⁺ segnali nelle cellule dei mammiferi intatte cariche di Ca ²⁺ indicatori utilizzando sia a livello di campo epi-fluorescenza (WF) e la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Inoltre, descriviamo un algoritmo sviluppato all'interno del software dell'ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi locali Ca ²⁺ segnali. L'algoritmo localizza i siti di rilascio di Ca ²⁺ con una risoluzione sub-pixel; permette recensione dei dati; e uscite sequenze temporali di segnali rapporto di fluorescenza con ampiezza e dati cinetici in una tabella compatibile con Excel.

Introduction

Ioni calcio (Ca ²⁺⁾ regolano ubiquitariamente una vasta gamma di processi biologici, tra cui l'espressione genica, la secrezione e cambiamenti duraturi nella plasticità sinaptica ^1. Un modo attraverso il quale Ca ²⁺ può agire in modo così eterogeneo è attraverso i diversi modelli spaziali e temporali di Ca ²⁺ segnala una cellula in grado di generare. Ad esempio aumenti globali in citosolico [Ca ^2+] contrazione grilletto nel tessuto muscolare liscio ² mentre più piccola, aumenti transitori localizzati (locali Ca ²⁺ microdomini) stimolare l'espressione genica indispensabile per l'apprendimento e la memoria ^3.

Citosolico libero [Ca ^2+] viene mantenuta a ~ 100 nm a riposo, ma può rapidamente salire a diversi micro-molare dopo l'afflusso di Ca ²⁺ nel citoplasma attraverso Ca ²⁺ canali ionici -permeable situati nella membrana plasmatica e la liberazione di Ca ²⁺ da s intracellulariTores. Il nostro laboratorio si concentra sulla inositolo 1,4,5-trifosfato recettore (IP ₃ R), che forma un canale di rilascio Ca ²⁺ trova nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER). In seguito al legame di entrambi IP ₃ e Ca ²⁺ al citosolico attivando siti del recettore, il canale IP ₃ R apre per liberare Ca ²⁺ sequestrato nel lume ER. Il rilascio di Ca ²⁺ può rimanere spazialmente limitata ad un piccolo gruppo di IP ₃ Rs per generare un microdomini citosolico locale del Ca ²⁺ (Ca ²⁺ sfoglia ⁴⁾ oppure, a seconda della prossimità del cluster vicini di IP ₃ Rs, può propagare una cella con l'assunzione di più siti sfoglia attraverso un processo di Ca ²⁺ indotta Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

L'introduzione di piccole molecole fluorescenti Ca ²⁺ indicatore coloranti sviluppato da Roger Tsien ^7, insieme con avanzate di microscopia Imagitecniche ng, ha notevolmente facilitato la nostra comprensione di Ca ²⁺ segnalazione. I recenti progressi nella telecamere utilizzate per microscopia permettono ora per l'imaging transitori locali Ca ²⁺ eventi come sbuffi con risoluzione spaziale e temporale senza precedenti. Attualmente disponibili telecamere EMCCD consentono di imaging con 128 x 128 pixel a> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps) e la nuova generazione di complementari a semiconduttore metallo-ossido (CMOS) telecamere forniscono pixel di risoluzione più alta, e la velocità ancora più veloce a scapito della leggermente superiore livelli di rumore. In combinazione con la riflessione interna (TIRF) microscopia totale è ora possibile per singola immagine Ca ²⁺ eventi di canale ^8,9. Questo approccio permette di immagini di centinaia di canali / eventi contemporaneamente, mentre la generazione di grandi quantità di dati (circa 1Gb al minuto) che rendono l'elaborazione manuale, identificazione visiva e l'analisi impraticabile e pongono un onere per lo sviluppo di algoritmi automatizzati.

2+ segnali nelle cellule di mammifero intatte utilizzando fluorescenti Ca ²⁺ indicatori. Dimostriamo inoltre un algoritmo sviluppato in ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi dei locali Ca ²⁺ eventi immaginati sia TIRF e convenzionale ampio campo epi-fluorescenza (WF) microscopia. Anche se descriviamo questi approcci nel contesto di IP ₃ -Generata Ca ²⁺ segnali, essi sono facilmente suscettibili di studiare i cambiamenti locali in citosolico [Ca ^2+] provenienti da una varietà di Ca ²⁺ canali ionici -permeable situate sia in superficie membrana o organelli intracellulari ^8-10.

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Protocol

Vi presentiamo le procedure dettagliate per l'imaging locali Ca ²⁺ eventi nelle cellule SH-SY5Y neuroblastoma umano. Tali procedure possono essere adattati a immagine intracellulare Ca ²⁺ segnali in molti tipi cellulari ^8-10.

1. Preparazione di cellule

Cultura le cellule per essere ripreso secondo le istruzioni elencate sul sito web del fornitore.
Pochi giorni prima di imaging, le cellule coltivate raccolto in un pallone di coltura di tessuto utilizzando 1 ml di 0,25% tripsina / EDTA (2-3 min). Dopo il distacco, aggiungere un volume uguale di terreni di coltura per inattivare la tripsina.
Eseguire un numero di cellule utilizzando un emocitometro e sementi cellule in piatti di imaging con fondo di vetro ad una densità di 3-7 x 10 ⁴ cellule per piatto. Selezionare le celle per esperimenti di imaging quando raggiungono il 60% di confluenza (2-3 giorni).

2. preparazione di soluzioni e reagenti

Preparare un Ca ²⁺ -contenenti HEPES bufferedsoluzione salina (Ca ²⁺ -HBSS) composto (mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 e 10 HEPES, glucosio; pH = 7,4 a temperatura ambiente (RT) con NaOH. Preparare Ca ²⁺ -HBSS senza l'aggiunta di glucosio e conservare a 4 ° C; aggiungere alla soluzione di glucosio immediatamente prima dell'uso.
Solubilizzare forme membrana permeanti della fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Cal-520 (1 mM), CI-IP ₃ (200 mM), e EGTA (100 mM) in dimetil solfossido (DMSO) contenente il 20% Pluronic F-127. Aliquota questi reagenti in provette Eppendorf e conservare, al riparo dalla luce e dall'umidità, a -20 ° C.

3. celle di carico con membrana permeabile Cal-520, ci-IP ₃ e EGTA

Preparare il "tampone di caricamento" diluendo soluzioni di riserva di membrana permeabile Cal-520 e ci-IP ₃ ad una concentrazione finale di 5 micron e 1 micron, rispettivamente, a Ca ²⁺ -HBSS.
Aspirare cusupporti lture e risciacquare cellule sostituendo media con Ca ²⁺ -HBSS tre volte.
Rimuovere Ca ²⁺ -HBSS e incubare cellule in tampone di caricamento per 60 minuti a temperatura ambiente al buio.
Rimuovere tampone di caricamento e lavare le cellule sostituendo media con Ca ²⁺ -HBSS tre volte.
1. Se lo si desidera, in questa fase, celle di carico con EGTA / AM diluendo la soluzione madre di una concentrazione finale di 5 micron di Ca ²⁺ -HBSS e poi incubare cellule per 30-60 min a RT al buio. A seguito di questa incubazione, lavare le cellule tre volte con Ca ²⁺ -HBSS prima di procedere alla fase 3.5.
Incubare le cellule a Ca ²⁺ -HBSS per 30 minuti per consentire la de-esterificazione di reagenti caricati.
Immediatamente prima di imaging, sostituire Ca ²⁺ -HBSS con "fresco" Ca ²⁺ -HBSS per rimuovere il colorante che potrebbe essere fuoriuscito nella vasca durante l'incubazione finale.

4. Ca ²⁺

Mettere una piccola goccia di olio per immersione sul 'obiettivo 100X APO TIRF (NA 1.49).
Montare il piatto di imaging sul palco del microscopio invertito e portare le cellule a fuoco con luce trasmessa. È importante proteggere il piatto di imaging per evitare movimenti durante la registrazione.
Illuminare le cellule con un laser 488 nm per eccitare Cal-520 e raccogliere fluorescenza emessa (λ> 510 nm) utilizzando una fotocamera EMCCD ad alta velocità.
NOTA: Il pacchetto software che opera il microscopio consente all'utente di tradurre una lente di focalizzazione consentendo il fascio laser da introdurre sia sul bordo estremo della apertura posteriore dell'obiettivo (per TIRF eccitazione) o più centralmente (per l'eccitazione "WF").
Utilizzando il software EMCCD, ridurre il campo dell'imaging dai pieni 512 x 512 pixel per raccogliere dati a risoluzione temporale necessaria per catturare locali Ca ²⁺ eventi.
NOTA: Per esempio, quad centroacquisizione di 256 x 256 pixels accelera il tasso di acquisizione di 66 fps. È anche possibile aumentare ulteriormente la frequenza di quadro della telecamera EMCCD a 500 fps utilizzando una funzione modalità coltura isolata.
Configurare il software per registrare automaticamente pochi secondi di attività di base, fornire un lampo UV alle cellule e continuare la registrazione per altri 10-30 secondi.
NOTA: Un flash UV viene trasportato utilizzando una sorgente di luce ad arco allo xeno introdotto attraverso un UV riflettente specchio dicroico nella porta posteriore del microscopio. La durata e l'intensità del flash UV è regolata empiricamente ad evocare una frequenza desiderata di locali Ca ²⁺ eventi.
Salvare i file come immagine pile per l'analisi off-line.

5. Automated Ca ²⁺ Analysis Immagine

NOTA: E 'possibile visualizzare, elaborare e analizzare i dati acquisiti utilizzando molti pacchetti software commerciali. Tuttavia, abbiamo sviluppato un algoritmo per automatizzare rapidamente all'identificazione di und analisi dei locali Ca ²⁺ segnali. Una descrizione dettagliata dei filtri spaziali e temporali utilizzati in questo algoritmo, generazione di Af / F ₀ e identificazione / analisi di routine può essere trovato in ^11. Questo algoritmo è stato sviluppato per funzionare su piattaforma software Python open-source, e può essere ottenuto, insieme ai campioni di dati sperimentali e istruzioni di utilizzo, inviando l'autore corrispondente (ismith@uci.edu).

Convertire i file da importare nella algoritmo personalizzato scritto nel formato di file multi-piano .tiff.
Individuare la cartella che contiene l'algoritmo di analisi e fare doppio clic run.exe.
Selezionare il file .tiff da analizzare.
Scegli parametri di analisi nella finestra di dialogo aperta. Vedi Figura 2A per i parametri di default per i dati di esempio.
Determinare il livello di nero per essere compensato dalla pila dell'immagine o spostando il cursore su una parte del campo di vista che fa not contengono una cella (Figura 2B) o inserendo manualmente un livello di nero con il prompt 'Set Black Level'.
Osservare quattro finestre sullo schermo seguente analisi dal software (Figura 2C-F). C è una immagine in bianco e nero di riposo di fluorescenza dalle cellule in fase di analisi. Quadrati bianchi sovrapposti su questa immagine sono i luoghi per eventi, determinati come le posizioni baricentro delle funzioni gaussiana bidimensionali dotati di eventi.
Clicca su ogni luogo dell'evento o premere i tasti cursore per scorrere tra gli eventi. Fatto questo il background-sottratto, gaussiana lisciato cambiamenti rapporto di fluorescenza (Af / F ₀₎ a ciascuno di questi update siti finestra D.
NOTA: Red evidenziato eventi sono determinati a provenire da quel particolare sito e non da 'sanguinare-through' dall'attività localizzata a siti adiacenti. La traccia blu inferiore indica se il segnale di fluorescenza al sito selezionato superato il rilevamentosoglia, mentre la linea nera identifica eventi provenienti da quel particolare sito (corrispondente al rosso eventi evidenziata).
Clicca su un rosso evidenziato evento per aggiornare finestra E che mostra l'evoluzione temporale della manifestazione, e finestra F che mostra il profilo spaziale della manifestazione mediata su suo sviluppo nel tempo, insieme con il profilo spaziale della funzione gaussiana attrezzata.
Rivedere manualmente gli eventi che sono stati identificati in modo che gli artefatti possono essere rifiutati dall'analisi. Eliminare tali eventi facendo clic destro rosso evidenziato eventi.
NOTA: Nelle nostre mani, Ca ²⁺ flusso attraverso i canali singoli IP ₃ R evoca segnali con Af / F ₀ su 0,11, quindi sono suscettibili di essere falsi positivi eventuali "eventi" rilevati sensibilmente più piccoli di questo.
Esportazione dei dati selezionando 'Salva in Excel' o esportare i dati su una base per cella disegnando intorno alla cella di interesse e selezionare 'Salva CellR17 ;.
Nota: i dati vengono salvati nella stessa cartella stack immagine originale.

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Representative Results

La figura 1A mostra un'immagine WF di riposo Cal-520 di fluorescenza in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y umani anche carichi di ci-IP _3. L'esposizione di queste cellule di un lampo di 100 msec UV per foto-release i-IP ₃ suscitato transitori Ca ²⁺ sbuffi in siti discreti (rilevate dai cerchi bianchi in Figura 1A). Tracce di fluorescenza misurati a questi siti hanno mostrato una rapida fase di lievitazione causa aperture transitori di IP ₃ R, seguita da una fase di caduta molto più lento (Figura 1B e 1C) come Ca ²⁺ lentamente diffusa lontano dal sito di rilascio. Red evidenziato eventi in Figura 1B sono segnali Ca ²⁺ che sono stati determinati dall'algoritmo abbia avuto origine dal sito selezionato. Eventi non evidenziati rappresentano contaminanti Ca ²⁺ segnali si diffondono da siti adiacenti.

Per ottenere una maggiore risoluzione delle immagini di Ca locale 2+ tampone EGTA. Questo chela Ca ²⁺ ioni si diffondono tra i siti a sbuffo e impedisce la generazione di Ca ²⁺ globali onde che offuscare lo studio dei locali Ca ²⁺ sbuffi generati dai singoli gruppi di IP ₃ Rs così. Inoltre, EGTA accelera il crollo del locale Ca ²⁺ microdominio ma, a causa della sua lenta cinetica di legame, perturba minimamente Ca ²⁺ gratuito locale e il suo legame con l'indicatore veloce Ca ²⁺ all'interno di un cluster. L'effetto netto di EGTA è quello di 'affinare' record di fluorescenza di sbuffi nello spazio e nel tempo, senza che sensibilmente diminuire la loro ampiezza. Un ulteriore miglioramento della risoluzione nasce utilizzando TIRF per limitare eccitazione delle Cal-520 fluorofori sulla stretta (<100 nm) onda evanescente creato da TIRF. La somma di entrambi questi approcci è una tecnica che controlla efficacemente istantanea Ca ²⁺ 2+ corrente) piuttosto che un integrale che perde di Ca ²⁺ dopo il rilascio attraverso le IP ₃ R e lentamente diffonde lontano dal sito di rilascio ed è infine sequestrato ^9. Figura 1D mostra il TIRF 'impronta' di una cella SH-SY5Y quando Cal-520 fluorofori sono eccitati solo all'interno di una distanza stretta nella cella dal / acquosa interfaccia soluzione coprioggetti. Legame di Ca ²⁺ all'indicatore veloce Cal-520 dye nei volumi attoliter citosoliche creati da illuminazione TIRF, in collaborazione con EGTA Rapid a 'mop' fino diffusiva Ca ^2+, segnali rendimenti fluorescenza che sono affilate in tempo e nello spazio ( Figura 1E e 1F).

L'analisi di stack di immagini catturate in questo modo viene notevolmente facilitato attraverso un algoritmo personalizzato scritto sviluppato nel nostro laboratorio in esecuzione sulla piattaforma open-source software Python ¹¹. La figura 2A mostra la finestra di dialogo di apertura in cui l'utente inserisce i parametri da utilizzare per l'identificazione e la successiva analisi di stack di immagini. A seguito di questo, all'utente viene richiesto di selezionare un livello di nero per essere sottratto l'intera serie di immagini, dopo che le piste di identificazione e analisi algoritmo Figura 2C-F mostrano, rispettivamente, i siti subcellulare di rilascio locale Ca ^2+.; attività a siti selezionati; singoli eventi su un calendario esteso; e profili spaziali di eventi rappresentativi (vedi figura 2 leggenda per i dettagli). Su recensione di siti individuati, i dati per tutti gli eventi (vedi Tabella 1) possono essere esportati selezionando la funzione 'Save a Excel' analizzato.

Figura 3 presenta i dati illustrano sia il miglioramento della risoluzione ottenuta da imaging TIRF in cellule EGTA-caricati rispetto a WF imaging cellule scaricati, e la power dell'algoritmo di identificare e analizzare locali Ca ²⁺ segnali. La figura 3A mostra un evento rappresentante locale ripreso da WF in una cella caricata solo con Cal-520 e ci-IP _3. Per confronto, la Figura 3B mostra un evento analogo ma ora ripreso con microscopia TIRF in una cella ulteriore carico di EGTA. Tracce sovrapposte in Figura 3C e 3D, illustrano corrispondenti temporale (C) e spaziali (D) profili di eventi registrati da WF fluorescenza senza EGTA (nero) e mediante microscopia TIRF con EGTA carico (rosso). Figura 3E trame significano misurazioni di ampiezze soffio , tempi di decadimento, e ampiezza spaziale in queste due condizioni, determinate con l'algoritmo per analizzare circa 44 (WF) e 88 (TIRF) eventi.

Figura 1: IP -evoked Ca ²⁺ locale segnali nelle cellule SH-SY5Y carichi di Immagine monocromatica di Cal-520 e ci-IP ₃ ripreso dal livello di campo (da A a C) e TIRF (D a F) microscopio. (A) riposo Cal-520 fluorescenza su cui ubicazione dei siti puff sono indicati da cerchi bianchi; bar scala = 10 micron. (B) Tracce illustrano sbuffi evocati a tre diversi siti, numerate come in (A). Red evidenziato eventi sono sbuffi identificati abbia avuto origine da quel particolare sito. La freccia indica il tempo di Flash UV. (C) tracce sovrapposte di rappresentanza Ca ²⁺ sbuffi come quelle in (B), allineati e mostrato su scala allargata. 'Impronta' immagine monocromatica TIRF di riposo Cal-520 di fluorescenza a SH (D) cellule -SY5Y caricate con ci-IP ₃ e EGTA. Cerchi bianchi denotano origini sito soffio. (E) (F) tracce sovrapposte di rappresentativi Ca ²⁺ sbuffi come quelle in (E), allineate e mostrato in scala ampliata.

Figura 2: Interfaccia utente di codice personalizzato progettato per identificare automaticamente e analizzare locali Ca ²⁺ segnali nelle cellule SH-SY5Y immaginati microscopio TIRF (A) Apertura finestra di dialogo in cui vengono inseriti i parametri di identificazione e analisi (B) L'utente seleziona una.. . regione dell'immagine che contiene le cellule per definire il livello di nero che viene sottratto dai tutti i fotogrammi della pila di immagini (C - F). Screenshots delle finestre di analisi finale / identificazione (C) Immagine di riposo Cal-5 20 fluorescenza su cui sono sovrapposti posizioni dove Ca ²⁺ transitori sono stati identificati (quadrati bianchi). L'utente può ciclo tra i siti muovendo il mouse sull'immagine o premendo i tasti cursore. (D) Finestra che mostra il rapporto di fluorescenza (Af / F ₀₎ traccia all'evento selezionato. Eventi evidenziati in rosso sono identificati come siano verificate nel sito selezionato. La barra blu inferiore indica gli eventi che superano la soglia per il rilevamento in quel sito; eventi non evidenziate rosso sono stati localizzati in un sito adiacente. Facendo clic sulla barra blu porta l'utente al sito dell'evento. Cliccando su un evento rosso con il mouse apre due ulteriori finestre che mostrano l'evoluzione temporale della manifestazione su un arco di tempo esteso (E) e profili spaziali (F) dell'evento mediata su suo sviluppo nel tempo (a sinistra) con il profilo spaziale l'attrezzata gaussiana (a destra).e.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: miglioramento nella fedeltà temporale e spaziale di pasta di imaging raggiunto da microscopia TIRF unitamente loading intracellulare di EGTA (A) immagine istantanea di un soffio catturato al momento di ampiezza di picco, sovrapposto un'immagine di riposo fluorescenza di sfondo. mostrano la struttura di cella. L'immagine è stata ottenuta WF microscopio di una cella non caricato con EGTA. L'immagine soffio è pseudocolored, con alti livelli di Ca ²⁺ indicati con colori sempre più 'caldi'. (B) corrispondente immagine di un soffio ripreso al microscopio TIRF in una cella caricato con EGTA. (C) Tracce, WF (nero) o TIRF + EGTA (rosso), mostra la corrispondente variazione del Cal-520 fluorescence nel tempo per i Ca ²⁺ sbuffi mostrati in (A) e (B) di cui sopra. Tracce sono normalizzati per la stessa ampiezza di picco e allineato al loro tempo di picco per facilitare il confronto delle loro cinetiche. Annotazioni illustrano le misure di Ca ²⁺ parametri dell'evento (ampiezza e cadono ora) quantificato in (E). (D) Tracce, WF (nero) o TIRF + EGTA (rosso), mostrano l'intensità di fluorescenza di una linea di scansione attraverso il Ca ^{2 +} sbuffi mostrati in (A) e (B). Scansioni di linea sono normalizzati alle loro ampiezze di picco, e centrati. L'annotazione mostra la misura di larghezza a metà ampiezza massima (FWHM), come quantificato in (E). (E) Bar grafici che mostrano le ampiezze medie di picco (in alto), cadono volte dal 80% al 20% del picco di ampiezza (al centro), e la larghezza dello spazio (FWHM) di sbuffi immaginati mediante microscopia WF in celle senza EGTA (bar aperti) e microscopia TIRF in cellule EGTA-caricato (barre grigie). I dati sono presentati come media ± SEM con n di almeno 37 sbuffiper WF e 79 per TIRF. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

A.	Group #	Numero identità del sito Event
B.	GROUPx:	Media sub-pixel x posizione di tutti gli eventi in un determinato sito
C.	Groupy:	Media sub-pixel y posizione di tutti gli eventi in un determinato sito
D.	Eventi No.:	Numero di eventi che si verificano in un sito nel corso dell'esperimento.
E.	Max Amp:	Massima ampiezza di un evento in quel particolare sito (Af / F ₀₎
F.	X:	Sub-pixel x localizzazione dell'evento
G.	Y:	Sub-pixel ylocalization di evento
H.	T_peak:	Ora in cui l'evento raggiunge ampiezza di picco (in numero di telaio)
I.	Ampiezza:	Ampiezza di tutti gli eventi provenienti da ogni sito (Af / F ₀₎
J.	Sigmax:	X SD profilo gaussiano montato corso ora (in pixel)
K.	Sigmay:	Y SD profilo gaussiano montato corso ora (in pixel)
L.	Angolo:	Angolo dell'asse longitudinale della funzione ellittica risultante gaussiana montato corso ora
M.	R20:	Tempo a salire al 20% di ampiezza massima (in frame)
N.	R50:	Tempo a salire al 50% del massimo di ampiezza (in frames)
O.	R80:	Tempo a salireal 80% del valore di ampiezza (in frame)
P.	R100:	Tempo di salire al 100% di ampiezza massima (in frame)
Q.	F80:	Tempo di caduta al 80% del valore di ampiezza (in frames)
R.	F50:	Tempo di caduta al 50% del massimo di ampiezza (in frames)
S.	F20:	Tempo di caduta al 20% del massimo di ampiezza (in frames)
T.	F0:	È ora di tornare a pre-evento di riferimento (in frames)

Tabella 1: I dati di uscita da un algoritmo.

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Discussion

Descriviamo qui di protocolli per l'imaging locali Ca ²⁺ eventi in cellule di mammifero utilizzando fluorescenti Ca ²⁺ indicatori. Inoltre, descriviamo un algoritmo con un'interfaccia utente intuitiva che consente di automatizzare l'identificazione e l'analisi dei dati acquisiti. La procedura descritta qui utilizzare la fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Cal-520, ma molti altri Ca ²⁺ coloranti sensibili come Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Oregon verde BAPTA-1 eseguire sufficientemente all'immagine Ca ²⁺ microdomini. Cura ha bisogno di essere prese per garantire che le versioni ad alta affinità (K _d del ~ 200-400 nm) di questi indicatori sono utilizzati per l'immagine locale Ca ²⁺ microdomini, e le condizioni di carico ottimali di questi indicatori devono essere determinati empiricamente per ogni tipo di cellula in esame. Per loro natura Ca ²⁺ indicatori legano Ca ²⁺ e quindi agire come Ca ²⁺ buffer; Le concentrazioni più elevate di carico indicatori hanno il potenziale di interferire con i segnali Ca ²⁺ in fase di registrazione e / o possono essere sequestrate in organelli intracellulari, anche se le condizioni di carico qui descritti sono un buon punto di partenza. Nel complesso, l'imaging l'attività di locali Ca ²⁺ eventi è minimamente invasiva, mantenendo l'architettura originaria di un cellulare e fattori citosolici che possono regolare i canali che sono alla base di Ca ²⁺ microdomini.

Il protocollo che descriviamo qui per imaging ad alta risoluzione di locali Ca ²⁺ segnali utilizzando la microscopia TIRF ha la limitazione evidente in quanto limita le misure di eventi che nascono da Ca ²⁺ canali che si trovano all'interno del campo evanescente. Tuttavia, non è limitato ai canali nella membrana plasmatica, e dimostrare la sua applicabilità ai canali come il IP ₃ R in organelli intracellulari che sono stati trovati per essere preferenzialmente situato vicino alla membrana plasmatica ¹² maaltrimenti sarebbero inaccessibili alla registrazione elettrofisiologica della loro attività in ambiente cellulare nativo. Confocale consentirebbe imaging segnali generati profondo nella cella, ma presenta svantaggi rispetto ai TIRF imaging che lo spessore della sezione ottica è più ampia (~ 800 nm vs 100-200 nm) ed è limitata in risoluzione temporale dalla necessità scansionare il punto confocale (s). Poiché l'imaging avviene in una modalità fluorescenza utilizzando un microscopio invertito, registrazioni ottiche di Ca ²⁺ segnali locali e single-channel possono essere facilmente combinati con contestuale registrazione di patch-clamp elettrofisiologia.

Esprimendo fluorescenza Ca ²⁺ segnali come rapporto di riposo fluorescenza (Af / F ₀₎ è possibile ottenere una buona misura relativa delle ampiezze dei segnali. Tuttavia, si avverte che la taratura dei cambiamenti, fluorescenza transitorie locali in termini di assoluto Ca ²⁺ concentrazioni ènon è appropriato. I gradienti di indicatore libero -bound [Ca ^2+] e Ca ²⁺ intorno ad un canale di Ca ²⁺ rilascio o gruppo di canali è più stretto può essere risolto mediante microscopia ottica e saranno così offuscata dalla funzione punto diffusione del microscopio. Inoltre, locale [Ca ^2+] nelle immediate vicinanze del poro canale cambia su una scala temporale microsecondo come canale si apre e si chiude. Così, i segnali di fluorescenza forniscono solo una (nello spazio e nel tempo) rappresentazione offuscata della vera Ca ²⁺ nanodomain sottostante locali Ca ²⁺ segnali ^13.

L'algoritmo descritto qui notevolmente facilita l'analisi dei locali Ca ²⁺ segnali di imaging basato su fotocamera. Automatizzando l'identificazione e l'analisi non solo è pregiudizi utente eliminato, ma gigabyte di pile di immagini può essere elaborato in pochi minuti in modo altamente parallelo, ottenendo sia i dati temporali e spaziali di più eventi dauna singola cellula simultaneamente.

Sebbene i dati in questo manoscritto sono presentati nel contesto di IP ₃ mediata Ca ²⁺ segnali, gli approcci descritti possono essere facilmente estesi all'imaging variazioni locali nel citosolico [Ca ^2+] emana da numerosi tipi di legame-, secondo messenger- e Ca ²⁺ canali ionici voltaggio-dipendenti -permeable. La natura high-throughput dell'algoritmo per automatizzare l'identificazione e l'analisi dei locali Ca ²⁺ eventi dovrebbe rivelarsi molto utile per l'imaging Ca ²⁺ canalopatie in stati di malattia tramite modelli unicellulari come le malattie e disturbi dello spettro autistico di Alzheimer.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP₃(D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C