Abstract
Cytosolisk Ca 2 + ioner regulerer mange aspekter av cellulær aktivitet i nesten alle celletyper, kontrollerende prosesser som vidtrekk som gentranskripsjon, elektrisk oppstemthet og celledeling. Mangfoldet og spesifisitet av Ca 2+ signale stammer fra mekanismer som Ca 2 + signaler genereres til å handle over ulike tids og romlige skalaer, fra celle-wide svingninger og bølger som oppstår i løpet av de perioder av minutter til lokale forbigående Ca 2 + mikroområder (Ca 2+ puffs) varige millisekunder. Nylige fremskritt i elektron multiplisert CCD (EMCCD) kameraer nå tillate for avbildning av lokale Ca 2+ signaler med en 128 x 128 pikslers romlig oppløsning ved hastigheter på> 500 rammer sek -1 (fps). Denne fremgangsmåten er svært parallelle og muliggjør samtidig overvåkning av flere hundre kanaler eller puff områder i et enkelt eksperiment. Men de enorme mengder data som genereres (ca 1 Gb per min) gjengi visuell identifisering og analyse av lokale Ca 2+ hendelser upraktisk. Her beskriver vi og demonstrere prosedyrene for erverv, deteksjon og analyse av lokal IP 3-formidlet Ca 2 + signaler i intakte pattedyrceller lastet med Ca 2+ indikatorer som bruker både vidvinkel epi-fluorescens (WF) og total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Videre beskriver vi en algoritme utviklet innen åpen kildekode miljøet Python som automatiserer identifisering og analyse av disse lokale Ca 2+ signaler. Algoritmen lokaliserer områder av Ca 2+ utgivelsen med sub-piksler; lar brukeren gjennomgang av data; og utganger tids sekvenser av fluorescens ratio signaler sammen med amplitude og kinetiske data i et Excel-kompatibelt tabellen.
Introduction
Kalsiumioner (Ca 2+) ubiquitously regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser, herunder genuttrykk, sekresjon og varige endringer i synaptisk plastisitet en. En måte gjennom hvilke Ca 2+ kan opptre på en slik mangfoldig måte er gjennom de ulike romlige og tidsmessige mønstre av Ca 2+ signaliserer en celle kan generere. For eksempel globale økninger i cytosolisk [Ca 2+] trigger sammentrekning i glatt muskelvev to mens mindre, lokale Forbigående økning (lokale Ca 2+ mikroområder) stimulere genuttrykk viktig for læring og hukommelse tre.
Cytosolisk fri [Ca2 +] holdes ved ~ 100 nM ved hvile, men kan raskt stige til flere mikro molar etter tilførsel av Ca2 + inn i cytosol gjennom Ca 2+ -permeable ionekanaler lokalisert i plasmamembranen og etter frigjøringen av Ca 2+ fra intracellulære sTores. Laboratoriet fokuserer på inositol 1,4,5-trisphosphate reseptor (IP 3 R), som danner en Ca2 + frigivelse kanal plassert i det endoplasmatiske retikulum (ER) membran. Ved binding av både IP 3 og Ca 2+ til cytosoliske aktiverende områder av reseptoren, åpnes IP 3 R-kanal for å frigjøre Ca 2+ sekvestrert innenfor ER lumen. Utgivelsen av Ca 2+ kan forbli romlig begrenset til en liten klynge av IP 3 R for å generere en lokal cytosolisk microdomain av Ca 2+ (Ca 2+ puff 4) eller, avhengig av nærhet til nabo klynger av IP 3 R, kan forplante gjennom en celle ved å rekruttere flere puffsider gjennom en prosess med Ca 2+ -indusert Ca 2+ -release (CICR) 5,6.
Innføringen av fluorescerende lite molekyl Ca 2+ indikatorfarger utviklet av Roger Tsien 7, kombinert med avansert mikros Imaging teknikker, har i stor grad vår forståelse av Ca 2+ signalering. Nylige fremskritt i kameraene som brukes for mikros nå tillate for avbildning forbigående lokale Ca 2+ arrangementer som puffs med enestående romlig og tidsmessig oppløsning. For tiden tilgjengelige EMCCD kameraer aktiver bildebehandling med 128 x 128 piksler på> 500 rammer sek -1 (fps) og den nye generasjonen av Complementary Metal Oxide Semiconductor (CMOS) kameraer gir høyere pikseloppløsning, og enda raskere hastighet på bekostning av noe høyere støynivå. I forbindelse med total intern refleksjon (TIRF) mikroskopi er det nå mulig å avbilde enkelt Ca 2+ kanal hendelser 8,9. Denne tilnærmingen gjør det mulig for avbildning av hundrevis av kanaler / hendelser samtidig, mens generere store datasett (ca. 1 Gb per min) som gjør manuell behandling, visuell identifisering og analyse upraktisk og plassere en tyngende på utvikling av automatiserte algoritmer.
2+ signaler i intakte pattedyrceller ved hjelp av fluorescerende Ca 2 + indikatorer. Vi ytterligere demonstrere en algoritme utviklet i åpen kildekode-miljøet Python som automatiserer identifisering og analyse av lokale Ca 2+ hendelser fotografert av både TIRF og konvensjonell bredt felt epi-fluorescens (WF) mikroskopi. Selv om vi beskrive disse tilnærminger i sammenheng med IP 3 dannede Ca 2+ signaler, de er lett mottagelig for å studere lokale endringer i cytosol [Ca2 +] som utgår fra en rekke Ca 2+ -permeable ionekanaler lokalisert i enten overflaten membran eller intracellulære organeller 8-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi presenterer detaljerte prosedyrer for bildebehandling lokale Ca 2+ hendelser i menneskelig neuroblastom SH-SY5Y celler. Disse fremgangsmåtene kan tilpasses bilde intracellulær Ca2 + signaler i mange celletyper 8-10.
1. Fremstilling av cellene
- Kultur cellene som skal avbildes i henhold til instruksjonene oppført på deres leverandør hjemmeside.
- Et par dager før bildebehandling, slakte celler dyrket i et vevskulturkolbe bruker 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (2-3 min). Etter løsrivelse, legge til et likt volum av kultur media for å inaktivere trypsin.
- Utfør en celletall ved hjelp av en hemocytometer og frø celler i glassbunn bilde retter med en tetthet på 3-7 x 10 4 celler per tallerken. Velg celler for bildebehandling eksperimenter når de når 60% samløpet (2-3 dager).
2. Fremstilling av løsninger og reagenser
- Forberede en Ca 2+ -inneholdende HEPES bufretsaltoppløsning (Ca 2+ -HBSS) bestående av (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, og 10 glukose; pH = 7,4 ved romtemperatur (RT) med NaOH. Forberede Ca 2+ -HBSS uten tilsetning av glukose og oppbevares ved 4 ° C; legge glukose til oppløsningen umiddelbart før bruk.
- Oppløseliggjøre membran permeant former av det fluorescerende Ca 2+ indikator Cal-520 (1 mM), ci-IP 3 (200 pM), og EGTA (100 mM) i dimetylsulfoksyd (DMSO) inneholdende 20% Pluronic F-127. Alikvoter disse reagensene i Eppendorf-rør og lagre, skjermet mot fuktighet og lys, ved -20 ° C.
3. Legge Celler med Membran-permeant Cal-520, ci-IP 3 og EGTA
- Klargjør "loading buffer" ved å fortynne stamløsninger av membran-permeant Cal-520 og ci-IP 3 til en endelig konsentrasjon på 5 uM og 1 jjM, henholdsvis i Ca2 + -HBSS.
- Aspirer cuLTURE media og skyll celler ved å erstatte media med Ca 2+ -HBSS tre ganger.
- Fjern Ca 2+ -HBSS og inkuberes cellene i ladningsbuffer i 60 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Fjern lasting buffer og skyll celler ved å erstatte media med Ca 2+ -HBSS tre ganger.
- Dersom det er ønskelig, på dette trinn, lastceller med EGTA / AM ved å fortynne stamløsning til en endelig konsentrasjon på 5 uM i Ca 2+ -HBSS og deretter inkuberes cellene i 30-60 minutter ved romtemperatur i mørke. Etter dette inkubasjon, skyll celler tre ganger med Ca 2+ -HBSS før du går videre til trinn 3.5.
- Inkuber cellene i Ca 2+ -HBSS i 30 minutter for å tillate de-forestring av lastede reagenser.
- Umiddelbart før avbildning, erstatte Ca 2+ -HBSS med "friske" Ca 2+ -HBSS for å fjerne ethvert fargestoff som kan ha lekket inn i badet i løpet av den endelige inkubering.
4. Ca 2+
- Legg en liten dråpe av nedsenking olje på 100X APO TIRF objektiv (NA 1.49).
- Montere bilde fatet på scenen av invertert mikroskop og bringe cellene i fokus ved hjelp av lyset. Det er viktig å sikre at avbildnings fatet for å forhindre bevegelse under opptaket.
- Belyse celler med en 488 nm laser for å opphisse Cal-520 og samle slippes fluorescens (λ> 510 nm) ved hjelp av en høyhastighets EMCCD kamera.
MERK: Programvarepakken som driver mikroskop tillater brukeren å oversette en fokusering slik at laserstrålen til å bli innført enten på den ekstreme kanten av objektiv tilbake blenderåpning (for TIRF eksitasjon) eller mer sentralt (for "WF" eksitasjon). - Bruke EMCCD programvare, redusere bildefelt fra de fulle 512 x 512 piksler for å samle inn data på den nødvendige tidsoppløsning for å fange opp lokale Ca 2+ arrangementer.
MERK: For eksempel, senter quaderverv av 256 x 256 piksler hastigheter opp oppkjøpet hastighet til 66 fps. Det er også mulig å ytterligere øke bildefrekvens av EMCCD kamera til 500 fps med en Isolert med beskjæring funksjon. - Konfigurere programvaren for automatisk å spille inn noen sekunder av baseline aktivitet, levere en UV flash til cellene og fortsette opptak for en annen 10-30 sek.
MERK: En UV blitsen er levert med en Xenon arc lyskilde innført gjennom et UV reflekterende dichroic speil i den bakre porten på mikroskop. Varigheten og intensiteten av UV flash justeres empirisk å fremkalle en ønsket frekvens av lokale Ca 2+ arrangementer. - Lagre filer som bilde stabler for off-line analyse.
5. Automated Ca 2+ bildeanalyse
MERK: Det er mulig å vise, behandle og analysere fanget data ved hjelp av mange kommersielle programvarepakker. Vi har imidlertid utviklet en algoritme for å raskt automat identifikasjon end analyse av lokale Ca 2+ signaler. En detaljert beskrivelse av de romlige og tidsmessige filtre som brukes i denne algoritmen, kan generering av AF / F 0 og identifikasjon / analyserutiner som befinner seg i 11. Denne algoritmen er utviklet for å kjøre på åpen kildekode-plattform Python, og kan oppnås, sammen med eksempel eksperimentelle data og detaljerte brukerinstruksjoner, via e-post tilsvarende forfatter (ismith@uci.edu).
- Konvertere filer som skal importeres inn i skredder skrevet algoritme til multi-plane TIFF filformat.
- Finn mappen som inneholder analyse algoritmen og dobbeltklikk på run.exe.
- Velg TIFF-fil som skal analyseres.
- Velg parametre analyse i den åpne dialogboksen. Se figur 2A for standard parametere for eksempel data.
- Bestem svartnivå til å bli forskjøvet fra bildestakk enten ved å flytte markøren til en del av synsfeltet som gjør not inneholde en celle (se figur 2B) eller ved manuelt å skrive en svartnivå ved hjelp av "Set Black Level 'prompt.
- Observere fire vinduer på skjermen følgende analyse av programvaren (Figur 2C-F). C er et sort-hvitt bilde av hvil fluorescens fra cellene som blir analysert. Hvite firkanter oppå dette bildet er hendelses steder, fastsatt som tyngdepunktstillinger av to-dimensjonale Gaussian funksjoner montert hendelser.
- Klikk på hver enkelt arrangementssted eller trykk piltastene for å bla mellom hendelser. Når du gjør det bakgrunnen korrigert, Gaussian glattet fluorescens ratio endringer (AF / F 0) på hvert av disse områdene oppdatering i vinduet D.
MERK: Red uthevet hendelser er fast bestemt på å stamme fra det aktuelle området, og ikke fra "blø-through 'fra aktivitet lokalisert til tilstøtende områder. Den nedre blå strek indikerer hvor fluorescens-signalet ved den valgte område overskrides påvisningterskel, mens den svarte linjen identifiserer hendelsene som stammer fra det aktuelle området (tilsvarende den røde markert hendelser). - Klikk på en rød uthevet begivenhet for å oppdatere vindu E som viser endringen over hendelsen, og vindu F som viser den romlige profilen til arrangementet i gjennomsnitt over sin tid selvfølgelig, sammen med den romlige profilen til den montert Gaussian funksjonen.
- Manuelt gjennomgå hendelsene som er identifisert, slik at gjenstander kan bli avvist fra analyse. Slett slike hendelser ved å høyreklikke på den røde uthevet hendelser.
MERK: I våre hender, Ca 2+ fluks gjennom enkelt IP 3 R kanaler fremkaller signaler med AF / F 0 om 0.11, så noen oppdaget 'hendelser' vesentlig mindre enn dette vil trolig være falske positiver. - Eksportere data ved å velge "Lagre til Excel eller eksportere data på en per celle basis ved å tegne rundt cellen av interesse og velge" Lagre CellR17 ;.
MERK: Data lagres i samme mappe som den opprinnelige bildestakk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a viser en WF bilde av hvile Cal-520 fluorescens i menneskelige neuroblastom SH-SY5Y celler også lastet med ci-IP 3. Eksponering av disse cellene til en 100 msek UV flash til foto-release i-IP 3 fremkalte forbigående Ca 2 + puff ved diskrete områder (fremgår av de hvite sirklene i figur 1A). Fluorescens spor, målt på disse stedene viste en hurtig stigende fase på grunn av forbigående åpninger av IP 3 R, etterfulgt av en mye langsommere fallende fase (figur 1B og 1C) som Ca2 + langsomt diffunderer bort fra frigjøringsstedet. Red markert hendelser i figur 1B er Ca 2+ signaler som ble bestemt av algoritmen for å ha sin opprinnelse fra det valgte området. Ikke-markerte hendelser representerer forurensende Ca 2 + signaler som diffunderer fra nært tilstøtende områder.
For å oppnå høyere oppløsning avbildning av lokale Ca
Analysen av bildestakker fanget på denne måten er sterkt tilrettelagt gjennom en tilpasset skriftlig algoritme utviklet i vår lab kjører på open-source programvareplattform Python 11. Figur 2A viser åpningsdialogvindu hvor brukeren angir parametere som skal brukes for identifikasjon og påfølgende analyse av bildestakker. Etter dette, blir brukeren bedt om å velge et svartnivå som skal trekkes fra hele bildestakk etter identifisering og analyse algoritmen kjører Figur 2C-F viser henholdsvis den subcellulære områder av lokal Ca 2+ utgivelse.; aktivitet på utvalgte områder; enkelthendelser på en utvidet tidsskala; og romlige profiler av representative hendelser (se Figur 2 legende for detaljer). Ved bruker gjennomgang av identifiserte områder, analysert data for alle hendelser (se tabell 1) kan eksporteres ved å velge "Lagre til Excel-funksjon.
Figur 3 presenterer data som illustrerer både forbedring i oppløsningen oppnås ved TIRF avbildning i EGTA belastede celler sammenlignet med WF avbildning i ubelastede celler, og power av algoritmen for å identifisere og analysere lokale Ca 2+ signaler. Figur 3A viser en representativ lokal hendelse avbildes ved WF i en celle lastet bare med Cal-520 og ci-IP 3. Til sammenligning viser figur 3B et analogt hendelse, men nå avbildes ved TIRF mikros i en celle videre lastet med EGTA. Lagret spor i Figur 3C og 3D, illustrere tilsvarende timelige (C) og romlig (D) profiler av hendelser registrert av WF fluorescens uten EGTA (svart) og ved TIRF mikroskopi med EGTA lasting (rød). Figur 3E tomter bety målinger av puff amplitudes ,, bestemt -falltid og romlig bredde under disse to forholdene hjelp av algoritmen for å analysere omtrent 44 (WF) og 88 (TIRF) hendelser.
Figur 1: IP
Figur 2: Brukergrensesnittet i definert kode utformet for å automatisk identifisere og analysere lokale Ca 2+ signaler i SH-SY5Y celler fotografert av TIRF mikroskopi (A) Åpning dialogboks der identifisering og analyseparametere føres (B) Brukeren velger en.. . region av bildet som ikke inneholder celler for å definere den svartnivå som er trukket fra alle rammer i bildestakk (C - F). Skjermbilder av de endelige / identifikasjon analyse windows (C) Bilde av hvile Cal-5 20 fluorescens som er lagt steder hvor Ca 2 + transienter ble identifisert (hvite firkanter). Brukeren kan sykle mellom områder ved å bevege musen over bildet eller trykke piltastene. (D) Vindu som viser fluorescens ratio (AF / F 0) spor på den valgte hendelsen. Rød-uthevet hendelser er identifisert som å ha oppstått ved det valgte området. Den nedre blå linjen viser hendelser som overstiger terskelen for deteksjon på det området; hendelser ikke uthevede røde har blitt lokalisert til et tilstøtende område. Ved å klikke på den blå linjen tar brukeren til at hendelsen området. Ved å klikke på en rød hendelse med musen åpner opp ytterligere to vinduer som viser endringen over hendelsen på en utvidet tidsskala (E) og romlige profiler (F) av hendelsen i gjennomsnitt over sin tid kurset (til venstre) sammen med den romlige profil montert Gaussian (til høyre).e.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Forbedring i tidsmessig og romlig gjengivelse av puff bildebehandling oppnås ved bruk av TIRF mikroskopi i forbindelse med intracellulære lasting av EGTA (A) øyeblikksbilde av en puff fanget på tidspunktet for peak amplitude, oppå et bakgrunnsbilde av hvile fluorescens til. viser cellen disposisjon. Bildet ble oppnådd ved WF mikroskopi av en celle som ikke er ladet med EGTA. Den puff bildet er pseudocolored, med høyere Ca 2+ nivåer merket med stadig mer "varme" farger. (B) Tilsvarende bilde av en puff avbildes ved TIRF mikroskopi i en celle lastet med EGTA. (C) Traces, WF (svart) eller TIRF + EGTA (rød), viser den tilsvarende forandring i Cal-520 fluorescence over tid for Ca2 + drag som er vist i (A) og (B) ovenfor. Spor er normalisert til samme peak amplitude og justert til sitt peak tid til å legge til rette for sammenligning av deres kinetikk. Merknader illustrere målinger av Ca 2+ hendelsesparametre (amplitude og fall tid) kvantifisert i (E). (D) Traces, WF (svart) eller TIRF + EGTA (rød), viser fluorescens intensitet av en linje skanne gjennom Ca 2 + drag som er vist i (A) og (B). Linjeavsøkingene er normalisert til sine peak amplituder, og sentrert. Den annotering viser måling av full bredde ved halvparten av maksimal amplitude (FWHM), som kvantifisert i (E). (E) søylediagram som viser gjennomsnittlig peak amplituder (øverst), faller ganger fra 80% til 20% av peak amplitude (i midten), og romlig bredde (FWHM) av puffs fotografert av WF mikros i celler uten EGTA (åpne søyler) og etter TIRF mikros i EGTA belastede celler (grå søyler). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM med en n på minst 37 dragfor WF og 79 for TIRF. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| A. | Group # | Hendelsen området fødselsnummer |
| B. | GroupX: | Bety sub-pixel x plasseringen av alle hendelser på et bestemt nettsted |
| C. | Groupy: | Bety sub-pixel y plasseringen av alle hendelser på et bestemt nettsted |
| D. | Antall hendelser: | Antall hendelser som opptrer på et område i løpet av eksperimentet. |
| E. | Max Amp: | Maksimal amplitude av en hendelse på det aktuelle stedet (AF / F 0) |
| F. | X: | Sub-pixel x lokalisering av hendelsen |
| G. | Y: | Sub-pixel vlocalization arrangement |
| H. | T_peak: | Tidspunktet da hendelsen når peak amplitude (i rammenummeret) |
| I. | Amplitude: | Amplitude av alle hendelser som stammer fra hvert område (AF / F 0) |
| J. | Sigmax: | X SD av Gaussian profil montert til annen løpet av arrangementet (i piksler) |
| K. | Sigmay: | Y SD av Gaussian profil montert til annen løpet av arrangementet (i piksler) |
| L. | Vinkel: | Vinkel på lengdeaksen av den resulterende elliptisk funksjon av Gaussian montert på tidsforløpet av arrangementet |
| M. | R20: | Tid til å stige til 20% av maksimal amplitude (i rammer) |
| N. | R50: | Tid til å stige til 50% av maksimal amplitude (i rammer) |
| O. | R80: | Tid til å stigetil 80% av maks amplitude (i rammer) |
| P. | R100: | Tid til å stige til 100% av maksimal amplitude (i rammer) |
| Q. | F80: | Tid til å falle til 80% av maks amplitude (i rammer) |
| R. | F50: | Tid til å falle til 50% av maks amplitude (i rammer) |
| S. | F20: | Tid til å falle til 20% av maks amplitude (i rammer) |
| T. | F0: | Tid for å gå tilbake til pre-event baseline (i rammer) |
Tabell 1: Utdata fra algoritme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her protokoller for avbildning lokale Ca 2+ hendelser i dyrkede pattedyrceller ved hjelp av fluorescerende Ca 2 + indikatorer. Videre beskriver vi en algoritme med et intuitivt brukergrensesnitt som automatiserer identifisering og analyse av innsamlede data. Fremgangsmåten beskrevet her utnytte den fluorescerende Ca 2+ indikator Cal-520, men mange andre Ca 2+ følsomme fargestoffer som Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 og Oregon Grønn BAPTA-1 utføre tilstrekkelig godt til bilde Ca 2+ mikroområder. Care trenger å bli tatt for å sikre at de høyaffinitet versjoner (K d av ~ 200-400 nm) av disse indikatorene er vant til bilde lokale Ca 2+ mikroområder, og de optimale belastningsforhold for disse indikatorene må bestemmes empirisk for hver celletype under etterforskning. I sin natur Ca 2 + indikatorer binde Ca 2+ og dermed virke som Ca 2 + buffere; høyere laste konsentrasjoner av indicatorer har potensial til å forstyrre Ca 2+ signaler blir tatt opp og / eller senere deponeres i intracellulære organeller, selv om laste forholdene som er beskrevet her er et godt utgangspunkt. Samlet, bildebehandling aktiviteten av lokale Ca 2+ hendelser er minimal invasiv, opprettholde den opprinnelige arkitekturen i en celle og cytosoliske faktorer som kan regulere de kanalene som ligger til grunn Ca 2 + mikroområder.
Protokollen vi beskriver her for høyoppløselig avbildning av lokale Ca 2+ signaler ved hjelp TIRF mikroskopi har den åpenbare begrensning i at det begrenser målinger til hendelser som oppstår fra Ca 2+ kanaler som ligger innenfor det flyktige feltet. Det er imidlertid ikke begrenset bare til kanaler i plasmamembranen, og vi demonstrere sin anvendbarhet til kanalene for eksempel IP 3 R i intracellulære organeller som er blitt funnet å være fortrinnsvis plassert i nærheten av plasmamembranen 12, menellers ville være utilgjengelig for elektrofysiologisk registrering av sin aktivitet i den innfødte cellulære miljøet. Konfokalt avbildnings ville muliggjøre avbildning av signaler generert dypere inn i cellen, men har ulemper i forhold til TIRF avbildning ved at tykkelsen på den optiske del er bredere (~ 800 nm vs 100 til 200 nm) og er begrenset i tidsmessig oppløsning av behovet å skanne konfokale spot (e). Fordi bildebehandling er gjort i en epi-fluorescens modus ved hjelp av en invertert mikroskop, kan optiske opptak av lokale og enkanals Ca 2 + signaler lett kombineres med samtidig elektrofysiologisk patch-clamp opptak.
Ved å uttrykke fluorescens Ca 2 + signaler som et forhold av hvil fluorescens (AF / F 0) er det mulig å oppnå en god relativt mål på signalamplituder. Men advarer vi at kalibrering av lokale, forbigående fluorescens endringer i absolutte Ca 2 + konsentrasjoner erikke hensiktsmessig. Gradientene for gratis [Ca 2+] og Ca 2+ -bundet indikator rundt en Ca 2+ utgivelse kanal eller klynge av kanaler er smalere enn det som kan løses ved optisk mikroskopi og vil dermed bli utvisket av punktspredefunksjonen av mikroskopet. Videre lokal [Ca 2+] i umiddelbar nærhet av kanalen pore vil endre seg på et mikrosekund tidsskala som kanalen åpnes og lukkes. Således fluorescenssignaler gir bare en uskarp (i rom og tid) representasjon av den virkelige Ca 2+ nanodomain underliggende lokale Ca 2 + 13 signaler.
Den algoritme som er beskrevet her i stor grad forenkler analysen av lokale Ca 2+ signaler fra kameraet basert avbildning. Ved å automatisere identifisering og analyse ikke bare er bruker skjevhet eliminert, men gigabyte med bildestakker kan behandles i løpet av minutter i en svært parallelt mote, noe som gir både tidsmessige og romlige data fra flere hendelser fraen enkelt-celle samtidig.
Selv om data i dette manuskriptet er presentert i sammenheng med IP 3-formidlet Ca 2+ signaler, kan de fremgangsmåter som er beskrevet lett kan utvides til å avbilde lokale endringer i cytosol [Ca2 +] som utgår fra tallrike typer av ligand-, andre messenger- og spenningsstyrte Ca 2+ -permeable ionekanaler. Den high-throughput arten av algoritmen for å automatisere identifisering og analyse av lokale Ca 2 + arrangementer bør også vise seg å være svært nyttig for avbilding av Ca 2 + kanalopatier i sykdomstilstander via enkeltcellemodeller slik som Alzheimers sykdom og autisme spektrum lidelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
